Orf1B控制T3SS蛋白的分泌，并参与gydF4y2Ba爱德华菌属piscicidagydF4y2Ba与上皮细胞的粘附gydF4y2Ba

爱德华菌属piscicidagydF4y2Ba是一种革兰氏阴性肠道病原体，可引起鱼类出血性败血症。III型分泌系统(T3SS)是其两个最重要的毒力岛之一。T3SS蛋白EseJ抑制gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba通过负调节1型菌膜与上皮瘤乳头状瘤(EPC)细胞的粘附。1型被毛有帮助gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba附着在鱼的上皮细胞上在这项研究中，我们鉴定了一种功能性未知蛋白(Orf1B)编码于gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．该蛋白由122个氨基酸组成，与YscO在结构上具有相似性gydF4y2Ba弧菌parahaemolyticusgydF4y2Ba．Orf1B控制T3SS易位和效应物的分泌gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．通过免疫沉淀，Orf1B被证明与T3SS atp酶EsaN相互作用。这种相互作用可能有助于atp酶复合物的组装，从而激活T3SS蛋白的分泌。此外，Orf1B的破坏显著减少gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba由于EseJ在EPC细胞内的稳态蛋白水平增加，使其粘附在EPC细胞上gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．综上所述，本研究部分揭示了Orf1B促进T3SS蛋白分泌的机制gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba附着力。本研究有助于提高我们对肿瘤分子机制的认识gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba发病机理。gydF4y2Ba

爱德华菌属piscicidagydF4y2BaPPD130/91，以前称为gydF4y2Ba迟缓gydF4y2BaPPD130/91 [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba是一种胞内细菌，属于肠杆菌科。基于表型鉴定、DNA-DNA杂交和系统发育分析，gydF4y2Ba获得性迟发性大肠gydF4y2Ba菌株进一步分为3种gydF4y2Ba获得性迟发性大肠gydF4y2Ba，gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba和gydF4y2Ba大肠anguillarumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]gydF4y2Ba．获得性迟发性大肠gydF4y2Ba感染人类，既不具有T3SS也不具有VI型分泌系统(T6SS)基因簇[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]；gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba可感染多种淡水及海洋鱼类，引起出血性败血症，主要见于日本比目鱼(gydF4y2BaParalichthys olivaceusgydF4y2Ba)及大比目鱼(gydF4y2BaScophthalmus马克西姆斯gydF4y2Ba)，其基因组中只分布一组T3SS和T6SS基因簇[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]；gydF4y2Ba大肠anguillarumgydF4y2Ba感染鳗鱼，它获得了肠细胞湮没(LEE)基因的位点，包含2组T3SS和3组T6SS基因簇[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

大肠piscicidagydF4y2Ba能够侵入上皮细胞和吞噬细胞，如上皮瘤乳头状瘤(EPC)细胞、HEp-2细胞和小鼠巨噬细胞J774A。1 cells [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。III型分泌系统(T3SS)是两种最重要的毒力因子之一gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。T3SS是一种跨越膜的大分子机器，由20多种不同的蛋白质组成，通过它将效应物传递到宿主细胞中引起感染[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。三种转座子蛋白(EseB、EseC和EseD)和两种效应蛋白(EseJ和EseG)在该蛋白中编码gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaT3SS基因簇[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在宿主细胞存在的情况下，EseB、EseC和EseD可在宿主膜上形成孔，效应器可通过孔转运。在没有宿主细胞的情况下，EseB形成丝状附属物并介导细胞内的自聚集和生物膜形成gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。EsaN是一种激活T3SS底物运输的atp酶[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。删除易位基因，例如gydF4y2BaeseBgydF4y2Ba，gydF4y2BaeseCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba西文gydF4y2Ba或者atp酶基因gydF4y2BaesaNgydF4y2Ba，增加50%致死剂量(LD)gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)，以约1根蓝gourami鱼为食[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。EseJ里面gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba通过对1型菌毛的负调控抑制其对EPC细胞的粘附[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba1型毛主要亚基FimA参与其与鱼类上皮细胞的粘附[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的功能gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba的T3SS基因簇内gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba仍然不明朗。Orf1B与EscO的肠致病性有相似之处gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(EPEC)， sp13 ofgydF4y2Ba弗氏志贺菌gydF4y2Ba，垃圾邮件/邀请gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2BaSPI-1 (gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba致病性岛1)，结构类似于gydF4y2Ba弧菌parahaemolyticusgydF4y2Ba鞭毛;EscO由肠细胞湮没(LEE)致病性岛基因编码，对EPEC中所有类型的T3SS底物的分泌至关重要，此外，EscO与atp酶EscN相互作用并刺激EscN酶活性[qh]gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。Spa13与atp酶Spa47、c环蛋白Spa33和细胞膜蛋白Spa40相互作用。此外，Spa13可以稳定针蛋白MixH，从而影响III型蛋白的分泌[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。SpaM是高效分泌转座子蛋白SipB和SipC以及效应蛋白SipA、SipD和SptP所必需的gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2BaSPI-1 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba鼠疫gydF4y2BaYscO与针长控制蛋白YcsP相互作用控制Yop分泌[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，而atp酶YscN的组装不需要YscO [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。FliJ的英文:gydF4y2Ba沙门氏菌血清gydF4y2Ba血清型鼠伤寒与FoF1-ATP合成酶的γ亚基非常相似，FliJ通过结合到环的中心促进FliI (atp酶)六聚体环的形成[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

本研究对Orf1B进行了功能表征，发现Orf1B可能通过与T3SS ATPase EsaN相互作用促进T3SS蛋白的分泌，通过控制内部EseJ的稳态蛋白水平，促进其粘附上皮细胞gydF4y2Ba大肠piscicida。gydF4y2Ba

菌株和培养gydF4y2Ba

本研究使用的菌株和质粒列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaPPD130/91 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]在28℃的胰蛋白酶豆汤(TSB, BD Biosciences)中培养gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株在Luria-Bertani肉汤(LB, BD Biosciences) 37°C。要激活T3SS，gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba菌株在25°C Dulbecco modified Eagle培养基(DMEM, Invitrogen)中培养，CO浓度为5% (vol/vol)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的气氛。根据需要，以以下浓度补充抗生素:12.5 μg/mL粘菌素(Col;Sigma)， 34 μg/mL氯霉素(Cm;Sigma)，庆大霉素50 μg/mL (Gem;50 μg/mL卡那霉素(Km;σ)。gydF4y2Ba

细胞及培养条件gydF4y2Ba

EPC单元[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]在28°C的M199培养基(HyClone)中生长，培养基中添加10%的热灭活胎牛血清(FBS, Gibco)， CO浓度为5% (vol/vol)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的气氛。gydF4y2Ba

缺失突变体、互补和质粒的构建gydF4y2Ba

本研究使用的引物列于表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．非极性gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba缺失突变体是由gydF4y2BasacBgydF4y2Ba基于等位基因交换[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。简单地说，引物对gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba——/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-int-rev,gydF4y2Baorf1BgydF4y2Baint作为/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-rev生成了一个845 bp的片段，其中包含的上游区域gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba和一个754 bp的片段，包含gydF4y2Baorf1BgydF4y2BaPPD130/91基因组DNA。在侧翼DNA片段中引入一个16bp的重叠序列，通过引物进行第二次PCR，使上游和下游区域融合在一起gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba——和gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba牧师。将所得PCR产物连接到自杀载体pRE112上[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，然后被转化为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaS17-1λpir。通过共轭，一个ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba菌株在10%蔗糖-胰蛋白酶大豆琼脂板上筛选，经PCR和测序验证。突变株在TSB和DMEM培养基中均无生长缺陷。gydF4y2Ba

得到覆盖核糖体结合位点的DNA序列，血凝素标签(HA标签，序列:YPYDVPDYA)和gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba通过引物对，首次从PPD130/91基因组DNA中获得两个PCR片段gydF4y2Baorf1BgydF4y2Bacom,加上gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-com-int-rev,gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-com-int-for +gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-com-rev，与引物对重叠gydF4y2Baorf1BgydF4y2Bacom,加上gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-com-rev，然后插入pACYC184 (Amersham)。pACYC184-HA -gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba所得被引入ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变得到ΔgydF4y2Baorf1B / orf1BgydF4y2Ba应变;小鼠抗ha抗体免疫印迹法证实HA-Orf1B的表达。gydF4y2Ba

共聚焦显微镜黏附测定gydF4y2Ba

按照Xie等人的方法进行粘附试验。[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。简单地说，EPC单层膜用预热的M199培养基(28°C)洗涤一次，用10的感染倍数(MOI)感染gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaPPD130/91菌株wt/pACYC184， ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/pACYC184和ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。感染30min后，将EPC单层膜清洗3次，用4%多聚甲醛(PFA)固定，用小鼠抗lps抗体和Alex 488山羊抗小鼠IgG (Invitrogen)染色。在三次重复实验中，从两个孔中检测每种感染条件的粘附率。共聚焦激光扫描显微镜(Leica SP8)下，从两个重复随机拍摄14张图像。显示了一个代表性实验的代表性图像和均数±标准差(SD)。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba采用检验方法分析两组间的差异。gydF4y2Ba

为了制备小鼠抗LPS抗体，从30ml LPS中按照生产商的方案(Bestbio)分离LPSgydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaPPD130/91在TSB中培养，按照Gao等人的描述在8只6周龄的naïve C57BL/6小鼠(中国大安公司)中制备LPS抗体[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

定量逆转录pcrgydF4y2Ba

通宵培养gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaWT菌株ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变，和ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba将菌株按1:100的比例传代到10 mL DMEM中，在25℃、5% (vol/vol) CO条件下生长gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba每个菌株取3个重复的细菌。用RNeasy Mini Kit (Qiagen)按照制造商的方案分离总RNA，然后用DNase I处理以消除基因组DNA污染物。在RNA逆转录上，9个cDNA文库(WT-1, WT-2, WT-3， ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba1,ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba2,ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba3,ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba1,ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-2和ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba-3)。采用SYBR绿色试剂，在CFX96实时PCR系统(Bio-Rad)上进行实时PCR。qPCR在95°C下运行10 min，然后进行40个循环，95°C 15 s, 58°C 20 s, 72°C 30 s, 75.5°C 5 s。将mRNA表达水平与16S rRNA基因表达水平归一化。的相对转录水平gydF4y2BaeseJgydF4y2Ba在ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba和ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba然后使用公式2计算与WT中的菌株相比较的菌株gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}式中，CT为阈值周期，ΔΔCgydF4y2Ba_TgydF4y2Ba等于C的变化量gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba(ΔCgydF4y2Ba_TgydF4y2Ba)为ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba或ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变减ΔCgydF4y2Ba_TgydF4y2Ba对于野生型来说。的gydF4y2BatgydF4y2Ba采用SPSS软件进行的检验计算gydF4y2BaPgydF4y2Ba值，假设平均值为1.0。所示数据为三个重复样本的平均值±SD。gydF4y2Ba

表达与分泌试验gydF4y2Ba

通宵培养gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba将菌株按1:100的比例传代到DMEM中，在25°C下静培养24 h。按照Zheng和Leung的方法制备总细菌蛋白(TBP)和细胞外蛋白(ECP) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]然后用小鼠抗DnaK抗体1:2000(应激源)和兔抗EseJ抗体1:2000进行免疫印迹[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]， EseG 1:2000 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]， EseB 1:2000 [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]， EseC 1:2000 [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，在1:2000 [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]及EvpC 1:2000 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG (Millipore)，稀释比例为1:50 000。gydF4y2Ba

共免疫沉淀(Co-IP)测定gydF4y2Ba

的染色体拷贝gydF4y2BaesaNgydF4y2Ba或gydF4y2BaeseEgydF4y2Ba在gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba用Red重组系统标记了3 × FLAG表位[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。pACYC184-HA -gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba被引入到每个构建菌株中。WTgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba::3 × flag /gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba和WTgydF4y2BaeseEgydF4y2Ba::3 × flag /gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba用抗flag抗体进行免疫印迹验证。20 mL WT培养的细菌颗粒gydF4y2BaesaNgydF4y2Ba::3 × flag /gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba或WTgydF4y2BaeseEgydF4y2Ba::3 × flag /gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba用磷酸盐缓冲盐水(PBS)加1.0 mM苯甲磺酰氟(PMSF)重悬菌株。超声处理后，细胞裂解液在16000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将上清液与终浓度为1%的NP-40混合30分钟，然后用蛋白g固定珠(Thermo)在4℃下预清1小时。将预先清除的细胞裂解物用抗ha抗体沉淀4小时，然后用蛋白G固定珠孵育过夜。洗涤4次后重悬于1 × SDS样品缓冲液中，对HA标记和FLAG标记进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba

蓝葫芦鱼的单株感染gydF4y2Ba

naïve蓝葫芦鱼的单株感染[j]gydF4y2BaTrichogaster trichopterusgydF4y2Ba(Pallas)](11.92±1.62 g)，以探讨Orf1B在肝癌发病机制中的作用gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．健康蓝gourami鱼在25±0.5°C中保存。的gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaWT和ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba将菌株按1:20的比例传代至TSB中过夜，在28℃下培养3 h。用PBS洗涤3次，ODgydF4y2Ba_540gydF4y2Ba数值调整为0.5。以4.5 × 10的剂量肌肉注射等量的细菌gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU注入每条鱼，每组20条鱼。实验独立进行了三次，给出了一个有代表性的数据。采用Long-rank (Mantel-Cox)试验评估鱼的存活率差异。gydF4y2Ba

鱼类实验严格按照《中国科学院实验动物护理使用指南》的建议进行。本方案经水生生物研究所动物实验伦理委员会批准(许可证号E0110305)。gydF4y2Ba

Orf1B和EsaN的序列分析gydF4y2Ba

的gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba基因位于上游gydF4y2BaesaPgydF4y2Ba和gydF4y2BaesaQgydF4y2Ba下游gydF4y2BaesaNgydF4y2Ba，gydF4y2BaesaVgydF4y2Ba,gydF4y2Ba翻gydF4y2Ba在gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaT3SS基因簇(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。编码14.20 kDa蛋白，pI为8.04。使用SWISS-MODEL分析[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]， Orf1B在结构上与一种推定的III型蛋白YscO具有13.45%的同源性gydF4y2Ba诉parahaemolyticusgydF4y2Ba9.09%与flj蛋白同源，flj蛋白是一种鞭毛III型出口器官gydF4y2Ba美国血清gydF4y2Ba型沙门氏菌感染。Orf1B与EsaN的相似性分析显示Orf1B蛋白与EsaN的肠致病性具有相似性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(EPEC)， sp13 ofgydF4y2Ba弗氏志贺菌gydF4y2Ba，垃圾邮件/邀请gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba的SPI-1和YscOgydF4y2Ba鼠疫的伪gydF4y2Ba分别为26.4%、24.1%、20.8%和32.5%，而T3SS ATPase EsaN与InvC有相似之处gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba， Spa47 ofgydF4y2Ba志贺氏杆菌gydF4y2Ba的;的gydF4y2Ba鼠疫gydF4y2Ba， EPEC的EscN分别增长41.6%、43.4%、53.5%和49.3%(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Orf1B在T3SS蛋白分泌中起关键作用gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba

为了探究Orf1B蛋白的表型，gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaWT菌株ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变,ΔgydF4y2Baorf1B / orf1BgydF4y2Ba应变，和ΔgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba将菌株传代到DMEM中，并在传代24 h后比较各菌株的自聚集情况。EsaN是一种激活T3SS底物运输的atp酶[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2BaA, WT和Δ的文化gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba/gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba菌株沉淀到玻璃管的底部，它们的上清变得清晰，然而，Δ的培养gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba和ΔgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba菌株仍然多云。这表明Orf1B的破坏消除了它的自动聚集。Autoaggregation的gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba是由T3SS易位蛋白EseB介导的[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。探讨是否删除gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba影响四种培养基上清液EseB的分泌gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba收集上述菌株，在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上比较其细胞外蛋白谱。如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2BaB, T3SS转座蛋白EseB、EseC、EseD和T3SS效应蛋白EseJ均未从Δ中分泌gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba或ΔgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba菌株;Δ的补充gydF4y2Baorf1BgydF4y2BapACYC184-HA-gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba使它们的分泌恢复到野生型菌株的水平。gydF4y2Ba

删除gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba影响T3SS易位子和效应子的稳态蛋白水平?为了解决这个问题，从这四种菌株中提取相似数量的细菌微球(TBP)和细胞外蛋白(ECP)进行免疫印迹。EvpC是一种通过T6SS而非T3SS分泌的主要蛋白，被用作负载对照[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在Δ TBP中观察到T3SS易位子EseB/EseC/EseD和效应体EseJ蛋白水平升高gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变或ΔgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba与WT菌株相比。Δ的补充gydF4y2Baorf1BgydF4y2BapACYC184-HA-gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba将T3SS易位子和效应子恢复到野生型菌株的水平(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaC，左图)。T3SS易位EseB/EseC/EseD和T3SS效应体EseG和EseJ均未从Δ中分泌gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变或ΔgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba应变(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaC，右面板)。DnaK是一种细菌细胞质标志物。在所有ECP中未检测到DnaK，这表明T3SS易位子和效应物的检测不是由于细菌颗粒的泄漏。综上所述，这些数据表明，像EsaN一样，Orf1B对于gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaOrf1B的破坏阻断了T3SS易位子和效应子的分泌，导致它们在体内积累gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

通过共免疫沉淀发现Orf1B与EsaN相互作用gydF4y2Ba

考虑到Orf1B的几个同源物与atp酶相互作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，通过免疫沉淀法研究Orf1B与T3SS ATPase EsaN的相互作用。WTgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba::3 × flag /gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba和WTgydF4y2BaeseEgydF4y2Ba::3 × flag /gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba收集在DMEM中培养的菌株，并对其进行超声处理以产生细胞裂解物。这些细胞裂解液用抗ha抗体免疫沉淀(IP)(兔，左图)。同时，我们用兔免疫前血清(作为对照，右图)进行了协同免疫(co-IP)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。HA-Orf1B蛋白用抗ha抗体检测，EsaN-3 × FLAG或EseE-3 × FLAG用抗FLAG抗体检测。观察到EsaN-3 × FLAG被HA-Orf1B沉淀，EseE-3 × FLAG也被HA-Orf1B沉淀。同时，HA-Orf1B与EseE-3 × FLAG的相互作用是非特异性的，与兔免疫前血清的共ip也检测到这种相互作用。这可能是由于内部的EseE蛋白质含量过高gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．综上所述，Orf1B特异性地与EsaN蛋白相互作用gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Orf1B有助于gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba与EPC细胞的粘附gydF4y2Ba

爱德华菌属piscicidagydF4y2Ba能够附着并侵入EPC细胞[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。为了研究Orf1B是否在这一过程中发挥作用，我们用WT菌株Δ感染了EPC细胞gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变和ΔgydF4y2Baorf1B / orf1BgydF4y2Ba菌株和细胞相关gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba对菌株进行定量分析。结果发现细胞相关ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba菌株比野生型低11±0.74倍。Δ的补充gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变的粘附力部分提高到野生型应变的水平(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaA和B)，这表明Orf1B有助于gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba与EPC细胞的粘附。gydF4y2Ba

T3SS蛋白EseJ负性调控gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba从细菌内附着EPC细胞[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。通过免疫印迹法检测3株菌株的TBP和ECP，观察到Δ中EseJ的稳态蛋白水平gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba与WT菌株或Δ相比，该菌株的生长量明显增加gydF4y2Baorf1B / orf1BgydF4y2Ba在TSB中培养菌株，Δ未分泌EseJgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaC).以T6SS分泌的蛋白EvpC作为蛋白加载对照。在所有ECP中均未检测到细胞质蛋白DnaK，提示从WT菌株的ECP或Δ中检测到的EseJgydF4y2Baorf1B / orf1BgydF4y2Ba菌株不是由于细菌颗粒渗漏造成的。探讨Orf1B是否调控gydF4y2BaeseJgydF4y2Ba的转录水平gydF4y2BaeseJgydF4y2Ba在WT中，ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2BaStran和ΔgydF4y2Baorf1B / orf1BgydF4y2Ba比较菌株。如图所示gydF4y2Ba4gydF4y2BaD，各品系间无显著差异gydF4y2BaeseJgydF4y2Ba检测到转录。综上所述，这些数据表明EseJ蛋白在Δ中积累gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba菌株因其分泌受阻导致粘连下降gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba到EPC单元。gydF4y2Ba

Orf1B有助于gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba体内发病机制gydF4y2Ba

目的:探讨Orf1B基因在乳腺癌发病机制中的作用gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba研究了细菌感染后蓝葫芦鱼的存活率。每条蓝gourami鱼注射4.5 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU的gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．感染10天后，10%感染野生型菌株(WT)的鱼存活，而85%感染野生型菌株(WT)的鱼存活gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2BaΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变幸存了下来。值得注意的是，感染WT菌株的蓝葫芦在感染后2天开始死亡，并且在第2天至第4天死亡率急剧上升，而感染Δ的蓝葫芦死亡率较低gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba压力。显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba感染WT的蓝葫芦鱼存活曲线与Δ之间存在< 0.001)gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba菌株(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。这表明删除gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba显著降低毒力gydF4y2Ba淡水鱼的gydF4y2BaPPD130/91。gydF4y2Ba

细菌III型分泌机用于将细菌细胞质中的效应蛋白直接转运到真核细胞中[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]， T3SS易位子和效应子的分泌受到严格控制[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。在本研究中，我们证明Orf1B通过与atp酶蛋白EsaN相互作用，控制T3SS易位和效应子的分泌，Orf1B参与了gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba通过促进EseJ的分泌来促进粘附。gydF4y2Ba

的自动聚合gydF4y2Ba大肠picicidagydF4y2Ba分别在Δ中废除DMEM培养gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变或ΔgydF4y2BaesaNgydF4y2Ba因为它们分泌EseB失败。分泌的EseB在…表面形成细丝gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba不同细菌之间的EseB丝之间的连接介导了细菌的自聚集和生物膜的形成gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。除了EseB外，Δ不能分泌T3SS转座蛋白EseC/EseD和T3SS效应蛋白EseJgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba应变;相反，在Δ中检测到EseB/EseC/EseD和EseJ的稳态蛋白水平升高gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba与WT菌株进行比较。在Δ中观察到类似的蛋白质谱gydF4y2BaesaNgydF4y2Ba像Δ一样用力gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba压力。这使我们推测Orf1B要么作为一种装置起作用，要么伴随着T3SS atp酶EsaN。gydF4y2Ba

Orf1B的破坏导致T3SS蛋白分泌失败gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba，这与其同源基因EscO、Spa13、YscO、SpaM和FliJ的表型相似[j]。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。EPEC的EscN形成不对称环，T3SS内茎蛋白EscO coli在EscN的c端结构域与EscN相互作用，刺激其ATP水解活性，激活T3SS蛋白的分泌[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。Spa13始终与atp酶Spa47相互作用gydF4y2Ba弗氏志贺菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。然而,gydF4y2Ba鼠疫gydF4y2Baatp酶YscN的组装不需要YscO [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]， YscO与伴侣蛋白SycD相互作用，其与针长控制蛋白YscP的相互作用对III型蛋白的分泌至关重要[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。在本研究中，我们提供了Orf1B与T3SS ATP酶EsaN相互作用的证据，推测Orf1B通过刺激EsaN的ATP水解活性，促进了T3SS蛋白的分泌gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细菌与界面的粘附是致病性感染的第一步，细菌利用多种表面结构促进界面的粘附。Yfco菌毛增强了禽病原的粘附和定植gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(APEC)体内和体外[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。振动水平改变了材料的附着力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba到接口[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。1型被膜在gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba与上皮细胞的黏附[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。通过抑制1型菌毛，T3SS蛋白EseJ抑制gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba对宿主上皮细胞的粘附作用[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在本研究中，观察到Δ粘连降低gydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba菌株与WT菌株比较。基于事实的转录水平gydF4y2BaeseJgydF4y2Ba当Orf1B被破坏时，EseJ的稳态蛋白水平没有改变，并且在ΔgydF4y2Baorf1BgydF4y2Ba与野生型相比，Orf1B促进了gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba通过促进EseJ分泌来粘附。gydF4y2Ba

总之，我们已经证明Orf1B与T3SS atp酶蛋白EsaN相互作用。这种相互作用可能为T3SS易位子和效应子的分泌提供能量，从而有助于gydF4y2Ba大肠piscicidagydF4y2Ba粘附和发病机制。gydF4y2Ba

本研究中产生或分析的所有数据均纳入本文。gydF4y2Ba

我们非常感谢刘陆毅博士提供的技术援助。gydF4y2Ba

基金资助:国家自然科学基金(批准号:32073018);CARS-46)。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 王龙坤和孙珊珊对这项工作的贡献相同gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 大连海洋大学，辽宁大连116023gydF4y2Ba

   王龙坤gydF4y2Ba

2. 中国科学院武汉水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉430072gydF4y2Ba

   王龙坤，孙珊珊，张淑雅，聂品，谢海霞gydF4y2Ba

3. 中国科学院大学先进农业科学学院，北京101408gydF4y2Ba

   孙珊珊，张淑雅gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

LKW和SSS进行实验，分析数据，撰写论文。SYZ构建了WT菌株gydF4y2BaesaNgydF4y2Ba* 3 × FLAG和WTgydF4y2BaeseEgydF4y2Ba::3 ×旗。HXX和PN设计了实验。SSS, LKW和HXX修改了稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba谢海霞gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba