基因分型和生物膜的形成支原体hyopneumoniae以及它们与毒性的关系

支原体hyopneumoniae猪呼吸道疾病的病原体，显示出毒力的差异。然而，与这种变异相关的因素仍然未知。我们在此评估了毒力差异与基因型和表型(即生物膜形成能力)之间的关系。通过动物攻毒实验和体外气管粘膜感染试验，发现168l、RM48、XLW-2和J株毒力低，而232、7448、7422、168、NJ和LH株毒力高。然后对这10株已知毒力的毒株进行3个家政基因的多位点序列分型(MLST)、基于p146的基因分型和13个位点的多位点可变数串联重复序列分析(MLVA)分类。基于MLST和p146的基因分型将168、168 L、NJ和RM48鉴定为同一类型，并将它们聚在一个分支中。MLVA为每个菌株分配了不同的序列类型。Simpson多样性指数表明MLVA具有较高的歧视能力。但毒力与基因型之间无显著相关性。此外，我们还研究了毒力与生物膜形成能力的相关性。 The strains showing high virulence demonstrate strong biofilm formation ability, while attenuated strains show low biofilm formation ability. Pearson correlation analysis revealed a significant positive correlation between biofilm formation ability and virulence. To conclude, there was no association between virulence and our genotyping data, but virulence was found to be significantly associated with the biofilm formation ability ofm . hyopneumoniae．

猪支原体肺炎(MPS)的发病率呈上升趋势，给全球养猪业造成重大经济损失[1］．其致病作用不同支原体hyopneumoniae猪身上的菌株是可变的。然而，人们对造成这种差异的原因或因素知之甚少。在这项研究中，我们的目的是确定与变化相关的因素m . hyopneumoniae毒性。

动物挑战实验[2]，宿主细胞黏附[3.]，基因分型[4]，以及生物膜形成能力[5]已被用于评估毒力和致病性m . hyopneumoniae菌株。猪攻毒试验是毒力评估的金标准方法。的毒力特征m . hyopneumoniae菌株可以用体外模型评估，如猪气管粘膜。一些研究探索了两者之间的联系m . hyopneumoniae毒力和基因型。基因分型在流行病学调查和细菌鉴别中起着至关重要的作用。基因分型技术通常很容易执行，只需要最少的细菌负荷，结果很快就会产生[4］．多位点序列分型(MLST)、基于p146的基因分型和多位点可变数串联重复(VNTR)分析(MLVA)在细菌分子分型中越来越受欢迎[6]，考虑到它们可以验证优势基因型，分析进化关系，并揭示优势型的变异[7］．这些方法的应用，特别是MLVA，已报道用于评估毒力m . hyopneumoniae菌株。MLVA分型m . hyopneumoniae表明P97和其他粘连蛋白(包括P76、P146和P216)中串联氨基酸重复序列的数量与毒力之间存在关联[8，9］．Minion等人发现，在P97 R1中至少有8次AAKPV/E重复之前，纤毛粘附性并不显著[10］．相反，Stakenborg等人发现致病菌株P97 R1中只有两个AAKPV/E重复序列[11］．另一项研究表明，没有MLVA集群与m . hyopneumoniae毒性(12］．从这些相互矛盾的发现可以看出，基因型与毒力之间的关系m . hyopneumoniae仍然是有争议的。

一些研究表明，生物膜形成能力与细菌毒性之间存在关系[13］．生物膜是密集的表面相关细菌群落，它们保护细菌免受宿主免疫和抗菌剂的致命影响[14］．生物膜的形成在某些情况下是导致死亡的一个危险因素，而形成生物膜的能力现在已被广泛接受为与致病有关的主要毒性因素之一[15］．据报道，抑制毒力相关基因的表达与生物膜形成能力的减弱有关Stenotrophomonas maltophilia［16］．进一步，生物膜的形成能力Histophilus somni似乎有助于其在系统部位的持续存在[17］．另一项研究表明，降低毒力相关基因的表达可抑制免疫能力金黄色葡萄球菌形成生物膜[18］．然而，报道了不同的结果。能力的下降邻单胞菌属shigelloides感染Caco-2细胞的同时，形成生物膜的能力也增强了[19］．此外，一种毒株猪链球菌发现通过形成生物膜来降低其毒性，从而在体内建立持续感染[20.］．然而，关于生物膜与毒力差异之间关系的报道甚少m . hyopneumoniae菌株。

在此，我们首先进行猪攻毒实验，以评估毒力特征m . hyopneumoniae菌株。通过进行体外气管粘膜感染试验，进一步补充和重新评估结果。毒力、基因型与生物膜形成能力的关系m . hyopneumoniae随后进行了评估。通过MLST、基于p146的基因分型和MLVA评估基因型，然后进行系统发育分析。生物膜形成能力m . hyopneumoniae采用微量滴度板生物膜法(OD₅₇₀)．最后，分析了其毒力特征之间的关系m . hyopneumoniae并对基因型及生物膜与毒力的相关性进行了研究。

描述的m . hyopneumoniae毒性

m . hyopneumoniae菌株

m . hyopneumoniae菌株J为非致病性菌株，购自American Type Culture Collection [21］．商品化疫苗株168 L和RM48(减毒活疫苗株)分别购自中国南京JOFUNHWA生物技术公司和中国杭州浙江CEVA EBVAC生物技术公司。在猪MPS暴发期间，从猪肺组织中分离到168、NJ、XLW-2和LH 4株现场菌株。168株于1974年从中国甘肃省分离[22]， NJ、XLW-2和LH分别于2004年、2010年和2016年从中国江苏省分离得到。菌株168 L由菌株168经体外连续传代> 300获得[3.］．菌株232 [23]， 7448 [24]，及7422 [25]在世界范围内被认为是致病菌株。

用动物攻毒试验比较田间菌株的毒力

采用动物攻毒实验对菌株168 F115、168 L F335、NJ F41、XLW-2 F22和LH F10进行毒力评价和比较。对18只巴马小型猪的血清样本进行了检测m . hyopneumoniae使用商业抗体检测试剂盒(IDEXX HerdChek®)检测感染支原体hyopneumoniae抗体ELISA检测试剂盒，IDEXX Laboratories Inc.， Westbrook, ME, USA)。这些动物平均分布在六个不同的组中。来自不同组的猪被关在有金属板条地板和金属门边的单独围栏里，并给予水和不含抗生素的商业颗粒饲料。经气管刺激，5 mL 5 × 10⁸变色单位/mLm . hyopneumoniae使用了悬浮液。阴性对照组(NC)每头猪给予5 mL无菌KM2培养基。不同菌株挑战组和NC组被关在有独立通风系统的不同房间里。挑战后，每天早上由同一个人监测猪的临床症状，包括冷漠、食欲不振、咳嗽或喘息。这些动物在感染后28天被安乐死。尸检后，分别对肺各部位病理变化进行评分。肺部病变评分采用之前的方法，并进行了一些修改，以使评分差异更加明显[26]:无病变时，叶瓣评分为0分，0.5分0.1 ~ 12.5%，1分12.6 ~ 25%，1.5分25.1 ~ 37.5%，2分37.6 ~ 50%，2.5分50.1 ~ 62.5%，3分62.6 ~ 75%，3.5分75.1 ~ 87.5%，4分87.6 ~ 100%。然后计算每头猪的肺病理变化指数(最高28分)。此外，进行苏木精和伊红(HE)染色，以评估肺部的病理变化。实验与前面描述的一样，只做了微小的修改[27］．从每头猪健康组织和病变组织之间的1 mg肺组织中提取DNA，进行qPCR定量分析m . hyopneumoniae［28］．菌株毒力分析如下，高毒力菌株与阴性对照组有显著差异。低毒力菌株与阴性对照组差异不显著，但与高毒力菌株肺损害评分差异显著[29］．对宏观病变、临床体征及HE染色资料进行评估验证。所有实验流程均由中国江苏省农业科学院伦理与动物福利委员会批准[SYXK (Su) 2015-0019]。

评估菌株感染气管粘膜的能力

从健康猪身上无菌切除气管，浸泡在冷冻的Hanks平衡盐溶液中(HBSS, 14170112, Gibco, USA)。为了便于成像，软骨从气管环外边缘取出。将处理后的气管切成1 × 1 cm的薄片，HBSS冲洗三次，然后用rmi -1640 (31870082, Gibco, USA)在37°C和5% CO下孵育过夜₂以确保它们是无菌的[30.］．随后，J F14、168 F115、168 L F335、RM48 F792、NJ F41、XLW-2 F22、LH F10 (10⁸CCU, 1 mL)分别与气管粘膜在24孔板中孵育24 h, 37°C和5% CO₂．用RPMI-1640培养基培养的(即未感染的)为NC。孵卵后用HBSS冲洗气管黏膜三次，清除浮游细菌。实验一式三次。每个气管粘膜被切成相等的两部分。一部分固定在2.5%戊二醛中，在Zeiss EVO-LS10扫描电子显微镜(Zeiss, Germany)下检查，以评估纤毛上皮细胞表面的微形态变化，另一部分用于活/死细胞计数，以评估细胞活力。生活/死^®BacLight^™细菌活力试剂盒(美国赛默飞世尔科学公司)用于细胞荧光染色，根据制造商说明。制备的标本在美国PerkinElmer公司的UltraVIEW VoX激光扫描共聚焦显微镜下观察。细胞活力表现为红色与绿色的平均荧光强度(MFI)之比(R/G比)，它代表了死活粘膜上皮细胞的比例。为进一步评价毒力与体外气管黏膜感染试验结果是否具有统计学意义，采用IBM SPSS统计软件进行非条件logistic回归分析(v 18.0)。如果p单样本K-S检验计算的肺损害评分或R/G比值为> 0.05，认为肺损害评分或R/G比为正态分布，可进行Pearson相关分析。肺损害评分的Pearson相关系数(r)与r /G比> 0.8和p值< 0.01表示相关性极强[31］．

基因分型的m . hyopneumoniae菌株

基因分型方法

七种不同m . hyopneumoniae采用jf14、168 F115、168 L F335、RM48 F792、NJ F41、XLW-2 F22、LH F10进行基因分型。所有菌株经16s rDNA基因测序鉴定[32］．采用以下基因分型方法:33]，基于p146的基因分型[34]，及MLVA [35］．采用相同的PCR分析条件:94℃初始变性5 min, 94℃变性1 min, 48.6 ~ 60℃退火1 min, 72℃延伸45 s，循环40次。最后一步是在72°C下进行5 min1列出了三个MLST管家基因的引物、退火温度和反应体系组成(理应，rpoB,tpiA)、P146基因和13个MLVA位点。在TBE缓冲液(90 mM Tris, 90 mM硼酸盐和2.5 mM EDTA [pH = 8])中，用1%琼脂糖凝胶电泳对获得的扩增子进行评估。所有PCR扩增阳性产物均在未经事先纯化的情况下送去测序(GenScript，南京，中国)。为了保证重现性，分析进行了三次。从NCBI的全基因组数据中获得菌株232 (NC_006360.1)、7448 (NC_007332.1)和7422 (NC_021831.1)的相应序列。

基因分型方法的聚类和判别力分析

MLST可以通过索引核苷酸变异来分析菌株的克隆起源和它们之间的系统发育关系。三个管家基因的序列理应，rpoB,tpiA提交到MLST数据库。每个独特的基因序列被赋予一个等位基因编号，每个菌株的三个等位基因编号的组合定义了序列类型(ST) [33］．同样，根据P146基因测序结果，10株菌株在MLST数据库中均对应一个基于P146的基因型[34］．每种菌株的VNTR由扩增子中的重复数确定。使用bionnumeric®7.5(应用数学，比利时)分析三种基因分型方法产生的数据。采用分类系数定义相似程度，采用算术平均非加权对组法(UPGMA)作为聚类算法[36］．用得到的树状图和最小生成树验证了各品系间的亲缘关系。最小生成树使用一组描述菌株之间不同程度的成对距离，表示一组边(连接)，这些边(连接)以最短的可能距离连接节点(菌株)[37］．根据Hunter和Gaston描述的公式，采用Simpson多样性指数(Simpson index of diversity)来确定和比较三种基因分型方法的鉴别能力[38]:

D = Simpson多样性指数，N =样本总数，s =描述类型总数，nj =属于j型的菌株数。

生物膜的形成m . hyopneumoniae菌株

的能力m . hyopneumoniae利用Petrelli等人先前报道的方法对菌株形成生物膜进行了评估。[39]，略有改动。生物膜的培养开始于m . hyopneumoniae菌株达到10种⁸情事属实者/毫升。细菌培养物(200µL)放置于12孔玻璃底板(Costar, Corning Inc.， USA)，填充1800µL新鲜KM2培养基，随后在37℃静态条件下孵育1天。为延长生长时间，每天更换培养基。弃用上清液(1800 μ L)，加入相同体积的新鲜KM2培养基。生物膜形成在孵育1、2、3、4和5天后进行监测，如下所述。用2.5 mL无菌PBS轻洗三次以去除浮游细菌。生物膜用2.5 mL甲醇在室温下固定15分钟，用2.5 mL 1%结晶紫染色5分钟。用2.5 mL无菌PBS洗涤三次，在显微镜下观察形态变化(Zeiss Axio Vert, SY-04, Germany)，然后用2.5 mL 95%乙醇溶解10分钟，直到玻璃表面的结晶紫完全溶解。在570 nm (OD)处测定125 μ L洗脱液的吸光度₅₇₀) (BioTek ELx800;BioTek Instruments Inc.， Winooski, VT, USA)。实验分为3个重复，以未接种培养基为NC。

菌株毒力、基因型与生物膜形成能力的相关性分析

使用二元逻辑回归分析评估毒力相关因素，包括MLST确定的基因型、基于p146的基因分型和使用IBM SPSS统计软件的13个MLVA位点(v 23.0)。因变量通常是一个有值的虚拟变量。在毒力方面，0表示低毒力，1表示高毒力。此外，还采用Pearson相关分析评价生物膜形成能力与毒力之间的关系。微量平板生物膜测定(OD₅₇₀)测定生物膜形成能力。通过测定死活粘膜上皮细胞的比例(R/G比)来评估毒力。OD与₅₇₀R/G比的计算方法参考“评估菌株感染气管粘膜的能力”。

毒力评估m . hyopneumoniae菌株

一共有18个m . hyopneumoniae选择抗体阴性的巴马小型仔猪进行挑战(附加文件)1)．经过5次不同的挑战m . hyopneumoniae观察到不同的临床症状，包括冷漠、食欲不振、咳嗽和喘息(附加文件)2)．

解剖观察

猪在挑战后28天被安乐死。尸检后，对感染168株、NJ株和LH株的猪的肺进行解剖观察，发现典型的MPS病变，肺实变呈暗红紫色区域。肺部病变界限清晰。采用28点评价法对反映肺各部位病理改变程度(实变比例)的肺总病变进行评价(图1；表格2)．168攻毒组平均肺损害评分为10.5分，nj攻毒组为10.17分，lh攻毒组为12.33分，168 l攻毒组为0.33分，xlw -2攻毒组和NC组为0分。经统计分析，菌株168、NJ和LH的致病性明显强于菌株168 L和XLW-2。此外，菌株168l和XLW-2表现出低毒力或无毒力。

Pathohistological观察

目的:进一步探讨药物诱导的病理改变m . hyopneumoniae采用苏木精-伊红(HE)染色法分析感染动物和未感染动物的肺组织。如图所示2，与NC组比较，NJ-、168-、lh -攻毒组肺组织结构不清，肺泡壁增厚，提示发生肺炎。肺泡上皮细胞肿胀增生导致肺泡腔变小或闭塞，支气管腔变窄。此外，在lh挑战组中，经常观察到炎症和蜕膜上皮细胞的浸润。在168和nj挑战组中，观察到肺泡和支气管周围有充血或出血的迹象。NJ-、168-和lh -攻毒组肺泡上皮细胞增生较严重，几乎看不到肺泡结构。相比之下，168 L-和xlw -2刺激组未见明显的显微病变。定量分析m . hyopneumoniae结果表明，168株、NJ株和LH株的菌量均高于168 L株和XLW-2株2)．综上所述，动物攻毒实验表明，168、NJ和LH具有高毒力，而168 L和XLW-2具有低毒力(表2)2)．

的评估m . hyopneumoniae体外气管粘膜感染试验的毒力

进一步评价的毒力m . hyopneumoniae为了平行比较上述7株菌株的毒力，我们使用气管黏膜组织(图3.A)，这是第一个殖民地点m . hyopneumoniae．在与各种m . hyopneumoniae菌株培养24 h，扫描电镜显示m . hyopneumoniae细胞大多定植于纤毛的尖端，引起纤毛的紊乱和脱落m . hyopneumoniae引起气管黏膜上皮细胞毒性损伤(图3.B，图2)未感染的气管黏膜细胞表面完整，纤毛组织整齐(图2)3.B，面板1)。

为了进一步量化的有害影响m . hyopneumoniae菌株，我们染色m . hyopneumoniae在激光共聚焦显微镜下观察。细胞膜完整的细胞呈现荧光绿色，而细胞膜受损的细胞呈现荧光红色(图3.C，面板1-8)。如图所示3.C，图9，菌株LH, NJ和168孵育的细胞R/G比显著高于其他菌株，说明细胞损伤严重。菌株J、168 L、XLW-2和RM48对细胞死亡的影响较小，说明菌株LH、NJ和168对细胞活力的降低程度高于菌株J、168 L、XLW-2和RM48。说明菌株LH、NJ和168的毒力高于菌株J、168 L、XLW-2和RM48。表格3.显示了所有10种毒力的综合分析m . hyopneumoniae菌株。动物攻毒实验与体外气管黏膜感染试验结果一致。用Pearson相关分析进一步评价168、168 L、LH、NJ和XLW-2菌株体外气管粘膜感染试验结果与动物攻毒实验测定的毒力之间的相关性。肺损害评分与r /G比值的r值为0.971 (p< 0.01)，表明相关性强(附加文件3.)．

MLST, p146基因分型，MLVA

3个MLST管家基因的引物PCR扩增结果(理应，rpoB,tpiA)、P146基因和菌株J、168、168 L、NJ、XLW-2、LH、RM48的13个MLVA位点进行琼脂糖凝胶电泳。如图所示4，观察到代表不同大小扩增子的特定波段。引物具有良好的特异性。扩增子随后进行测序(附加文件4)，利用测序数据进行MLST分析。如图所示5A和C，每个独特的基因序列被赋予一个等位基因号，根据MLST数据库也确认了每个菌株定义ST. p146基基因型的3个等位基因号的组合，并从NCBI获得相应的国际参考菌株(232、7448和7422)的DNA序列。最后，将10株菌株分为7种不同的ST型、7种基于p146的基因型和10种MLVA型。值得注意的是，菌株168、168 L、NJ和RM48属于同一ST株，即ST61和相同的p146基基因型，即75。

MLST、p146基因分型和MLVA数据的聚类分析

NCBI序列和3个MLST管家基因测序数据(理应，rpoB,tpiA使用bionumics®对菌株J、168、168 L、NJ、XLW-2、LH、RM48、232、7448和7422进行分析。我们进行了UPGMA聚类分析、树状图构建和最小生成树分析。如图所示5A，根据MLST数据库分析，菌株RM48、168 L、168和NJ(中国分离株)聚在一个分支上，与菌株XLW-2和LH(中国分离株)的亲缘关系比与菌株232、7422、7448和J(美洲分离株)的亲缘关系更近，具有明显的地理差异(表2)3.)．基于p146的基因分型数据进一步验证了这一结果。最小生成树是分子流行病学研究中常用的估计分离株间关系的方法。图中所示的不同节点颜色5B代表7种不同的ST/ p146基基因型。4株菌株(168、168 L、NJ和RM48)表现出相同的ST/ p146基因型(绿色节点)，而其余6株则聚为不同的ST/ p146基因型。菌株RM48、168 L、168和NJ与菌株XLW-2、232和LH的相似性高于菌株J和7422，而与菌株7448的相似性最大。

VNTR因基因座和品系不同而不同。如附加文件所示4和图5C，基因位点P97 R1、P146 R3和P216 R1重复数变异显著。根据mlva衍生的树状图，有两个相关性< 30%的主要聚类(图5C).菌株168和168l出现在一个分支，亲缘关系密切，仅在P146 R1的VNTR中发现变异。虽然菌株168和168 L中P146R1的VNTR相同，但菌株168 L和168的特异性重复区域分别为“QPQ”和“PQ”(附加文件)4)．这可以解释为，菌株168l是一个高传代，减毒菌株源于致病菌株168。菌株NJ、RM48、168 L和168聚在一起，同源性约80%。第二组包括LH、7448、232和XLW-2，显示出30-50%的相关性。通过MLVA谱图和最小生成树进一步明确了各菌株之间的遗传关系(图5D).菌株168 L、168、NJ和RM48具有相同的p146基基因型和相同的ST，与其他6株菌株差异显著。

不同基因分型方法的判别力分析

采用Simpson多样性指数对三种基因分型方法进行鉴别力分析。通过MLST和p146分型，将10株菌株分成7个聚类。基于MLST和p146基因分型的Simpson多样性指数为0.867。共鉴定出10种MLVA类型。所有菌株经MLVA鉴定均可分型。MLVA的Simpson多样性指数高达0.978，高于基于MLST和p146基因分型的Simpson多样性指数，具有较高的鉴别能力。

分析基因分型与毒力的相关性

基于MLST和p146基因分型，将菌株RM48、168 L、168和NJ归属于同一st，但菌株RM48和168 L的毒力较低，而168和NJ的毒力较高。菌株XLW-2(低毒力)和LH(高毒力)与上述4株菌株密切相关。采用二元logistic回归分析来阐明不同基因分型分析与m . hyopneumoniae毒性。基于MLST和p146的基因分型数据均未显示10株菌株的毒力有显著差异(p> 0.05)4)．经MLVA分析，弱毒菌株168 L与毒力菌株168具有密切的亲缘关系。弱毒菌株RM48和强毒菌株NJ与菌株168和168的亲缘关系较近，LH和232均为强毒菌株，而与强毒菌株168和NJ的亲缘关系较远。值得注意的是，基于二元logistic回归分析，10株病毒毒力的差异与MLST、基于p146的基因分型或MLVA谱(p> 0.05)4)．

毒力与生物膜形成能力的相关性分析

为了尽量减少我们对动物挑战实验的依赖，这些实验昂贵、复杂且耗时，我们进一步评估了7种病毒的毒性m . hyopneumoniae通过确定菌株的毒力和形成生物膜的能力之间的相关性。为了了解生物膜形成的模式，我们随机选择了高毒力m . hyopneumoniae新泽西。结晶紫染色后，从播种第一天开始观察到细菌吸附和单菌落形成。培养第2天，菌落数量逐渐增加。培养3 ~ 4 d后菌落聚集形成粘液样菌落，生物膜厚度增加。培养第五天，部分生物膜开始消散。因此，确定生物膜的最佳培养时间为3 ~ 4天左右(图6f)。

培养4天后评估更多菌株的成熟生物膜。7株菌株(168、168 L、NJ、XLW-2、RM48、J和LH)均能形成生物膜，OD平均₅₇₀为0.107±0.005 ~ 0.633±0.0046强毒菌株168、NJ和LH具有较强的生物膜形成能力，而弱毒菌株J、168 L、XLW-2和RM48的生物膜形成能力相对较弱。生物膜形成能力，以OD表示₅₇₀的R/G比m . hyopneumoniae菌株分析采用单样品K-S检验。这两个变量正态分布(p> 0.05)，可以用Pearson相关分析(附加文件5)．OD570与r /G比之间的r值为0.987 (p< 0.001)，即> 0.8，因此表明相关性极强(图6H).因此，测试了七种病毒的毒力特征m . hyopneumoniae菌株与其生物膜形成能力高度相关。

支原体hyopneumoniae菌株在猪的致病效果上有很大差异。然而，关于导致毒力差异的因素知之甚少。在此，我们旨在确定与毒力变化相关的因素m . hyopneumoniae菌株。首先，确定了一组毒力特征m . hyopneumoniae通过动物攻毒实验鉴定菌株，并通过体外气管粘膜感染试验对结果进行补充和重新评估。

动物攻毒实验证实，菌株168、NJ和LH具有高毒力，菌株168 L和XLW-2具有低毒力。然而，在动物中观察到个体多样性。其他研究也强调了这一点，这意味着许多因素会影响动物挑战实验的结果[40］．此外，动物挑战实验与动物福利有关，而且它们耗时、复杂且昂贵。在不涉及动物的情况下综合评价部分菌株的毒力，并平行比较更多菌株的毒力特征m . hyopneumoniae我们建立了猪气管粘膜感染模型。m . hyopneumoniae-感染的气管显著增加了气管纤毛损伤水平。细胞活力测定定量细胞损伤;不同菌株引起的细胞死亡程度由高到低依次为:LH、NJ、168、J、168 L、XLW-2、RM48。造成的损害程度m . hyopneumoniae对离体气管黏膜的影响与动物挑战实验中观察到的相似，表明该方法与m . hyopneumoniae毒性。然而，还需要进行更多的研究，包括猪的实验性感染，以验证我们的初步发现。

为了确认本研究中所用菌株的毒力，我们研究了毒力、基因型和生物膜形成能力之间的关系。m . hyopneumoniae菌株表现出高基因多态性[4，37］．m . hyopneumoniae菌株主要通过MLST、p146分型和MLVA三种基因型方法进行分化。Mayor等人分析了54m . hyopneumoniae采用基于p146的基因分型和MLST对样本进行分析，发现MLST具有更强的鉴别能力[33］．Kuhnert等研究了34个肺样本，报道p146基因分型显示出更好的分类能力[41］．然而，在本研究中，基于MLST和p146的基因分型允许相同的分离株聚类。因此，使用这些分型方法的组合可能不会增加识别能力;它们的效果可能是特定于某些菌株的。此外，菌株RM48、168 L、168和NJ具有相同的基因型(ST61)，但毒力存在差异:168和NJ具有高毒力，而RM48和168 L具有低毒力。基于MLST和p146的基因分型结果显示，高毒菌株NJ和LH与弱毒菌株XLW-2和RM48之间关系密切。因此，在本研究中，我们观察到基于MLST和p146的基因分型与毒力数据之间缺乏相关性。然而，我们认为这种相关性的缺乏在某种程度上可归因于本研究中使用的方法，而不是由于缺乏实际差异。例如，168和168 L具有相似的基因型。但168 L的毒力减弱可能是因为168 L是168的高传代菌株。 These strains show differences in virulence due to differences in genes, but detecting such differences with the methods used in this study is challenging because the three genotyping methods are limited to partial identification of specific genes.

为了区分菌株，我们选择了P97、P146和P216的13个位点进行MLVA分型，因为它们是关键的粘附因子m . hyopneumoniae．基于我们的分析，我们认为P97 R1, P146 R1, P146 R3和P216 R1基因可以优先用于临床样本的特征，因为它们表现出比其他基因更高的辨别能力。然而，在毒力强的菌株之间，如168和NJ，以及高毒力和低毒力菌株之间，重复次数存在差异。在疫苗株168 L和RM48中，P97 R1重复区分别含有11个和17个重复;毒力菌株168和NJ的同一区域重复序列分别为11和17个，毒力菌株232和LH的同一区域重复序列分别为15和12个。我们的结果表明m . hyopneumoniae毒力与P97 R1区域重复数无相关性。此外，毒力与P216和P146基因中的氨基酸重复序列难以关联。Logistic回归分析表明，本研究检测菌株的毒力与MLVA分型之间无显著相关性。

菌株232 [42， j [43]， 7448 [24]，及7422 [25]是从美国、英国和巴西的受感染猪身上分离出来的。根据基因分型数据，从中国分离的菌株的起源似乎与从美国、英国和巴西分离的菌株不同。MLVA分型有助于阐明毒株之间的系统发育关系，但对阐明毒力没有帮助，因此有助于流行病学调查和追踪疫情起源。迄今为止，尚未发现本研究纳入的10株病毒的基因型与毒力特征之间存在关联。这可以通过评估更多的位点或更多的毒力相关基因来解决[3.］．此外，研究更多不同地理来源的毒株或野生猪与家猪的毒株，可以更好地了解基因型与毒力特征之间的相关性。我们认为，要阐明基因型和毒力之间的相关性，全基因组测序等技术可以被证明是非常有用的，也可以产生比基于p146的基因分型、MLST或MLVA更多的信息。

生物膜是与多种病原体发病机制相关的主要毒力特征之一[15，44］．形成生物膜的微生物种类繁多，从非致病性物种到兼性致病性物种不等，具有不同的毒力潜力[45］．生物膜形成能力与毒力之间的关系继续被广泛研究。据报道，不同菌株的生物膜形成能力存在显著差异[46］．然而，到目前为止，关于这一主题的研究还很少。m . hyopneumoniae显示了形成生物膜的能力[47］．结晶紫染色显示，高毒菌株168、NJ和LH具有较强的生物被膜形成能力，而弱毒菌株J、XLW-2、168 L和RM48的生物被膜形成能力较低。Pearson相关分析表明，毒力特性与生物膜形成能力之间具有极强的相关性m . hyopneumoniae．因此，我们认为菌株毒力的差异可能与其生物膜形成能力有关。未来的研究应评估更多的菌株，以验证生物膜形成能力和毒性之间的相关性。此外，我们需要加强对可能与各种菌株生物膜形成能力有关的毒力基因的了解。

江苏省农业科技创新基金项目(CX(20)3090)和国家自然科学基金项目(no . 32172860, 32102675, 31770193)资助。感谢江苏省农业科学院中心实验室的王春梅、王彤和徐存发，以及南京农业大学兽医学院的石志宇对共聚焦激光扫描显微镜技术的支持。

作者指出

1. 吴宇子和俞燕飞对这项工作做出了同样的贡献

作者及隶属关系

1. 江苏省农业科学院兽医研究所，农业农村部兽医生物工程与技术重点实验室，南京

   吴宇子，于燕飞，华立忠，魏燕娜，甘源，谢兴，王佳，刘茂军，邵国庆，熊启燕，冯志新

2. 江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江

   于燕飞，刘茂军，邵国清

3. 南京农业大学动物医学院，南京

   于燕飞，谢兴，刘茂军，邵国庆，熊启燕，冯志新

4. 夸祖鲁-纳塔尔大学生命科学学院微生物学科，南非德班

   韦雅娜，Hafizah Yousuf Chenia和王佳

5. 英国华威大学，考文垂，CV4 7AL

   一轩王

6. 江苏大学生命科学学院，江苏镇江

   Qiyan熊

7. 江苏农林职业学院畜牧兽医学院，句容

   Lizhong华

贡献

YWu做了大部分实验。YY准备了手稿。LH和YG进行动物实验。YWei、JW和XX提供多种支原体菌株。YWang帮助进行统计分析。HC, ML, GS, QX和ZF监督工作。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Qiyan熊或冯主任朱之鑫．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限