一种新的c型凝集素gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba介导幼虫入侵宿主肠上皮细胞gydF4y2Ba

本研究的目的是研究一种新型C型凝集素的特性gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba(TsCTL)及其在幼虫入侵肠上皮细胞(IECs)中的作用。TsCTL具有c型凝集素碳水化合物识别结构域(CRD)。克隆并表达了TsCTL全长cDNA序列gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21。qPCR、Western blotting和免疫荧光分析(IFAs)结果显示，TsCTL是一种高表达的表面和分泌蛋白gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba肠道感染幼虫(IIL)阶段，主要位于寄生虫的角质层，硬体和胚胎。rTsCTL能够特异性结合IECs，其结合位点定位于IECs细胞核和细胞质中。IFA结果显示，天然TsCTL在大鼠肠期分泌并结合于肠上皮gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba感染。rTsCTL对小鼠红细胞有凝血作用，甘露糖能抑制rTsCTL对小鼠红细胞的凝集作用。rTsCTL加速了幼虫入侵内皮细胞，而抗rTsCTL抗体和甘露糖以剂量依赖的方式显著阻碍了幼虫入侵内皮细胞。结果表明，TsCTL特异性结合IECs并促进其幼虫侵袭肠上皮，可能是疫苗的潜在靶点gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba肠内的阶段gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

旋毛虫病是一种世界范围内的食源性寄生虫病，由食用含有沙门氏菌的生的或未煮熟的肉类引起gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba肌肉幼虫(MLs) [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。哺乳动物、啮齿动物、两栖动物、爬行动物和鸟类都可以gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba主机。gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba人类的感染主要是由食用受感染的猪、猪肉、马或野生动物肉引起的[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。在阿根廷和智利，2012-2020年和2005-2015年分别记录了6662例和258例旋毛虫病患者[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。2009 - 2020年，中国共报告8起人旋毛虫病疫情，479例，2例死亡，旋毛虫病流行区主要集中在西南地区。8宗爆发个案中有7宗(87.50%)涉及食用生猪肉或半熟猪肉[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。家猪的猪肉仍然是旋毛虫病暴发的主要来源。gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba感染已成为一种主要的食源性人畜共患病，不仅是一个重要的公共卫生问题，而且对动物食品安全构成威胁[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。然而，它很难消除gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba因其宿主范围广且缺乏有效的抗宿主药而在动物中感染gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba疫苗(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。因此，需要开发预防疫苗来阻止猪的传播gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba猪肉及猪肉制品感染及消灭感染幼虫[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

摄入后,gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2BaMLs在宿主胃液的作用下从胶原胶囊中释放出来。MLs被肠道内容物或胆汁激活进入肠道感染性幼虫(iil) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。iil可穿透肠上皮细胞(IECs)，在蜕皮4次后发育成成虫(AWs)。交配后，怀孕的雌性AW产生新生幼虫(NBLs)，进入淋巴和血液循环，进入骨骼肌发育成包膜MLs，完成生命周期[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。IECs的IIL入侵是肠道发育的关键第一步gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba感染。肠上皮是第一个天然的物理屏障gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba寄生虫与宿主的入侵及主要相互作用位置[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，但IIL入侵IECs的机制尚不清楚[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。对IIL入侵分子的表征对阐明IIL入侵机制和开发阻断IIL的预防性疫苗具有重要意义gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba肠黏膜的侵犯[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

凝集素是一种凝集红细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等，并与细胞上的碳水化合物可逆结合的蛋白质。凝集素具有碳水化合物识别结构域(CRD)，可直接与宿主细胞表面结合，一种或多种碳水化合物可抑制凝集素与宿主细胞上配体的结合。CRD对低聚糖具有特异性，包括甘露糖、n -乙酰氨基葡萄糖和聚焦残基[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。动物凝集素按分子结构分为C型(包括选择素)、S型(凝集素)、P型和I型。C型凝集素(CTL)是一个由1000多个具有一个或多个C型凝集素结构域的蛋白质组成的超家族，一般含有110-130个氨基酸，具有典型的双环结构[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。凝集素的显著特点是凝集红细胞;凝集素至少有2个碳水化合物结合位点，可与红细胞表面的糖蛋白结合，导致细胞交联和沉淀。除了糖，ctl还可以识别多种配体，如脂质、蛋白质和尿酸晶体[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。来自宿主的凝集素已经得到了很好的研究，但对寄生线虫的研究较少[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。既往研究表明，寄生虫源性凝集素主要参与寄生虫对宿主细胞的粘附和侵袭[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。然而，文献中没有关于蠕虫来源的ctl的生物学特性和功能的报道gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

本研究从寄生线虫中提取了一种新的CTL结构域蛋白gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba(TsCTL, GenBank: KRY42391.1)gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba基因组草图[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。TsCTL有c型凝集素的CRD。本研究的目的是评估TsCTL的生物学特性及其在前列腺癌中的作用gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba侵袭宿主肠黏膜。gydF4y2Ba

寄生虫，实验动物和细胞gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba分离株(ISS534)是从河南省一头自然感染猪中分离得到的。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。每6个月在实验室BALB/c小鼠中传代一次。雌性BALB/c小鼠，6 ~ 8周龄，购自河南省实验动物中心(河南省实验动物中心)。SCXK 2020 - 0004)。这些小鼠在单独的通风笼中饲养(IVC，苏州丰世实验动物设备有限公司，苏州，中国)[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。从正常BALB/c小鼠小肠中分离肠上皮细胞(IECs)，阴性对照C2C12细胞来自小鼠骨骼肌成肌细胞gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba幼虫穿透[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

虫体采集及蛋白制备gydF4y2Ba

通过人工消化获得MLsgydF4y2Bat . spiralis -gydF4y2Ba感染后42天的小鼠肌肉(dpi)。分别于感染后6 h (hpi)和2、3、6 dpi从感染小鼠小肠中恢复il和AWs [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。6日龄雌性成虫在RPMI-1640培养基中培养，添加10%胎牛血清(FBS;Gibco，新西兰)，37°C, 5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba24h，收获NBLs [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。不同阶段蠕虫(MLs, IILs, AWs和NBLs)的可溶性体细胞蛋白，MLs, IILs和6 d AWs的排泄/分泌抗原(ESA)按照前面的描述制备[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。简单地说，首先用组织研磨机(KZ-II Servicebio)对不同阶段的蠕虫进行均质，然后用超声波对蠕虫组织碎片进行进一步均质。15 000 ×离心后，获得携带蠕虫可溶性蛋白的上清液gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下放置1h。此外，为了制备ESA，用无菌生理盐水洗涤蠕虫，并在RPMI-1640培养基(5000条/mL)中在37℃和5% CO下培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用0.22 μm膜过滤含ESA的培养基，用超滤管浓缩。用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白和欧空局的浓度[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

生物信息学分析与进化树构建gydF4y2Ba

从NCBI获得TsCTL基因(GenBank: KRY42391.1)的全长cDNA序列。利用生物信息学分析软件(SignalP、TargetP、SMART、ProtParam、DNAstar、Swiss-Model)分析和预测其理化性质，如信号肽、亚细胞定位、三级结构和功能位点[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。利用BioEdit软件将TsCTL的氨基酸序列与其他生物的c型凝集素进行比较。其他生物c型凝集素的GenBank加入号如下:gydF4y2Bat . nativagydF4y2Ba(KRZ61993.1),gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaT9 (KRX55578.1),gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaT8 (KRZ84598.1),gydF4y2Bat . murrelligydF4y2Ba(KRX40013.1),gydF4y2Bat . britovigydF4y2Ba(KRY48405.1),gydF4y2Bat . patagoniensisgydF4y2Ba(KRY12567.1),gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaT6 (KRX75278.1),gydF4y2Bat . nelsonigydF4y2Ba(KRX18392.1),gydF4y2Bat . pseudospiralisgydF4y2Ba(KRY00679.1),gydF4y2Bat . zimbabwensisgydF4y2Ba(KRZ11314.1),gydF4y2Bat . papuaegydF4y2Ba(KRZ71253.1)。gydF4y2Ba鞭虫是gydF4y2Ba(KFD49507.1),gydF4y2Ba鞭虫trichiuragydF4y2Ba(CDW53534.1),gydF4y2Ba亩骶gydF4y2Ba(AAD05125.1)和gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba(KAI2580953.1)。利用Jalview和MEGA 7.0软件对TsCTL进行多序列比对和系统发育树分析。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

rTsCTL的克隆、表达与鉴定gydF4y2Ba

总RNA取自gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba用TRIzol试剂(Invitrogen, USA)逆转录成cDNA。用特定引物扩增TsCTL cDNA序列gydF4y2BaBamHIgydF4y2Ba和gydF4y2Ba萨利·gydF4y2Ba限制性内切酶位点(粗体)。特异引物为5′-CgydF4y2BaGGATCCgydF4y2BaAACCGTTTTCCGTGCCGTATCAAAT-3 '和5 ' -ACGCgydF4y2BaGTCGACgydF4y2BaTCACTCCAACGAATGACAAATTC-3”。将PCR产物克隆到带n端his标签的pQE-80L中，将重组质粒pQE-80L/TsCTL转入gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3) (Novagen, USA)。用0.4 mM IPTG在25°C下诱导8 h后，表达rTsCTL，使用Ni-NTA His-tag亲和试剂盒(Novagen)纯化[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，并通过前面描述的SDS-PAGE和Western blot进行鉴定[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

抗rtsctl血清的制备gydF4y2Ba

用20 μg完全弗氏佐剂乳化的rTsCTL蛋白皮下免疫40只小鼠，每隔两周用20 μg不完全弗氏佐剂乳化的rTsCTL蛋白免疫3次[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。第四次免疫后2周，采集免疫小鼠尾血，分离抗rtsctl血清;同时收集免疫前血清作为阴性对照[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Western blot分析gydF4y2Ba

不同的可溶性粗蛋白和ES蛋白gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba用10% SDS-PAGE分离各阶段和纯化的rTsCTL [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。蛋白质在半干转移细胞(Bio-Rad, USA)中转移到硝化纤维素(NC)膜(Millipore，美国)上[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。在含0.05% Tween (TBST)的tris缓冲盐水中，用5%脱脂牛奶在37℃下封闭膜2小时，然后切开成条。用不同血清(1:100;抗rtsctl血清、感染血清和免疫前血清)，37℃孵育2 h。TBST洗涤后，37℃用hrp -抗小鼠IgG偶联物(1:10 000;南方生物技术公司，美国)。再次洗涤后，用3,3 ' -四盐酸二氨基联苯胺(DAB)染色;Sigma-Aldrich，美国)[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

qPCR化验gydF4y2Ba

总RNA来自各种gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba采用TRIzol试剂(Invitrogen)分离相(ml、il、3d AWs和nbl)。采用qPCR方法确定了不同虫期TsCTL mRNA的转录水平[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。tsctl特异性qPCR引物为5'-AACAAAATCGAATGCCGAAG-3'和5'-TAGTCACAATTCCACTCGCTT-3'。将TsCTL mRNA的相对表达量通过减去TsCTL mRNA的表达量进行归一化gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba家政基因GAPDH (GenBank: AF452239) [gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，然后根据比较Ct (gydF4y2Ba^{2−ΔΔCtgydF4y2Ba})方法[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。每个实验设3个重复。gydF4y2Ba

免疫荧光法(IFA)gydF4y2Ba

采用IFA法确定TsCTL蛋白的组织位置gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba以前报道过的蠕虫[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。各种各样的整虫gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba用4%多聚甲醛固定各阶段(MLs、il、AWs和NBLs)，包埋石蜡，切片机切割2µm厚的蠕虫截面[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。整个gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba用5%山羊血清在37℃下阻断切片1 h, PBS洗涤3次，然后用1:10稀释的抗rtsctl血清、感染血清和免疫前血清孵育。山羊抗小鼠IgG-FITC偶联物(1:100;Abways, Shanghai, China)作为二抗。多次洗涤后，在荧光显微镜下观察全虫和横截面(Olympus, Japan) [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

远西印迹分析gydF4y2Ba

rTsCTL和IEC的结合通过远western blot分析进行研究，如前所述[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。简而言之，可溶性IEC蛋白首先通过SDS-PAGE分离，然后转移到NC膜(Millipore, USA)。将膜切成条状，用5%脱脂牛奶在37℃下阻断2 h，然后用20 μg/mL的rTsCTL在37℃下孵育2 h。用PBST洗涤后，在37℃下用抗rtsctl血清(1:100)和hrp -抗小鼠IgG (1:10 000;南方生物科技公司)作为二抗[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。洗涤后，用3-氨基-9-乙基氨基唑(AEC, Solarbio, China)进行显色，用AlphaView软件分析蛋白质条带[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

rTsCTL与IECs结合的IFA分析gydF4y2Ba

利用IFA对rTsCTL与IECs的结合及其细胞定位进行了评估[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。IECs在6孔培养板中培养，直到汇合[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。用rTsCTL (20 μg/mL) 37℃孵育IECs 2 h, PBS洗涤后，用4%多聚甲醛固定IECs 10 min，再用5%山羊血清37℃封闭IECs 2 h，用抗rTsCTL血清(1:10)孵育IECs。fitc -抗小鼠igg偶联物(1:100;Abways, Shanghai, China)作为二抗。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Solarbio)将细胞核染成蓝色，用荧光显微镜和Olympus FV1200激光扫描显微镜观察细胞[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。使用Olympus FV1200激光扫描显微镜采集图像，并使用Olympus Fluoview软件进行分析[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

TsCTL与正常小鼠肠上皮结合的IFA分析gydF4y2Ba

为了确定TsCTL与正常小鼠肠道上皮的结合能力，将正常小鼠小肠用多聚甲醛固定，制备3 μm肠组织切片，并按照先前的方法进行IFA [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。简单地说，用5%山羊血清阻断切片后，用rTsCTL或IIL ESA (20 μg/mL)在37℃下孵育1 h，后续步骤与IFA相同。gydF4y2Ba

为了确定天然TsCTL是否能分泌并结合到肠道上皮，8只小鼠口服感染3000 ml。分别于1、3、7、14 dpi处死2只感染小鼠，收集肠道，制备肠切片用于IFA分析[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

血凝活性和糖抑制试验gydF4y2Ba

收集小鼠红细胞，悬浮于2% TBS缓冲液(200 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)中。在TBS缓冲液中加入不同浓度的rTsCTL (0 ~ 400 μg/mL)。混合后加入含有10 mM CaCl的TBS缓冲液中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrich, USA)作为无关蛋白对照，PBS作为阴性对照。室温孵育1 h，肉眼观察完全凝集，记录诱导红细胞凝集的最低剂量[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。这个实验做了三个重复。gydF4y2Ba

根据先前的研究进行了糖抑制试验[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。四种不同的碳水化合物，乳糖，蔗糖，葡萄糖和甘露糖，在这个实验中使用。u型板中加入rTsCTL (100 μg/mL)，孔中加入25 μL不同稀释度(100 - 400 mM)的碳水化合物。室温孵育1小时后，加入2%小鼠红细胞悬液，室温孵育1小时，观察血凝抑制作用。两次对照试验不使用rTsCTL或碳水化合物，用PBS代替。gydF4y2Ba

体外幼虫侵袭试验gydF4y2Ba

为了分析TsCTL在幼虫入侵肠道上皮过程中的加速作用，根据先前的报道进行了体外入侵试验[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。简单地说，将mL用5%的猪胆汁在37℃下活化成iil，并在半固体培养基中加入不同剂量的rTsCTL (0-15 μg/mL)和100个iil。并以相同浓度的牛血清白蛋白作为对照。5% CO培养后gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37℃孵育2 h，显微镜观察IECs幼虫入侵情况。入侵的iil在细胞单层内活跃并迁移，而未入侵的iil在细胞单层表面盘绕。gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。在红细胞凝集活性试验中，4种碳水化合物中只有甘露糖对rTsCTL对小鼠红细胞的凝集有抑制作用。因此，为了进一步分析甘露糖对幼虫入侵的抑制作用，我们采用甘露糖进行体外幼虫入侵试验。先用不同剂量(0 ~ 400 mM)甘露糖在37℃下孵育2 h，然后加入半固体培养基。5% CO培养后gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37℃孵育2 h，显微镜观察幼虫对IECs的渗透情况。为了进一步分析甘露糖是否能抑制促进IEC幼虫侵袭的rTsCTL，首先将10 μg/mL的rTsCTL与不同剂量(0-400 mM)的甘露糖孵育2 h，并将含有rTsCTL、甘露糖和il的混合物加入细胞单层。5% CO培养后gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37℃孵育2 h，显微镜下观察IECs幼虫入侵情况[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有数据均采用SPSS 21.0软件进行分析，结果以均数±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析分析不同时期TsCTL mRNA相对表达水平的差异。采用卡方检验比较不同组间幼虫侵染的差异。采用线性回归分析rTsCTL、抗rTsCTL抗体和甘露糖剂量与幼虫侵染的相关性。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

TsCTL的生物信息学分析gydF4y2Ba

TsCTL cDNA全长627 bp，编码208 aa，分子量为24 kDa, pI为8.19。TsCTL含有一个信号肽，在n端具有明显的疏水性，并含有一个跨膜区。亚细胞定位预测TsCTL是一种分泌蛋白。TsCTL的氨基酸序列与8个被包封的c型凝集素的同源性分别为96.30、96.30、95.56、95.56、93.75、93.75、92.79和90.38%gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba物种/基因型(gydF4y2Bat . nativagydF4y2Ba，gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaT9,gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaT8,gydF4y2Bat . murrelligydF4y2Ba，gydF4y2Bat . britovigydF4y2Ba，gydF4y2Bat . patagoniensisgydF4y2Ba，gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaT6,gydF4y2Bat . nelsonigydF4y2Ba)，与3种未包封的c型凝集素的同源性分别为84.44%、76.71%和76.03%gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba物种(gydF4y2Bat . pseudospiralisgydF4y2Ba，gydF4y2Bat . zimbabwensisgydF4y2Ba和gydF4y2Bat . papuaegydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。TsCTL结构预测显示c型凝集素在24-156残基处存在CRD(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaA). TsCTL的系统发育树显示该属属于单系群gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba有良好的支撑，与鞭虫密切相关(gydF4y2Ba鞭虫是gydF4y2Ba和gydF4y2Ba鞭虫trichiuragydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

rTsCTL的表达与鉴定gydF4y2Ba

经IPTG诱导后，His-tag融合蛋白在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21窝藏pQE-80L/TsCTL。采用Ni-NTA-Sepharose柱纯化rTsCTL蛋白。SDS-PAGE分析显示，rTsCTL具有清晰可见的单个条带，其分子量(24 kDa)与预测大小一致(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).为了评估rTsCTL免疫引起的抗体反应，我们在四次免疫后两周用elisa法测定了抗rTsCTL IgG的滴度。结果显示抗rtsctl抗体IgG滴度达到1:10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba经4次免疫，表明rTsCTL具有良好的抗原性。Western blot分析显示，rTsCTL可被抗rTsCTL免疫血清、感染血清和抗his标记单克隆抗体识别(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB)而不是正常血清。gydF4y2Ba

TsCTL在多种动物中的转录和表达gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba阶段gydF4y2Ba

qPCR检测结果显示，IIL期TsCTL mRNA表达量显著高于ML期，但2 d AW和NBL期TsCTL表达量低于ML期(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba4gydF4y2BaA).多种体细胞可溶性蛋白gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba通过SDS-PAGE分析分离出分期(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaB). Western blot结果显示，可溶性蛋白中存在多种原生TsCTLgydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba用抗rtsctl血清检测各期(ml、2 h il、6 h il、3 d AWs和NBLs)。在多种蠕虫体细胞可溶性蛋白中鉴定出了原生TsCTL蛋白gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba阶段(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外，不同虫期(MLs、6 h il和6 d AWs) ES蛋白中的天然TsCTL可被抗rtsctl血清识别(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。结果表明，TsCTL是多种细胞的分泌蛋白gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2BaIIL期TsCTL的高表达提示TsCTL可能是一种侵袭相关蛋白。gydF4y2Ba

天然TsCTL的表达与定位gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba

用抗rtsctl血清和感染血清对MLs、IILs、AWs和NBLs进行全虫IFA检测，结果在MLs、IILs、AWs和NBLs表皮上显示绿色免疫荧光(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。用抗rtsctl血清探查虫体截面时，免疫染色位于雌性成虫的MLs、il和胚胎的角质层和粘体(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。正常血清未检出虫体组织成分。gydF4y2Ba

用远western blotting评估rTsCTL和IEC蛋白的结合gydF4y2Ba

经远western blot分析，IEC蛋白与rTsCTL孵育后，与感染血清共鉴定出12条条带(71.5、40.4、35.6、34.3、29.5、28.0、26.1、25.1、23.6、18.6、16.7和15.7 kDa)，抗rTsCTL血清比感染血清多鉴定出3条条带(43.8、22.5和21.1 kDa)。免疫前血清未检出经rTsCTL预孵育的IEC蛋白，抗rTsCTL血清或感染血清未检出经rTsCTL预孵育的C2C12蛋白(图2)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。结果表明，TsCTL与IEC蛋白存在特异性结合。gydF4y2Ba

rTsCTL与IECs的结合及其细胞定位gydF4y2Ba

IFA结果显示，用rTsCTL预孵育IECs后，抗rTsCTL血清和感染血清探针的IECs表面可见绿色免疫荧光染色，而免疫前血清探针的IECs表面未见绿色免疫荧光染色(图2)gydF4y2Ba9gydF4y2BaA)。共聚焦显微镜显示免疫染色主要局限于IEC细胞核和细胞质(图2)gydF4y2Ba9gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

rTsCTL与天然TsCTL与肠内上皮的结合gydF4y2Ba

IFA结果显示，与rTsCTL孵育后，抗rTsCTL血清和感染血清检测到正常小鼠肠内上皮的绿色荧光，而免疫前血清未观察到免疫染色(图2)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。用抗rtsctl血清和感染血清探查感染小鼠在感染后不同时间的肠道切片，在1、3、7和14 dpi处检测肠上皮的免疫染色(图2)gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)，表明天然的TsCTL可以在肠期分泌并与肠上皮结合gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2BaTsCTL可能参与了幼虫对宿主肠道粘膜的侵袭。gydF4y2Ba

rTsCTL血凝活性和糖抑制试验gydF4y2Ba

用rTsCTL进行血凝和糖抑制实验，结果显示rTsCTL具有血凝作用，即CagydF4y2Ba^{2＋gydF4y2Ba}相关的。rTsCTL与小鼠红细胞的最低凝集浓度为25 μg/mL(图2)gydF4y2Ba12gydF4y2BaA)。在糖抑制实验中，甘露糖是唯一一种通过rTsCTL抑制小鼠红细胞凝集的碳水化合物，甘露糖的最小抑制剂量为100 mM(图2)gydF4y2Ba12gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

rTsCTL促进和甘露糖抑制幼虫入侵gydF4y2Ba

如图所示gydF4y2Ba13gydF4y2BaA，侵染幼虫留下了清晰的迁徙痕迹(白色箭头)，未侵染幼虫盘绕在细胞单层表面(图2)gydF4y2Ba13gydF4y2BaB).当培养基中添加rTsCTL和il在培养基中培养2 h时，rTsCTL明显促进了幼虫的侵袭。这种加速是rtstl剂量依赖性的(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.976,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，且随rTsCTL剂量的增加呈增加趋势(gydF4y2BaFgydF4y2Ba= 82.091,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。然而，BSA并未导致幼虫入侵加速(图2)gydF4y2Ba13gydF4y2BaC, D)。培养基中加入不同稀释度(1:50 - 1:20 00)的抗rtsctl血清，与iil共孵育2 h，与PBS组相比，IECs对幼虫侵袭的抑制率分别为41.99、35.15%和26.08% (gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{1:50gydF4y2Ba}= 10.242,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{1:100gydF4y2Ba}= 7.126,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{1:200gydF4y2Ba}= 3.911,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。对抗rtsctl抗体的抑制呈剂量依赖性(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.918,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，且随血清稀释度的增加呈下降趋势(gydF4y2BaFgydF4y2Ba= 21.363,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba13gydF4y2BaE, F)。此外，免疫前血清对幼虫侵入IECs没有任何抑制作用。gydF4y2Ba

将IIL与不同稀释度的甘露糖在37℃下孵育2小时后，将甘露糖处理过的IIL加入到IEC单层共培养2小时，幼虫入侵明显受到抑制。50 ~ 400 mM甘露糖对IECs幼虫侵袭的抑制率分别为25.39%、34.80%、41.27%和46.88% (χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba= 3.862,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba}= 6.550,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_200gydF4y2Ba= 10.425,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_400gydF4y2Ba= 13.025,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。这种抑制作用与甘露糖(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.839,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，且随甘露糖剂量的增加呈上升趋势(gydF4y2BaFgydF4y2Ba= 9.493,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。结果表明，甘露糖可明显抑制IIL对IECs的侵袭，表明甘露糖与IIL的预孵卵可能导致甘露糖与TsCTL CRD结合，从而降低TsCTL CRD与IEC配体的相互作用，从而抑制IECs的侵袭。gydF4y2Ba

为了进一步验证甘露糖是否能够阻断rTsCTL对体外IECs渗透的促进作用，我们将10 μg/mL的rTsCTL与不同剂量的甘露糖(0-400 mM)在37℃下孵育2 h，然后，结果表明，与不加甘露糖和甘露糖的PBS组相比，甘露糖(200和400 mM)显著降低了rTsCTL对IECs幼虫入侵的促进作用(χ 2)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_200gydF4y2Ba= 4.153,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_400gydF4y2Ba= 8.099,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

C型凝集素(CTL)是一个由1000多种蛋白质组成的超家族，具有一种或多种类型的CLECT，可以结合Ca中的碳水化合物gydF4y2Ba^{2＋gydF4y2Ba}端依赖的方式。CLECT结构具有典型的双环结构，由两个高度保守的二硫键和一系列保守的疏水和极性相互作用稳定，最突出的特征是“WIGL”基序，该基序在CLECT中高度保守，参与CTL三级结构疏水核心的形成[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。CTL在寄生虫感染中起重要作用。寄生蠕虫的CTL首次在gydF4y2Ba犬弓蛔虫gydF4y2Ba和细胞分泌的ctlgydF4y2Ba犬蛔虫gydF4y2Ba能与宿主细胞表面的配体结合。CTL促进细胞渗透gydF4y2Ba日本血吸虫gydF4y2Ba进入宿主的结缔组织[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。的c型凝集素gydF4y2Ba隐孢子虫以及gydF4y2Ba介导IECs的寄生虫入侵和感染[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

本研究从基因库中检索到一种新的C型凝集素结构域蛋白(TsCTL, GenBank: KRY42391.1)gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba草案基因组。TsCTL包含一个信号肽和一个CLECT结构域，序列比对显示与8个被封装的ctl具有较高的氨基酸序列一致性gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba物种的基因型。结构预测表明TsCTL在24-156残基处有CTL。结果表明，TsCTL在该属的不同种/基因型中可能具有相似的功能gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba．将TsCTL的完整cDNA序列克隆到pQE-80L质粒中，并在细胞中表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达系统。由于His标记只有6个组氨酸残基，因此纯化rTsCTL比较方便，而且His标记对rTsCTL的结构和性质影响不大，因此采用Ni-NTA柱纯化后获得了单个蛋白[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。Western blotting分析，抗rTsCTL血清和感染血清鉴定rTsCTL。接种rTsCTL小鼠可产生特异性抗rTsCTL IgG反应，血清特异性抗rTsCTL IgG滴度高达1:10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba提示rTsCTL具有良好的免疫原性。gydF4y2Ba

qPCR结果显示，TsCTL在所有菌株中均有转录gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba且TsCTL在IIL期6 h的相对表达量明显高于其他各期。Western blotting分析表明，抗rtsctl血清可识别不同虫期体细胞蛋白和ES蛋白中的天然TsCTL。免疫荧光染色显示，原生TsCTL主要定位于雌性成虫的角质层、体和胚胎。棘囊体由一系列棘囊细胞组成，主要位于线虫的前半部分。每个杆状细胞有一个核，细胞质含有特征性的分布性分泌颗粒，具有高度的抗原性。此外，每个粘稠细胞含有一个导管，通向食管腔，排泄分泌的蛋白质。既往研究发现甘露聚糖结合凝集素(MBL)存在于植物的表面和内部器官gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2BaML组织化学染色。MBL与两者绑定gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2BaML粗提物和ESA抑制甘露糖的作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。结果表明，TsCTL是一种与宿主肠上皮直接接触的表面和分泌蛋白，可能介导IIL对肠黏膜的侵袭[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

远西印迹分析可以有效地从蛋白质的粗混合物中筛选弱蛋白质相互作用，并已成功地用于检测蛋白质的结合gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba侵袭性蛋白和IECs [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。本研究还确定了TsCTL和IEC蛋白之间的蛋白结合。Far-Western blot结果显示，rTsCTL和IEC蛋白具有特异性结合。此外，通过共聚焦显微镜检测rTsCTL与IEC结合的细胞定位，结果表明其结合主要定位在IEC细胞核和细胞质中。IFA结果还显示，经rTsCTL孵育后，抗rTsCTL血清检测到正常小鼠肠内上皮的绿色荧光。用抗rtsctl血清和感染血清探测感染小鼠在感染后不同时间的肠道切片，在1、3、7和14 dpi时检测肠上皮的免疫染色，表明天然TsCTL在感染后早期肠上皮分泌并结合gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba感染。先前的研究表明，当iil与IEC一起孵育时，一些gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2BaIILs产生的蛋白质进入IEC [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。的CRDgydF4y2Ba痢疾阿米巴gydF4y2BaGal/GalNAC凝集素能够与人结肠细胞中的TLR2和TLR4结合，激活它们的信号通路，促进滋养体粘附细胞[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。结果进一步表明，TsCTL与IECs之间存在相互作用，TsCTL可能参与了幼虫对宿主肠道上皮的侵袭[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。然而，在进一步的研究中，需要使用免疫沉淀和质谱技术来验证哪些IEC蛋白与TsCTL结合[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

rTsCTL的血凝活性也在目前的研究中被确定。结果表明，rTsCTL具有凝集小鼠红细胞的功能，其凝集活性为CagydF4y2Ba^{2＋gydF4y2Ba}相关的。在糖抑制实验中，甘露糖是四种碳水化合物中唯一能抑制rTsCTL对小鼠红细胞凝集的碳水化合物。甘露糖是C-2位置的羟基差异异构体，是一种参与糖基化修饰的单糖，可以特异性地结合某些ctl的clect并抑制ctl与复合低聚糖作用的能力[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。rTsCTL与甘露糖的特异性结合很可能与其结构有关[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

体外侵染实验结果表明，rTsCTL促进IECs的侵染，抗rTsCTL抗体抑制IECs的侵染;促进或抑制作用与rTsCTL和抗rTsCTL抗体呈剂量依赖关系。这种促进作用可能与rTsCTL与IECs的结合有关[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。抗rtsctl抗体抑制IECs幼虫的侵袭可能是由于TsCTL和抗TsCTL抗体在蠕虫前部形成帽状免疫复合物，阻断了幼虫与肠道上皮的直接接触，阻碍了蠕虫的侵袭[j]。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。不同浓度甘露糖孵育后，幼虫的侵染受到明显抑制，且随甘露糖浓度的增加，抑制程度呈上升趋势。甘露糖抑制IECs幼虫的侵袭可能是因为TsCTL定位于iil的表皮，甘露糖与TsCTL CRD在iil表面的结合竞争性地抑制了TsCTL与IECs配体的结合，这可能阻断了rTsCTL与IEC的相互作用和结合，阻碍了IECs幼虫的侵袭。先前的一项研究表明，这种结合gydF4y2Bac以及gydF4y2Bac型凝集素CpClec和IECs被硫酸糖胺聚糖特异性抑制gydF4y2Bac以及gydF4y2Ba糖胺聚糖也能抑制HCT-8细胞的附着和感染[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba弓形虫gydF4y2Ba该寄生虫c型凝集素与cd209相互作用促进了对宿主细胞的侵袭，并被配体模拟寡糖和抗cd209抗体抑制。这些寡糖还降低了寄生虫负担，与寄主传播和死亡率有关gydF4y2Ba弓形虫gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。TsCTL在体内的具体功能还需要进一步的动物感染实验来验证。结果表明，甘露糖有可能作为抗-的佐剂gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba在早期阶段阻断幼虫入侵的药物和疫苗gydF4y2Ba旋毛虫gydF4y2Ba暴露和感染。gydF4y2Ba

综上所述，TsCTL在肿瘤的IIL期高表达gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba雌成虫的生命周期和定位于角质层、硬体和胚胎。TsCTL是一种表面和分泌性蛋白，与IECs和肠上皮特异性结合，结合位点位于IECs的细胞核和细胞质中。rTsCTL对红细胞有凝血活性，甘露糖抑制rTsCTL的凝血功能。rTsCTL能促进IECs幼虫的侵袭，而抗rTsCTL血清和甘露糖抑制IECs幼虫的侵袭呈剂量依赖性。这些发现表明，TsCTL在gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba侵袭肠道黏膜，可能是疫苗的候选靶点gydF4y2Bat . spiralisgydF4y2Ba侵袭和早期感染。gydF4y2Ba

AWs:gydF4y2Ba

成虫gydF4y2Ba

轻拍:gydF4y2Ba

3,3 '-四盐酸二氨基联苯胺gydF4y2Ba

DAPI:gydF4y2Ba

4, 6-Diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba

ESA:gydF4y2Ba

排泄分泌抗原/gydF4y2Ba

的边后卫:gydF4y2Ba

胎牛血清gydF4y2Ba

合:gydF4y2Ba

辣根过氧化物酶gydF4y2Ba

iec:gydF4y2Ba

肠上皮细胞gydF4y2Ba

IILs:gydF4y2Ba

肠道感染性幼虫gydF4y2Ba

IFA:gydF4y2Ba

免疫荧光分析gydF4y2Ba

IPTG:gydF4y2Ba

异丙基β-d-1-thiogalactopyranosidegydF4y2Ba

美国职业足球大联盟:gydF4y2Ba

肌幼虫gydF4y2Ba

创新:gydF4y2Ba

新生幼虫gydF4y2Ba

NC:gydF4y2Ba

硝基gydF4y2Ba

OD:gydF4y2Ba

光密度gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

TBST:gydF4y2Ba

含有Tween的tris缓冲盐水gydF4y2Ba

TsCTL:gydF4y2Ba

旋毛虫gydF4y2BaC型凝集素gydF4y2Ba

我们感谢WW Yue女士、LL Han女士和SW Yan先生在本次研究中对实验技术的帮助。gydF4y2Ba

本研究得到国家自然科学基金(82272367,82172300)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 郑州大学医学院寄生虫学教研室，河南郑州450052gydF4y2Ba

   郝惠楠，宋彦彦，马凯宁，王伯宁，龙绍荣，刘若丹，张曦，王忠全，崔静gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

概念化:ZQW, JC;数据分析:HNH。融资收购:ZQW, JC。调查:HNH, YYS, KNM, BNW, SRL, RDL, XZ, ZQW, JC。研究方法:周秋伟，周建新。项目管理:JC, ZQW。资源:ZQW, JC。监督:ZQW, JC。写作±原稿:张国华、张秋文、张建军。写作±审编:张海华，张秋文，张建军。 All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba王忠全gydF4y2Ba或gydF4y2Ba崔京gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

实验动物按照《中华人民共和国国家实验动物福利管理办法》(2006年)进行饲养和照料。已获得郑州大学生命科学伦理委员会(No. 811a)伦理批准。SCXK 2020 - 0004)。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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