外泌体的作用来源于旋毛虫感染幼虫对肠上皮屏障功能的影响

肌肉幼虫旋毛虫寄生于寄主肠上皮。外泌体参与入侵的机制t . spiralis肌肉幼虫不清楚。因此，本研究的目的是探讨外泌体的作用t . spiralis感染幼虫(TsExos)对猪小肠上皮细胞屏障功能(IPEC-J2)的影响。首先,Ts成功获得外显子，并证实其被上皮细胞摄取。此外，通过CCK8试剂盒确定了最佳诱导条件，暴露量为150 μg/mLTsExos作用12/24 h后，IPEC-J2细胞活力降低30%。基于这个结果，对Ts研究了外显子在细胞生物学过程和紧密连接中的作用。共孵育后TsExos和IPEC-J2细胞，结果显示fitc -葡聚糖含量、乳酸脱氢酶(LDH)和活性氧(ROS)水平显著升高。细胞凋亡率增加12.57%，出现核固缩和核破裂。诱导细胞后TsExos中，IL-1表达上调，IL-10、TGF-β、TLR-5、MUC-1、MUC-2表达下调。TsExo诱导也导致ZO-1、CLDN-3和OCLN水平降低。总之,Ts外显子参与多种细胞生物学过程，它们通过破坏生理和生化过程、过度激活先天免疫和破坏紧密连接发挥作用。

旋毛虫是一种在世界范围内发现的人畜共患寄生虫病吗[1]。在肠感染阶段t . spiralis，它通过感应合适的配体侵入多个细胞[2]。侵袭过程随后可导致细胞膜破裂和细胞质破坏，从而诱导细胞凋亡并引起膜通透性改变[3.,4]。此外，为了抵抗入侵t . spiralis，宿主激活自身免疫系统;然而，它的过度反应可能对宿主本身有害[3.]。

最近的研究报告称，大多数寄生虫都能分泌外泌体，这些外泌体可以在被摄入后将它们的货物运送到宿主细胞中[5,6,7,8,9]。来源于寄生虫的外泌体转移到宿主细胞后，可通过调节宿主细胞增殖、细胞信号通路和基因表达，为寄生虫免疫逃逸创造有利的微环境[10,11]。

Song等人发现，鸡的排泄/分泌蛋白(esp)中存在丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶t . spiralis通过降解紧密连接蛋白破坏肠上皮完整性，并在t . spiralis在宿主体内的入侵、生长和存活[12]。外泌体作为ESPs的重要组成部分，参与许多生物学功能的调控;然而，它们在调节宿主肠上皮细胞功能中的作用t . spiralis感染情况尚不清楚。因此，本研究的目的是探讨外泌体的作用t . spiralis肌肉幼虫(TsExos)对肠上皮细胞侵袭时屏障功能的影响t . spiralis以促进其寄生过程。本研究的结果将为探索入侵过程提供有益的见解。

动物、寄生虫和细胞培养

6 ~ 8周龄雌性KM小鼠购自哈尔滨医科大学。所有动物饲养和实验程序均按《中国动物管理条例》执行，动物实验标准经东北农业大学动物管理委员会批准。所有小鼠自由进食和饮水，保持在SPF条件下，湿度为70±10%，温度为20±2℃。

旋毛虫(菌株ISS533)在KM小鼠中培养，并按照先前描述的标准方法从感染KM小鼠的肌肉中分离肌肉幼虫(ML) [13]。

猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)由哈尔滨兽医研究所捐赠，用90% DMEM (Meilunbio，中国)、10%胎牛血清(FBS, PAN，德国)和1% 100 U/mL青霉素/链霉素(Solarbio，中国)培养。

分离鉴定Ts挂式

旋毛虫从小鼠肌肉中采集ML^th然后在RPMI-1640培养基(Meilunbio, China)中添加1% 100 U/mL青霉素/链霉素，在37℃、5% CO条件下培养₂48 h。采用Wei等人的超离心方法收集培养上清中分泌的外泌体。14]。的浓度TsExos采用BCA蛋白检测试剂盒(Meilunbio, China)检测。外泌体的形状通过透射电子显微镜(TEM)观察(日立，日本)。的大小Ts使用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA) (NanoFCM)测量Exos。的特异性标记CD63Ts蛋白印迹法测定Exos。

吸收TsIPEC-J2细胞的Exos

验证…的内化TsIPEC-J2细胞的外显子，我们将细胞接种在24孔板上(大约1 × 10⁵用先进的DMEM在37℃、5% CO条件下培养₂12小时TsExos (300 μg/mL)和PBS(对照)使用Liu等人描述的PKH26试剂盒(Aidisheng, China)进行标记。[15]，其中外泌体被标记为红色。贴上标签的TsExos与IPEC-J2细胞孵育6、12、18和24小时。之后，细胞用4%多聚甲醛(Biosharp，中国)固定，用PBS洗涤，用0.25% Triton X-100 (Biofroxx，德国)渗透，并用10% DAPI (Solarbio，中国)染色。用荧光显微镜检查细胞，并捕获图像(Syngene, USA)。

确定了最佳反应浓度与摄取时间之间的关系TsExos和IPEC-J2细胞

使用CCK-8试剂盒(Meilunbio, China)检测细胞活力，如前所述[16]。简单地说，细胞接种于96孔板(约1 × 10^3.每孔细胞)，并在上述相同条件下培养。Ts将Exos(20、50、100、150、200、300 μg/mL)或PBS分别与IPEC-J2细胞共培养3、6、12、24、48 h，然后在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养板上孵育2 h，使用美国BioTek公司的平板仪测定450 nm处吸光度。

渗透率测量

通过fitc -葡聚糖法测定IPEC-J2细胞单层的通透性(40 kDa, Yuanyebio, China) [17]。细胞接种于孔径为0.4 μm的Transwell腔室(Labselect, China)，以5 × 10的密度置于6孔板中⁵细胞/。细胞在培养基中培养至完全分化。然后,Ts将Exos (150 μg/mL)分别添加到细胞中3、6、12、18和24小时。将fitc -葡聚糖(5 mg/mL)添加到Transwell插入物的顶端室中5小时。随后，将基侧培养基(不含FBS)收集到黑色CellCarrier-96微孔板(PerkinElmer, USA)中，使用微孔板读取器(Tecan, Switzerland)在493 nm激发和517 nm发射波长下测量荧光。

实时定量PCR

采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测IPECs中基因的相对表达量。各检测基因引物序列见表1．细胞制备及处理同上。使用总RNA提取试剂盒(Solarbio, China)从ipec中提取总RNA。用primer Script从总RNA合成cDNA后^圣链cDNA合成试剂盒(TaKaRa，日本)，rt - qpcr使用罗氏光循环480系统。计算结果采用2^−∆∆Ct方法(18]。

西方墨点法

用RIPA裂解缓冲液和1% PMSF (Solarbio, China)提取IPEC-J2细胞总蛋白，每孔裂解缓冲液的比例为150-250 μL。用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度。用5 × SDS-PAGE样品上样缓冲液(Biosharp, China)煮沸，SDS-PAGE分离。将蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯过滤膜(Millipore, USA)上。将膜置于阻断缓冲液(5%脱脂乳)中，室温下放置2小时。随后，用合适的一抗溶液(Wanleibio, China;bios,中国;ab克隆(美国)在4°C下过夜。用PBST洗涤三次后，分别用辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗(ab克隆，美国)孵育，在室温下用5%脱脂牛奶(1:5000)稀释2小时。最后，使用超灵敏ECL化学发光试剂(Meilunbio, China)进行印迹，并暴露膜。 The bands were quantified using a chemiluminescence imaging system (Syngene, USA) and analysed with ImageJ.

细胞免疫荧光法

感应后TsExos，用PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛固定30分钟，然后用0.25% Triton X-100渗透10分钟。用2%牛血清白蛋白在室温下阻断30分钟。之后，用PBS冲洗细胞，用抗ZO-1(1:300)、CLDN-3(1:300)和OCLN(1:300)的一抗在4°C下孵育过夜。随后，用PBS冲洗孔三次，并用fitc标记的二抗(1:30 00,Bioss，中国)在室温黑暗中孵育1小时。然后用2 μg/mL DAPI染色细胞核，在黑暗环境下染色8min。最后在荧光显微镜下观察细胞。

检测细胞毒性、氧化应激和细胞凋亡

诱导的细胞毒性Ts使用LDH检测试剂盒(Beyotime，中国)通过乳酸脱氢酶(LDH)渗漏到培养基中来评估Exos。首先，ipec在不同孔的培养皿中培养12 h。Ts用150 μg/mL的Exos或PBS诱导细胞12、24 hTs根据说明书用LDH检测试剂盒检测外显子的细胞毒性。此外，根据活性氧测定试剂盒(Meilunbio, China)的技术手册，通过测量488 nm激发波长和525 nm发射波长的荧光以及在荧光显微镜下观察荧光来检测氧化应激水平。采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(Meilunbio, China)流式细胞仪检测凋亡细胞，经PI和FITC染色的细胞为凋亡细胞。Hoechst 33258 (Leagene, China)染色证实细胞凋亡，并观察蓝色荧光强度[19]。此外，采用Western blotting检测凋亡基因(Bax, Bcl-2，购于中国万莱生物公司)的表达(方法见“西方墨点法”)。

统计分析

所有数据均以平均值±SD表示。使用GraphPad Prism 5进行统计分析。采用ImageJ软件对波段强度进行量化。采用SPSS 22软件进行单因素方差分析(ANOVA)。P< 0.05认为有统计学意义。

描述的Ts外显子和ipec的摄取

探讨外泌体的作用来源于t . spiralis肌肉幼虫(Ts外泌体)在肠上皮屏障上，我们从t . spiralis采用经典的超离心方法。TEM和NTA显示圆形和典型的杯状外泌体，如先前报道的[20.]，大多数膜结构尺寸在60至120纳米之间(图2)1Western blot分析证实特异性标记蛋白CD63的存在(图3)1C).综上所述，这些结果表明成功获得了Ts挂式。然后，确定是否Ts外显子被ipec占用，我们孵育pkh26标记TsIPEC-J2细胞的外显子。如图所示1D、生理状态下;Ts外泌体在6 h时被上皮细胞显著内吞，摄入的外泌体数量呈明显的时间依赖性增加，特别是在24 h时，表明外泌体可以进入IPEC-J2细胞。

TsExos影响ipec的增殖

的影响TsCCK8检测试剂盒检测外显子对细胞增殖的影响。结果表明，暴露于20 μg/mL的细胞TsExos的增殖没有变化(P> 0.05)。但细胞活力明显降低(P< 0.001)时TsExos≥100 μg/mL。当ipec与TsExos作用3、6 h时，细胞活力曲线随浓度的增加呈下降趋势，而诱导12、24 h时，细胞增殖曲线呈明显下降趋势。此外，在48 h时间点，对细胞增殖没有影响，表明外泌体已经降解(图2)2）.因此，150µg/mLTs选择Exos作为后续实验的工作浓度，与细胞共培养12或24 h，使细胞增殖率降低30%。

的影响Tsipec生理生化状态的外显子

基于的结果Ts外显子对细胞增殖的影响Ts外显子对细胞通透性、细胞毒性、氧化应激和凋亡的影响。首先，为了评估单层细胞的细胞通透性，我们使用多功能微孔板阅读器测量了fitc标记的葡聚糖。实验表明，经过孵育Ts与ipec作用12 h后，fitc -葡聚糖的荧光强度较对照显著增加(P< 0.001)， fitc -葡聚糖含量随时间持续增加(图2)3.此外，我们分析了……的影响Ts通过在490 nm处测定乳酸脱氢酶(LDH)水平来观察细胞毒性。结果表明，两者之间没有差异。P> 0.05)，但共孵育24 h后LDH含量明显升高(图2)3.B)。随后，通过荧光微孔板阅读器和荧光显微镜测量ROS水平来估计氧化应激。如图所示3.C和D，两种方法均表明荧光强度在24 h (P< 0.001;P< 0.01)，与对照组比较差异无统计学意义(P用酶标仪测定12 h荧光强度时，细胞处理组与细胞对照组之间的差异为> 0.05);然而，一个显著的差异(P荧光显微镜下观察到< 0.01)。

最后，影响Ts采用流式细胞仪、Hoechst 33258染色和Western blotting检测细胞凋亡的外显子。结果表明，暴露12 h和24 h诱导的早期和晚期细胞凋亡率均高于对照组TsExos分别是对照组的1.8倍和3.2倍(图2)3.E)。此外，Hoechst 33258检测细胞凋亡的结果与FCM结果一致，这也验证了Ts与对照组相比，Exos显著诱导ipec细胞凋亡(图2)3.F)。采用Western blotting检测促凋亡(Bax)和抗凋亡(Bcl-2)蛋白的表达，并通过ImageJ软件分析各条带的灰色值(图2)3.G)。同样，12 h时Bax蛋白表达量显著高于对照组(P< 0.001)，而Bcl-2蛋白表达量显著低于对照组(P< 0.001)。

的影响Ts外显子对ipec先天免疫的影响

分析…的影响Ts我们检测了ipec产生的细胞因子、toll样受体和粘蛋白的转录和蛋白水平。采用RT-qPCR分析IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β转录水平的变化，结果显示IL-1β的生成明显增加，而细胞因子IL-10和TGF-β均明显降低(图2)4A).为了进一步证实ipec产生的细胞因子的变化，我们采用Western blotting检测不同组IL-1β、IL-10和TGF-β的表达。Western blotting结果与RT-qPCR结果一致(图2)4B)，这表明ipec诱导后IL-1β上调，IL-10和TGF-β均下调TsExos证明了这一点TsExos可以促进细胞炎症。

此外，我们使用RT-qPCR检测了ipec中toll样受体(TLR1, TLR2, TLR4, TLR5)的mRNA水平。结果表明，24 h时只有TLR5的转录水平明显高于对照组(P< 0.01)4C)。与对照组相比，TLR5蛋白水平在24 h时也显著降低(P< 0.001)(图4D)。

我们继续通过RT-qPCR检测ipec中粘蛋白(MUC1和MUC2)的转录水平。如图4E显示，MUC1和MUC2 mRNA水平显著降低(P< 0.05;P< 0.01)TsExos和ipec共培养24 h(图2)4E)。此外，Western blotting检测MUC1和MUC2的蛋白表达与RT-qPCR结果一致(图2)4F)，表明TsExos可诱导ipec中粘蛋白的低表达。

的影响Tsipec紧密连接上的外显子

评价评价…的效果Ts在ipec紧密连接上的外显子，我们测定了ipec中紧密连接相关蛋白的转录和蛋白水平。首先，我们使用RT-qPCR分析了不同紧密连接相关基因(ZO-1、ZO-2、CLDN-3和Occludin)的转录水平变化。结果如图所示5一个。Ts与对照组相比，Exos显著降低了ZO-1、CLDN-3和Occludin的转录水平(P< 0.01,P< 0.05,P< 0.05)， 24 h mRNA的相对表达量明显下降TsExos未引起ZO-2转录水平的显著变化(P> 0.05)。随后，我们使用Western blotting和免疫荧光进一步验证RT-qPCR结果。Western blotting结果显示，与对照组相比，12 h时ZO-1和CLDN-3的表达水平显著降低(P< 0.001;P< 0.01)TsExos导致CLDN-3在24 h时低表达。我们还观察到，与对照组相比，Occludin的表达在12 h时显著上调(P< 0.01)，与RT-qPCR检测结果比较;但在24 h时，Occludin的表达水平明显低于对照组(P< 0.001)。ZO-2蛋白表达未见变化，与RT-qPCR结果一致(图2)5B).此外，免疫荧光结果显示与Western blotting相同的趋势，表明TsExos通过降低ZO-1、CLDN-3和Occludin的表达影响ipec的紧密连接(图2)5C)。

肠上皮细胞是抵抗肠道内抗原、毒素和有害物质的第一道防线，既是物理屏障，也是肠黏膜免疫的参与者[21]。因此，细胞活力与细胞毒性、损伤、凋亡和炎症反应之间的平衡是维持上皮细胞正常屏障功能的关键[22]。源自肌肉幼虫t . spiralis被寄主摄食后，被释放到肠道内，完成其入侵、定植、繁殖等生命周期阶段。最近的研究表明，来自各种寄生虫的外泌体在信息交换、与宿主细胞相互作用和避免免疫排斥方面发挥着重要作用[23,24,25,26]。因此，探索外泌体的分泌机制t . spiralis在其入侵过程中对旋毛虫病的防治具有重要意义。

在本研究中，IPEC-J2细胞用不同浓度的Ts结果表明，随着浓度和时间的增加，细胞增殖能力下降，但在48 h时细胞活力没有差异。最后，我们选择150µg/mLTsExos作为后续实验和共培养的工作浓度TsExos与细胞作用12或24小时，使细胞增殖率降低30%。Liang等。[27结果表明，100、150和200 μg/mL的外泌体刺激48 h后，左旋细胞的活力显著降低t . asiatica成虫，这与浓度一致TsExos在我们的研究中，但诱导时间不同。

研究发现，细胞外囊泡来自寄生虫小束gigantica与人肝内胆道上皮细胞活性氧水平升高有关，并诱导自噬和DNA损伤及修复过程[28]。Lisette等。[29[3]结果表明，与黄曲霉Pan4菌株的锥乳线虫细胞外囊泡孵育的细胞t·克鲁兹它在宿主细胞中诱导了许多变化，包括细胞通透性的变化和细胞内钙水平的提高^２＋．因此，我们进行了一系列的实验来研究是否TsExos还影响肠上皮细胞的生理生化过程。基于…的影响Ts外泌体对肠上皮细胞增殖的影响，本研究探讨了外泌体对肠上皮细胞屏障功能的影响，包括渗透性、细胞毒性、氧化应激和凋亡。结果表明:Tsipec摄取外显子可导致一系列变化，如通透性增加、细胞毒性和氧化应激水平升高、细胞凋亡异常以及细胞反应调节。

上皮细胞的紧密连接是维持屏障功能和正常生理状态的基础，紧密连接的中断可显著改变细胞的通透性，使病原体容易侵入机体，这是许多病理状态的标志。随着进一步的研究，更多的细胞因子(炎症因子、趋化因子、肿瘤坏死因子)已在各种体内和体外研究中被证明影响紧密连接，并已被证明调节人体的内稳态和应激反应[30.,31]。此外，早期研究表明，不同的tlr参与致病性感染过程中紧密连接的调节，在维持肠上皮屏障的完整性方面发挥重要作用[32]。粘蛋白在完整肠粘膜屏障中的比例保持平衡。肠道一旦被病原体感染，就会影响粘蛋白的表达和分布[33]。因此，我们进一步研究了Ts外显子对ipec先天免疫的影响。这项研究发现TsExos可诱导IPEC-J2细胞IL-1上调，IL-10和TGF-α下调，促进炎症反应。TLR5的表达明显降低，提示TsExos通过影响TLR5的表达调节上皮细胞的屏障功能。在本实验中，MUC-1和MUC-2的表达水平较低，这可能与寄生虫在宿主攻击下的存活有关。

细胞的紧密连接是维持上皮屏障功能和完整性的关键，而这主要依赖于紧密连接蛋白[34]。在本研究中，IPEC-J2细胞由Ts结果显示，ZO-1、CLDN-3、Occludin的表达水平显著下调，说明TsExos影响ipec的紧密连接。一项研究(2021)表明，ES抗原中的丝氨酸蛋白酶t . spiralis通过MAPK信号通路降低Caco2细胞中紧密连接蛋白的表达[35]，这与……的效果相似Ts在我们的研究中紧密连接蛋白的外显子。

总之,TsExos进入IPEC-J2细胞后参与细胞各种生命活动的调控。TsExos可降低细胞活力，提高细胞通透性，引起细胞损伤，引起过度氧化应激，引起异常凋亡。此外,TsExos促进细胞的炎症反应，影响toll样受体介导的信号转导，破坏细胞黏液防御系统和细胞的紧密连接。因此，外泌体在细胞凋亡过程中起着重要的作用t . spiralis入侵宿主。

本研究中使用或分析的数据集可按合理要求从通讯作者处获得。

我们感谢所有提供实验室协助的工作人员。

国家自然科学基金项目(31372427)和畜禽疫病病原生物学国家重点实验室发展基金项目(SKLVEB2019KFKT011)资助。

作者指出

1. 王瑞彪和张玉恒对这项工作也作出了同样的贡献

作者及单位

1. 东北农业大学动物医学院，黑龙江省人畜共患病重点实验室，哈尔滨长江街600号，150030

   王瑞彪，张玉恒，甄敬波，张金鹏，庞子轩，宋学伟，林立豪，孙峰，陆艺新

贡献

YL设计了这项研究。RW, YZ, J Zhen, J Zhang, ZP, XS, LL和FS进行了实验。YL和RW起草并修改了稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到鑫陆．

伦理批准并同意参与

实验经哈尔滨医科大学动物伦理委员会批准，按照动物伦理准则和已批准的实验方案进行(动物伦理委员会批准文号SYXK [Hei] 2016-007)。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

伟德体育在线b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域免责声明(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限