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评价羊驼气管外植体作为中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染研究的体外模型

兽医研究体积53，文章号:67（2022）引用本文

摘要

中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)严重威胁公共卫生。在这里，我们使用气液界面培养系统建立了羊驼气管外植体(ATE)体外模型，以深入了解MERS-CoV在骆驼下呼吸道的感染情况。ATE可被MERS-CoV感染，为103.TCID50/mL是建立有效感染所需的最小病毒剂量。在ATE培养中，MERS-CoV感染未诱导IFN和抗病毒ISGs，这强烈表明在体内观察到的ISGs表达是骆驼鼻黏膜中IFN诱导的结果。

简介、方法和结果

中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)是2012年在沙特阿拉伯王国出现的一种呼吸道疾病的病原体[1］．来自阿拉伯半岛的早期报告显示，该病的病死率很高[2，3.，4］．截至2022年4月，世界卫生组织报告了2585例感染和890例死亡(∼病死率为34.4%)，遍布四大洲的27个国家[5］．中东呼吸综合征在人类的主要表现从无症状或轻微呼吸道症状到导致急性呼吸窘迫综合征的肺炎[4］．单峰骆驼是中东呼吸综合征冠状病毒的宿主/中间宿主[6]，因为病毒中和抗体已在该物种中报道[7，8，9，10，11，12，13]，而且病毒不需要突变就能从单峰骆驼传染给人类[14］．此外，所有研究的骆驼在实验和自然条件下都对MERS-CoV感染敏感[15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24］．

先天免疫是对抗病毒感染的第一个宿主防御系统，被认为在MERS发病机制中发挥关键作用。对许多人类细胞类型的中东呼吸综合征冠状病毒感染的研究得出结论，I型和III型干扰素(IFNs)在很大程度上受到抑制或延迟[25，26，27］．此外，肺巨噬细胞持续大量分泌炎症细胞因子以及黏膜水平先天免疫反应的抑制可能导致人类更严重的感染[28，29，30.，31］．相比之下，骆驼只表现出对MERS-CoV的亚临床反应[15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24］．这种结果显然是由于受感染的鼻上皮细胞产生的I型和III型ifn的作用，最近在羊驼中进行的工作表明[24］．与远端未感染细胞不同，感染上皮细胞产生干扰素，而干扰素刺激基因(ISGs)在感染和未感染上皮细胞中的表达均升高，这表明IFNs可以以旁分泌方式诱导未感染细胞中ISGs的表达[24］．同样，在鼻上皮细胞产生的ifn也可能通过内分泌途径被感知，这一点由下呼吸道(LRT)中isg的产生证明，而这些组织中没有ifn的可检测表达[22，24］．

除了骆驼宿主有效的先天免疫反应外，在这些物种中可能导致中东呼吸综合征冠状病毒轻度发病机制的另一个因素是病毒能够在来自LRT的细胞内适度复制。既往研究表明，鼻内接种MERS-CoV时气管内发现的感染细胞极少[15，19，20.，22，24]，虽然在骆驼中二肽基肽酶4 (DPP4)的表达水平与鼻黏膜相当[32，33］．目前尚不清楚如何抑制MERS-CoV向轻型呼吸道的复制。因此，在本研究中，我们使用ALI系统建立了离体气管器官培养来填补这些知识空白。

三只10至12个月大的羊驼(骆马帕科)是通过私人出售购买的，在驯化期间安置在Alcarràs(西班牙加泰罗尼亚)的IRTA农场设施中，然后转移到巴塞罗那(西班牙)的巴塞罗那自治大学进行尸检。动物被安乐死，将过量的戊巴比妥注射到颈静脉。气管的中间部分(n= 3)无菌收集，用1:1的Dulbecco 's改性Eagle 's培养基(DMEM, Lonza)和Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基(补充青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)、l -谷氨酰胺(10 mM)的混合培养基加热运输至实验室;双两性霉素(2 μg/mL;Sigma-Aldrich)。将获得的气管组织浸泡在新鲜的温输送介质中清洗三次，然后根据先前发表的方案分离ATE [34作了一些修改。简单地说，从气管环上剥离气管黏膜。小心地丢弃软骨，然后将每个部分切成25毫米的正方形2，然后转移到细网的inox钢纱布上，放置在6孔培养板中，上皮朝上。每孔含2ml培养基(CM)，由不含两性霉素的输送介质组成。ATE在ALI界面培养，使上皮细胞轻微浸入液体中，纤毛暴露在空气中(图)1A, B).外植体在37°C和5% CO的加湿培养箱中培养4天2．每天(每24小时)在光学显微镜下检查睫状体跳动。

图1
图1

羊驼气管外植体(ATE)模型的气液(ALI)装置实验时间过程和设置示意图。（一个) ALI接口设置概述示意图及(B)一张ATE(箭头)放在六孔培养板内的inox纱布上的照片。（C)实验概述，说明外植体收集、培养、感染和取样的时间点。经尸检，从羊驼(n= 3)，在ALI接口系统中培养。用MERS-CoV Qatar15/2015菌株培养24小时后，ATE被感染，剂量为3种:102, 103.，和104TCID50/毫升。分别在-24、0、24、48和72 h从每只动物身上收集外植体重复进行病毒学、病理学和免疫学评估。

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将分支B MERS-CoV Qatar15/2015株(GenBank Accession MK280984)传代3种在Vero E6细胞中繁殖，并通过计算50%接种细胞培养物中引起细胞病变效应的稀释度来滴定(50%组织培养感染剂量终点[TCID50])，如上文所述[19］．选择中东呼吸综合征冠状病毒卡塔尔15/2015株是基于目前只有B支系在阿拉伯半岛流行[35]与典型的MERS-CoV EMC/2012菌株相比，它增强了羊驼的体内复制能力[22］．ATE以三种不同剂量接种MERS-CoV Qatar15/2015菌株2, 103.，和104TCID50/mL (CM1C).简单地说，气管外植体为每只动物的每个时间点制备三份(n= 3)置于无菌不锈钢纱布上，放置在6孔培养板上，上皮表面朝上(图1A, B)。培养24小时后，将外植体转移到新的6孔培养板上，然后在顶端感染每一剂MERS-CoV。仅使用CM进行模拟感染对照。病毒暴露在37°C和5% CO的加湿培养箱中1小时后2时，外植体用温PBS清洗三次，放回到原来含有CM的6孔板的纱布上。在接种后24、48和72 h (hpi)收集外植体，并在含有1)10%福尔马林的试管中引入，用于形态计量学、组织学和免疫组织化学分析(三个重复中的两个);或2)tri试剂(zyymo Research, California, USA)用于RNA病毒定量和先天免疫反应分析。

外植体在10%中性缓冲的福尔马林中浸泡5天，包埋石蜡块，进行组织学分析(苏木精和伊红染色，H&E)。此外，通过测量每个气管切片上随机选择的五个区域来评估气管上皮的厚度。使用小鼠抗MERS-CoV N蛋白抗体(Sino Biological Inc.， Beijing, China)根据先前建立的方案检测MERS-CoV抗原的存在[33］．由委员会认证的兽医病理学家建立了免疫组化(IHC)分级系统(−，未检测到阳性细胞;±，每个组织切片不到10个阳性细胞;+，每个组织切片10 - 50个阳性细胞;+ +，每个组织切片50 - 150个阳性细胞)。

从不同时间点收集的ATE样本中提取总RNA，并按照先前的标准程序将其转化为cDNA [24］．采用微流控RT-qPCR方法对免疫相关基因的表达进行相对定量。先天免疫基因和特异性引物对扩增其转录产物的选择在以前的著作中有描述[22，24］．此外，将用于检测基因组(UpE)和亚基因组(M)病毒RNA的特异性引物添加到检测中(附加文件中的表A)1) [24］．数据采用Real-Time PCR Analysis 4.1.3软件(Fluidigm Corporation, South San Francisco, USA)和DAG表达软件1.0.5进行分析。6、如前所述[24］．HPRT1，GAPDH而且哥伦比亚大学基因被用作归一化基因，从24、48和72 hpi收集的感染外植体中获得的值与从0 hpi的未感染ATE中获得的值进行比较。各细胞因子基因表达上调或下调均以折变值表达(附文表B)1)．

MERS-CoV感染没有显著改变上皮层的平均厚度(介于63.3至86.7 μ m之间)(图2)在整个离体实验期间，ATE也没有引起明显的组织病理学变化(图3.A, B)。从48 hpi开始，所有培养的ATE都保持了几乎完整的细胞和组织形态，尽管上皮细胞和固有层中有极少数细胞空泡化(图3.B)。4A显示感染三种不同病毒剂量后MERS-CoV产量的动力学(102, 103.和104TCID50分别为/毫升)。ATE中的病毒基因组RNA负荷与剂量和时间有关(图4左)。感染剂量为104TCID50/mL导致ATE的病毒RNA检测最高，在48 hpi后达到平台期。为了确定ATE内活跃的病毒基因转录，还评估了MERS-CoV亚基因组RNA (M基因)的存在(图4右)。仅在感染10的ATE中检测到M mRNA的载量3.或104TCID5010 . /mL接种MERS-CoV, M mRNA无转录2TCID50/毫升剂量。与病毒RNA定量结果一致，在感染ATE的10种病毒中检测到IHC阳性标记3.或104TCID50/mL在48或72 hpi采样(图4A和附加文件2)．特异性染色多位于气管上皮细胞的细胞质中(图4B)。

图2
图2

羊驼气管外植体离体培养后厚度的光学显微摄影评价。在尸检时采集气管，然后用不同剂量的MERS-CoV进行感染(图右)。在不同时间点采集ATE，并在10%中性缓冲福尔马林中固定。分别在-24、0、24、48和72 hpi时，用苏木精-伊红染色每一份福尔马林固定石蜡包埋ATE切片，通过测量每个切片上随机选择的5个区域(左侧用黑色箭头表示)来评估上皮的厚度。

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图3
图3

羊驼气管外植体(ATE)的组织病理学研究。应用苏木精-伊红染色评估ATE的组织学改变(一个)优先及(B)在MERS-CoV感染后。研究的外植体，无论是否接种MERS-CoV，均未观察到明显病变。原始放大倍数:所有组织× 200。

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图4
图4

羊驼气管外植体(ATE)中MERS-CoV负荷。（一个通过微流控RT-qPCR测定MERS-CoV基因组(左)和亚基因组(右)RNA(附文件A页)1)．每条线分别代表Cq的平均值，误差条分别显示在0、24、48和72 hpi下3只动物ATE的标准差区间。蓝色、紫色和红色点表示感染了10的ATE2, 103.和104TCID50/mL MERS-CoV。（B) MERS-CoV在ATE中的组织向性。在72 hpi时，用免疫组织化学方法检测感染10株ATE的上皮中MERS-CoV N蛋白(棕色染色)3.和104TCID50/mL剂量;原始放大倍率:双组织× 200。ATE，羊驼气管外植体;1/3和2/3分别表示在三分之一或三分之一的外植体中检测到病毒RNA。

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为了探索在ATE中MERS-CoV感染激活的抗病毒和炎症通路，在模拟处理和病毒感染的ATE中监测39个先天免疫应答基因的相对mRNA表达水平。检测中包括三个高度稳定的归一化基因。在0 hpi收集的未感染ATE对照中，所有基因都在基础水平上检测到，因此，可以根据这一参考时间点对整个数据集进行归一化。在任何剂量的MERS-CoV感染ATE后，促炎细胞因子、趋化因子和转录因子的转录(IRF5除外)均呈现轻微下调趋势(图5和附加文件中的表B1)．其余的基因，包括ifn、ISGs、模式识别受体、下游信号转导酶、适配器和受体，在基础水平上下波动(图5和附加文件中的表B1)，表明ATE抑制了MERS-CoV感染时的抗病毒反应。

图5
图5

ATE对不同MERS-CoV感染剂量的反应的先天免疫基因谱动力学从ATE中提取总RNA，然后转化为cDNA。Fluidigm Biomark微流控检测用于定量不同hpi下先天免疫基因的转录本。归一化后，计算对照(新鲜制备的外植体)与模拟或感染ATE之间的折叠变化值。生成的热图显示了与对数对应的颜色变化2折叠变化值，蓝色为基因表达增加，棕色为基因表达减少。卡其色矩形表示没有相应基因的表达。转录因子;中正,趋化因子;广告,适配器;RT,受体。

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讨论

MERS-CoV在中间宿主中的发病机制尚未完全了解。虽然骆驼可以在实验中感染，但这种方法意味着巨大的财政成本、伦理问题和安全风险，并需要在生物安全3级(BSL-3)环境下使用特殊的家庭设施。因此，我们开发了一个离体ATE模型来解决这些障碍。ATE在实验过程中保持了睫状体的完整性，说明气管上皮对睫状体搏动的协调和调节功能仍然存在。形态测量学和组织学评估表明，ATE在至少72 hpi内保持良好的细胞和组织形态，显示出与新收集的气管非常相似。值得注意的是，实验感染中东呼吸综合征冠状病毒的单峰骆驼的鼻上皮细胞中出现了大量的睫状体脱落[36]但在大羊驼身上却没有[33]或羊驼[24］．

在本研究中，ATE无法表达ifn，这与之前对感染MERS-CoV的羊驼气管的观察一致[22，24］．此外，在感染MERS-CoV后，ATE没有诱导ISGs，这支持了在体内观察到的气管黏膜ISGs上调可能是由于鼻上皮细胞产生的IFNs的旁分泌作用[24］．近年来，已建立了羊驼和双峰驼假分层气道上皮细胞(AEC)培养模型。这些AEC产生于气管支气管道，支持几种MERS-CoV谱系的生长，并对IFNs的抗病毒作用敏感[37，38］．然而，在这些实验中，没有检查MERS-CoV感染时ifn和细胞因子的产生。然而，当用干扰素处理时，骆驼气管细胞可以产生isg，这表明先天免疫系统具有功能性[38］．ATE和AEC都可以用于测试几种导致MERS-CoV清除的先天免疫途径的激动剂和拮抗剂。

仅使用骆驼气管细胞来研究宿主- mers - cov相互作用可能还不够，因为至少在体内，感染的鼻上皮细胞能够显著上调IFN基因的转录表达[22，24］．因此，开发鼻腔外植体和分化良好的鼻腔上皮细胞模型是充分了解上皮屏障与骆驼MERS-CoV感染之间相互作用的必要条件。在这方面，外植体模型可能更好地反映体内情况，因为粘膜和粘膜下层都是共同培养的，以维持组织结构。尽管如此，AEC和气管外植体模型克服了上皮细胞系固有的自然生理缺陷，包括细胞极化、睫状体协调活性和根尖与空气接触的差异[39］．此外，从单一动物获得的组织块可用于多次重复，从而减少实验变异性和所用动物数量，符合3Rs原则[40］．

综上所述，利用ATE建立了一种新的体外培养模型，适用于研究MERS-CoV在自然宿主体内的感染和复制。我们证明了ATE可以被MERS-CoV感染而不触发先天性抗病毒反应。此外，ATE还可用于研究骆驼类的其他呼吸道病原体，减轻实验动物的负担。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据可根据合理要求从作者处获得。

缩写

原子能委员会:

假分层气道上皮细胞

吃:

羊驼气管外植体

BSL-3:

生物安全三级

CM:

文化传媒

DPP4:

二肽基肽酶4

现病史:

小时post-inoculation

干扰素:

干扰素

包含IHC:

免疫组织化学

研究小组:

干扰素刺激基因

轻轨交通:

下呼吸道

MERS-CoV:

中东呼吸综合征冠状病毒

TCID50：

50%组织培养感染剂量终点

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下载参考

确认

我们感谢Erasmus医疗中心(EMC，鹿特丹)的Bart L. Haagmans博士提供MERS-CoV卡塔尔-15/2015株。我们也感谢Hans Nauwynck博士和他的实验室(根特大学兽医学院病毒学实验室)的工作人员提供体外培养的高级培训。我们特别感谢IRTA-CReSA (Cerdanyola del Vallès，巴塞罗那)BSL-3生物控制动物设施的工作人员。

资金

这项研究得到了欧盟委员会的支持:[呼吁:H2020-INFRAIA-2016-2017资助N°:731014，创新药物计划(IMI)资助N°115760]。IRTA由CERCA方案/加泰罗尼亚Generalitat提供支助。港大获中国国家留学基金委(CSC)资助。201608150108)。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

作者信息

作者指出

  1. Nigeer Te和Jordi Rodon对这项工作做出了同样的贡献

作者及隶属关系

  1. Unitat Mixta d 'investigació IRTA-UAB动物卫生中心，动物卫生中心(CReSA)， Universitat Campus de la Autònoma de Barcelona (UAB)， 08193, Bellaterra，加泰罗尼亚，西班牙

    Nigeer Te, Jordi Rodon, Rhea Creve, Mónica Pérez, Joaquim Segalés, Júlia Vergara-Alert & Albert Bensaid

  2. IRTA，动物卫生项目，动物卫生研究中心(CReSA)，巴塞罗那大学校园Autònoma (UAB)， 08193，贝拉特拉，加泰罗尼亚，西班牙

    Nigeer Te, Jordi Rodon, Rhea Creve, Mónica Pérez, Júlia Vergara-Alert & Albert Bensaid

  3. 动物卫生解剖系，Veterinàriaia学院，Autònoma巴塞罗那大学(UAB)， UAB校区，08193，贝拉特拉，加泰罗尼亚，西班牙

    乔奎姆西格尔

  4. 香港大学李嘉诚医学院公共卫生学院，中国香港

    Nigeer Te

作者
  1. Nigeer Te
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  2. 乔迪Rodon
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  3. 土卫五Creve
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  4. 莫妮卡·佩雷斯
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  5. 乔奎姆西格尔
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  6. 茱莉亚Vergara-Alert
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  7. 艾伯特Bensaid
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贡献

NT, JR, JS, JV-A和AB设计研究;NT、JR、MP、JS和JV-A进行了研究;NT、JR、RC、MP、JS、JV-A、AB分析数据;NT和AB写了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到茱莉亚Vergara-Alert．

道德声明

伦理批准并同意参与

作者确认，正如杂志的作者指南页面所指出的那样，杂志的伦理政策已经得到遵守。所有的动物实验都得到了IRTA伦理和动物福利委员会(CEEA-IRTA)和加泰罗尼亚自治政府动物实验伦理委员会的批准。CEA-OH / 10943/1)。涉及中东呼吸综合征冠状病毒的工作是在西班牙巴塞罗那的IRTA-CReSA生物遏制单位的BSL-3设施进行的。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

额外的信息

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

补充信息

附加文件1:

ATE的病毒载量(UpE和mmrna)和先天免疫应答基因Fc．

附加文件2:

免疫组化检测ATE中MERS-CoV N蛋白．

权利和权限

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限

关于本文

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引用本文

Te, N, Rodon, J, Creve, R。et al。评价羊驼气管外植体作为中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染研究的体外模型。兽医Res5367(2022)。https://doi.org/10.1186/s13567-022-01084-3

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关键字

  • 气液界面
  • 羊驼
  • 骆驼科
  • 体外模型
  • MERS-CoV
  • 气管移植组织

兽医研究

ISSN: 1297 - 9716

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