α -突触核蛋白在多系统萎缩中表现出广泛的异质性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

多系统萎缩(MSA)是一种神经退行性疾病，其特征是帕金森病、自主神经功能衰竭、小脑共济失调和锥体特征的不同组合。虽然突触核蛋白病的分布与主要的临床特征相关，但病理负担并不能完全解释所观察到的临床表现和疾病进展速度的差异。我们假设MSA的临床异质性是不同患者之间和不同大脑区域之间α-突触核蛋白种子活性差异的结果。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

使用无细胞扩增法可靠地检测来自MSA的α-突触核蛋白种子活性仍然具有挑战性。因此，我们对168种不同的反应缓冲液进行了系统评估，使用一系列pH值和盐，并使用来自一名MSA和一名PD患者的完全特征的脑匀浆进行了种子。然后，我们在40例神经病理确诊病例(包括15例MSA)的更大队列中验证了赋予PD和MSA衍生样本最佳区分能力的两个条件。最后，在大脑的一个子集中，我们对MSA的播种行为进行了首次多区域分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

利用我们的新缓冲条件，我们证明了控制α-synuclein体外扩增的物理化学因素可以被定制，以产生菌株特异性反应缓冲，可用于可靠地研究msa衍生的α-synuclein的播种能力。使用这种新方法，我们能够将15个MSA大脑分为3组:高种子、中等种子和低种子。为了进一步证明α-synuclein在MSA中播撒的异质性，我们对2个高播撒者、2个中等播撒者和2个低播撒者在13个不同地区的α-synuclein播撒进行了全面的多区域评价。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们在一组神经病理可比较的MSA大脑中发现了种子能力α-突触核蛋白的意外差异。此外，我们的工作揭示了种子活动的巨大异质性，由pbs可溶性α-突触核蛋白驱动，在给定个体的不同大脑区域之间，这超出了免疫组织化学观察。我们的观察为MSA的未来亚分类铺平了道路，它超越了传统的临床和神经病理表型，并考虑了α-突触核蛋白存在的结构和生化异质性。最后，我们的方法为开发急需的、快速和敏感的MSA诊断分析提供了一个实验框架。gydF4y2Ba

多系统萎缩(MSA)是一种进行性神经退行性疾病，临床表现为帕金森病、小脑和自主神经功能障碍的各种组合[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．MSA一词于1969年被创造出来，用于汇集先前描述的神经实体[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba];然而，主要常见的亲银性少突细胞胶质细胞质包裹体(gci)，称为pap - lantos体，有助于疾病的分类学定义[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．140个氨基酸蛋白质α-突触核蛋白作为这些包涵体的主要成分，将MSA与路易体疾病联系起来，如帕金森病(PD)和路易体痴呆(DLB) [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．总的来说，这些疾病现在被称为突触核病。路易体疾病与MSA有明显的细胞病理学区别。尽管这两种情况都在多种细胞类型中积累α-突触核蛋白，MSA的特征是少突细胞包涵体，而神经元α-突触核蛋白病理在路易体疾病中占主导地位。此外，最近的研究还发现了α-突触核蛋白“多态性”的存在，提示在朊病毒疾病中存在不同的菌株，这可能是在这些条件下发现表型多样性的基础。假设不同菌株的存在决定了每个个体中病理的细胞间传播和病理α-突触核蛋白的细胞影响[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．与这一观点一致，许多实验结果表明，与路易体相关的α-synuclein相比，形成α-synuclein的GCIs具有更强的播种活性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．此外，最近使用冷冻电子显微镜的发现显示了MSA中发现的聚集物与DLB大脑中发现的聚集物之间的结构差异[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

近年来，种子扩增试验已成为检测微量错误折叠的疾病相关蛋白或种子的可靠方法，如朊病毒蛋白、tau蛋白和α-突触核蛋白[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这些检测也被称为实时地震诱导转换(RT-QuIC)和蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)，利用自繁殖的特性来扩增，然后灵敏地检测这些蛋白质种子的微量[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．在检测过程中的多个时间点实时检测硫黄素T (ThT)荧光，可以测量不同样品播种特性之间的动力学差异，从而为是否存在疾病相关蛋白提供高度特异性的表征。然而，尽管这些测定方法在路易体疾病中持续检测α-突触核蛋白种子方面具有可靠性，但使用了各种生物样本[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，尝试在MSA中检测α-synuclein已被证明具有挑战性。Van Rumund等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba在MSA中，只有6/17的脑脊液(CSF)样本中α-synuclein RT-QuIC阳性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，而罗西等人gydF4y2Ba．gydF4y2BaMSA检测到RT-QuIC阳性CSF样本数量更少(2/29)[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．相比之下，使用PMCA超过350小时，Shahawanaz等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba能够在65/75 MSA CSF样本中检测到α-突触核蛋白播种活性，但注意到尽管聚合速度更快，MSA CSF和脑样本的荧光平台低于PD CSF和脑样本[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．这些不同的发现可能是这些研究中使用的反应缓冲液的不同条件的结果。因此，在本研究中，我们试图通过系统地调节α-synuclein RT-QuIC反应缓冲液的离子和阳离子组成以及pH来确定有利于MSA播种活性的最佳测定条件。离子组成和pH值对α-突触核蛋白聚集的影响已被广泛研究[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，但在用MSA和PD的脑匀浆播种的反应缓冲谱进行系统比较的背景下却没有。gydF4y2Ba

人体组织样本gydF4y2Ba

15名MSA患者，15名PD患者，5名对照组和5名核上进行性麻痹患者，根据明确的神经病理诊断，从大学健康网络-神经退行性脑收集(UHN-NBC，多伦多，加拿大)和Navarrabiomed脑库(西班牙潘普洛纳)中选择。死亡年龄，性别和完整的神经病理检查列在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1。采集人脑解剖组织时需征得患者或其亲属的知情同意，并经当地机构审查委员会批准。这项研究得到了大学卫生网络研究伦理委员会(no . 20-5258)的批准。在纳入研究之前，根据神经退行性疾病和共同病理的诊断标准进行了系统的神经病理检查[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．对侧半球在尸检时被冠状切片，并立即冷冻并在−80°C保存。使用4毫米的脑组织打孔器，对以下区域进行微观解剖:前扣带皮层、前扣带白质、额叶皮层、额叶白质、壳核、苍白球、杏仁核、海马体、颞叶皮层、颞叶白质、黑质(SN)、脑桥基底和小脑白质。所有冲子都储存在低蛋白结合管中(Eppendorf, Hamburg, Germany)，立即闪冻并在- 80°C下储存。gydF4y2Ba

蛋白质的提取gydF4y2Ba

对于PBS可溶部分，将40-50 mg冷冻的微解剖组织在湿冰上解冻，然后立即在温和- macs Octo Dissociator (Miltenyi BioTec, Auburn, CA)中均质500 μl PBS中加入蛋白酶(Roche, Basel, Switzerland)和磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific, Waltham, MA)。将匀浆转移到1.5 ml的低蛋白结合管(Eppendorf)中，在10,000下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba如前所述，在4°C下加热10分钟[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．然后，收集上清液，并在0.5 ml低蛋白结合管(Eppendorf)中进行混叠，以避免过度的冻融循环。如前所述，使用1克冷冻脑组织从MSA患者的三个大脑区域(小脑、壳核和额叶皮层)中提取萨科齐不溶性物质[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．采用双辛酸蛋白(BCA)测定法(Thermo Scientific)测定所有等分物的总蛋白浓度。gydF4y2Ba

组织学分析gydF4y2Ba

福尔马林固定的4微米厚的石蜡包埋组织切片，包含选择用于微解剖的13个解剖区域(见上文)。除Hematoxylin和Eosin-Luxol Fast Blue外，小鼠聚集α-synuclein (5G4;1:4000;Roboscreen，莱比锡，德国)，硝化突触核蛋白(Syn514;1:20 00;Biolegend, San Diego, CA)， c端截断的x-122 α-synuclein (A15127A;1:20 00;bioolegend)和磷酸化-α-synuclein (pSyn#64;1:10,000;采用FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，大阪，日本)进行免疫组化。 To map the co-pathology, the following mouse monoclonal antibodies were used: anti-tau AT8 (pS202/pT205; 1:1000; Thermo Scientific), anti-phospho-TDP-43 (pS409/410; 1:2000; Cosmo Bio, Tokyo, Japan) and anti-Aβ (6F/3D; 1:50; Dako, Santa Clara, CA). The DAKO EnVision detection kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse (Dako) was used to visualize the antibody staining. For comparison of different α-synuclein antibodies, immunostained sections against nitrated, truncated, phosphorylated, and aggregated (5G4) α-synuclein were scanned using Tissuescope™ and were cropped with the HuronViewer™ (Huron, Saint Jacobs, Canada). Images were taken from the exact same location of the putamen and cerebellum across the different antibodies. Initially, 100 immunoreactive oligodendrocytes from each antibody, region and case with visible nucleus were optically dissected using Photoshop (2021, Adobe, San Jose, CA). Using Image J (NIH, Bethesda, MD), the minimum and maximum areas (px^2gydF4y2Ba)的100个内含物被记录。测量了单位夹杂物的黑点密度。5G4染色，采用α-突触核蛋白免疫组化方法检测上述13个脑区α-突触核蛋白聚集量、GCI和神经元细胞质包涵体(NCI)负荷。对于半定量分析，我们使用了4点量表:0，缺席;1、温和;2、温和;3、严重的，如前所述[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ELISAgydF4y2Ba

人α-Synuclein Patho和Total elisa试剂盒(Roboscreen，莱比锡，德国)根据制造商的方案使用，如前所述[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

SDS-PAGE和免疫印迹gydF4y2Ba

凝胶电泳使用4%-12%或12%的Bolt Bis-Tris Plus凝胶(Thermo Scientific)进行。将蛋白质转移到0.45 μm聚偏氟乙烯膜上，在35 V下放置60 min。蛋白质通过0.4% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)多聚甲醛在PBS中室温孵育30分钟，摇晃。膜在室温下在阻塞缓冲液中阻塞60分钟(5% [gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba]脱脂牛奶中1× TBST (TBS和0.05% [gydF4y2BavgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba]吐温-20))，然后与针对α-synuclein蛋白15-123氨基酸的一抗(1:10 000稀释，参考:610786,BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)在4℃下孵育过夜[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，在阻挡缓冲液中稀释。然后用TBST清洗膜三次，然后在室温下用1:10 000稀释的山葵过氧化物酶偶联二抗(参考:172-1011,Bio-Rad, Hercules, CA)在阻断缓冲液中孵育60分钟。再用TBST冲洗三次后，使用Western Lightning增强化学发光Pro (PerkinElmer, Waltham, MA)进行免疫印迹，并使用x射线胶片或LiCor Odyssey Fc系统成像。gydF4y2Ba

RT-QuIC检测和缓冲液制备gydF4y2Ba

RT-QuIC反应在384孔透明底板中进行(Nunc, NY)。重组α-突触核蛋白(rPeptide, Athens, GA)从−80°C存储解冻，在hplc级水中重建(Sigma, St. Louis, MI)，并通过100 kda自旋过滤器(Thermo Scientific)以500-µl的量过滤。所有用于反应缓冲液的试剂均购自Sigma。再取生物样品10 μl (pbs可溶性部分总蛋白5 μg)加入反应缓冲液20 μl、50 μM ThT 10 μl、单体重组α-突触核蛋白0.5 mg/ml 10 μl的孔中。在每个培养皿中分别加入阳性(1 μg α-synuclein preformed fibrils (rPeptide))和阴性(去离子水)对照。为保证RT-QuIC的重现性，对不同运行的阳性对照信号进行比较时，变异系数不大于20%。将平板密封，在BMG flustar Omega平板阅读器中37°C孵育，周期为1分钟震动(400转/分双轨)和14分钟休息。荧光测量(450±10 nm激发和480±10 nm发射，底部读数)每15分钟进行一次，持续72 h。gydF4y2Ba

构象稳定性测定(CSA)gydF4y2Ba

将20微升的2×盐酸胍(GdnCl)原液加入等量的pbs -可溶性脑匀浆或rt - quic衍生的α-突触核蛋白原纤维中，得到最终的GdnCl浓度0,1,1.5,2,2.5,3,3.5和4 M，如前所述[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．简单地说，PBS可溶性的大脑样本在室温下摇晃120分钟(800转)，然后在PBS中稀释到0.4 M GdnCl。10万下高速超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下重悬60 min，在1× LDS负载缓冲液中煮沸10 min。通过SDS-PAGE和免疫印迹法测定残留α-突触核蛋白的水平，如上所述。使用ImageJ进行密度测量，将数值归一化到强度最高的样品，设置为100%。GdnClgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba在GraphPad Prism (v9, San Diego, CA)中，使用s型剂量-响应(变斜率)方程，通过非线性回归确定了50%团聚体溶解时的GdnCl浓度，其顶部和底部值分别固定为100和0。gydF4y2Ba

嗜热菌蛋白酶消化gydF4y2Ba

如前所述，进行热溶素消化[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，只做了一些小修改。在pbs -可溶性脑匀浆中加入50 μg/ml的热熔素。rt - quic衍生的α-突触核蛋白原纤维用含5 μg/ml热熔素的1 × PBS稀释。样品在37°C下连续振荡(600 rpm)孵育60分钟。在EDTA最终浓度为2.5 mM时停止消化，并在100,000下进行超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置60分钟。弃上清，颗粒重悬于1× LDS缓冲液中，SDS-PAGE分析，免疫印迹，如上所述。gydF4y2Ba

电子显微镜gydF4y2Ba

将含有不同rt - quic衍生的α-突触核蛋白原纤维的等分物(5 μl α-突触核蛋白原纤维制品)加载到刚放电的400目碳涂层铜栅格上(电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA)，吸附1分钟。干燥后，使用Talos L120C透射电子显微镜(Thermo Fisher)在200 kV加速电压下观察栅格。使用Eagle 4kx4k CETA CMOS相机(赛默飞世尔)记录电子显微照片。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

使用GraphPad Prism (v.9)进行统计学分析，显著性阈值为gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05。RT-QuIC相对荧光响应也使用GraphPad Prism软件进行分析和绘制(v.9)。使用未配对的双尾进行比较gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试或单向方差分析与Tukey的多重比较检验。双尾枪兵gydF4y2BargydF4y2Ba非参数相关性用于关联从单个个体中获得的不同变量，使用SPSS (v.25，芝加哥，伊利诺伊州)。gydF4y2Ba

筛选168种RT-QuIC条件检测MSA中α-synuclein播种gydF4y2Ba

我们假设改变控制淀粉样蛋白体外扩增的物理化学因素将有利于在MSA中播种α-突触核蛋白。基于已发表的使用不同离子环境来提高不同蛋白质病种子扩增测定的敏感性的成功[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，我们对168种不同的反应缓冲液进行了系统评估，使用一系列pH值和盐，用一名MSA和一名PD患者的脑匀浆进行了种子(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们比较了α-突触核蛋白RT-QuIC在强柠檬酸存在下的表达gydF4y2Ba^{3−gydF4y2Ba}和SgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^{2−gydF4y2Ba})，适度地gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)和弱(ClOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)水合阴离子和阳离子(GdnCl和MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)在高(500和350 mM)、中(250和170 mM)和低(100和50 mM)浓度下使用4种不同的pH值(pH 2、pH 4、pH 6.5和pH 8)。在得到的168个缓冲液中，每次反应使用等量(5 μg)的总脑蛋白。PD患者的路易体病理丰富区域SN和MSA患者的小脑白质丰富区域gci被使用4mm脑组织冲床仔细显微解剖，随后使用PBS加工成粗匀浆。在这两个病例中，疾病相关α-突触核蛋白的常规免疫组化显示，PD患者的SN中有丰富的路易小体和神经突，MSA患者的小脑白质中有gci(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b).接下来，我们进一步寻找α-突触核蛋白脑匀浆的生化和结构差异。初步研究比较了pbs -可溶性α-突触核蛋白与蛋白酶K或与热溶素的消化。我们发现热溶素消化在MSA和PD大脑之间提供了一个更好的区分裂解模式，这也在RT-QuIC产物被消化时得到了复制。因此，所有后续实验都报告了热溶素消化的结果。MSA中耐热裂解素α-突触核蛋白的条带形态与PD不同。虽然两种大脑提取物都在~ 10 kDa处有一个条带，但MSA提取物在~ 15 kDa处有一个突出的额外条带(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。最后，使用CSA测量蛋白聚集株抵抗GdnCl变性的能力，我们发现MSA脑提取物中的α-突触核蛋白聚集物的稳定性明显低于PD脑提取物中的α-突触核蛋白聚集物(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, e)。gydF4y2Ba

在对脑匀浆进行表征后，为了确定有利于MSA播种活性的最佳测定条件，我们使用5 μg MSA衍生或pd衍生的pbs可溶性部分对168种不同的RT-QuIC反应缓冲液进行了播种。四种不同的RT-QuIC板在此阶段运行(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．每种条件都进行四次重复测试，并在每个培养皿中添加相同的阳性和阴性对照。然后，我们量化了每个反应的5个动力学参数:滞后时间、生长期、T50(对应于达到50%最大聚集所需的时间)、ThT最大值或荧光峰值，以及荧光响应的曲线下面积(AUC)。每个动力学参数计算为从每个四次重复得到的值的平均值。重要的是，我们确认在所有板上运行的阳性和阴性对照样品之间，这5个参数中的任何一个都没有观察到显著差异。接下来，我们通过将MSA和PD脑匀浆得到的值分割，计算了5个动力学参数的折叠分离，并生成热图(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．然后，为了选择最有利于检测msa衍生的α-突触核蛋白聚集的条件，我们将AUC定义为感兴趣的播种参数，因为它包含了每个聚集反应的所有动力学特征，包括聚集的速度和程度。我们的分析显示，19/168的缓冲液能够主要检测PD衍生的α-突触核蛋白聚集，显示PD和MSA曲线之间至少有两倍的差异;当MSA聚集模式与PD相比时，109/168缓冲区在描述RT-QuIC动力学曲线的主要参数上没有显着差异;而40/168缓冲区显示msa衍生的α-synuclein聚集与pd衍生的α-synuclein聚集之间至少有两倍的差异。从这40个缓冲区中，选择了10个显示出最大差异的条件来进一步检查动力学曲线的参数(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。有趣的是，这些缓冲液具有双峰分布，当反应发生在pH值4时，msa衍生的α-突触核蛋白聚集和pd衍生的α-突触核蛋白聚集之间的差异较大，当反应发生在pH值8时，高水合阴离子表现最好(图4)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．根据每种条件下获得的原始值，我们选择了两种缓冲液:缓冲液1 (50 mM甘氨酸，pH值4,250 mM NaClO)gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)和缓冲液2 (40 mM磷酸盐缓冲液[PB]， pH 8, 350 mM NagydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba柠檬酸盐)作进一步分析。gydF4y2Ba

评价MSA中α-突触核蛋白播种的两个最佳条件的验证gydF4y2Ba

在更大的疾病样本队列中进一步验证了两种最佳缓冲液在检测msa衍生的α-synuclein播种活性和将其与pd衍生的α-synuclein播种活性区分方面的表现。我们显微解剖了15例MSA患者、15例PD患者、5例核上进行性麻痹患者和5例对照组的SN，并将样品加工成pbs可溶性匀浆。所有受试者都进行了详细的神经病理检查(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。为了排除MSA和PD受试者在蛋白提取过程中α-突触核蛋白聚集恢复的潜在差异，我们使用ELISA方法定量测定了总α-突触核蛋白和聚集α-突触核蛋白的数量。两组患者的α-突触核蛋白总量或聚集α-突触核蛋白总量均无差异(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。在两种缓冲条件下，从40名受试者中每人提取等量的总蛋白(5 μg)用于反应种子，所有样本在同一平板上重复四次。为了说明PD和MSA样本α-突触核蛋白RT-QuIC聚集的典型特征，我们绘制了在缓冲液1条件下扩增的一个代表性MSA、一个PD和一个对照病例的数据(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). PD和MSA之间的最大荧光和AUC始终不同，来自MSA患者的样本始终比来自PD患者的样本聚集更快，且总是达到较低的荧光平台(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, c)。当在缓冲液2条件下扩增时，对于相同的病例，我们观察到来自MSA患者的样本仍然聚集得更快，但相比之下，他们达到了比来自PD患者更高的荧光平台(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf)。此外，PD和MSA患者之间的最大荧光和AUC存在显著差异(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag, h)。为了测试结合到MSA和PD原纤维上的ThT的数量是否取决于缓冲液的物理化学因素，我们研究了在两种条件下扩增的RT-QuIC检测的最终产物在电子显微镜下检查时是否显示出结构差异(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae, j)。有趣的是，尽管两种缓冲液的ThT动力学存在显著差异，但在这两种条件下，来自PD样品的原纤维始终表现出细而直的形态，而来自MSA样品的原纤维始终表现出粗而扭曲的形态。然而，我们无法确定在不同条件下产生的PD或MSA原纤维是否存在结构差异。此外，在缓冲液1条件下，与对照组或核上进展性瘫痪受试者相比，MSA样本在最大荧光或AUC上均未显示出显著差异(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, c)。然而，MSA样本比对照组和核上进行性麻痹组表现出更快的聚集(T50)(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)。当检查缓冲液2条件时，我们发现MSA和PD之间存在最佳区别，并在最大荧光、T50和AUC方面最大限度地与对照组和核上进展性瘫痪受试者进行动力学分离(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba胃肠道)。因此，缓冲液2 (40 mM PB, pH 8, 350 mM NagydF4y2Ba_3.gydF4y2BaRT-QuIC法研究MSA α-synuclein的播种，选择柠檬酸盐作为最佳工作缓冲液。gydF4y2Ba

RT-QuIC最终产物的表征gydF4y2Ba

为了进一步了解PD或MSA患者扩增的聚集物结构，我们通过CSA和热溶素消化分析了缓冲液2 RT-QuIC终产物。对于这些实验，我们在筛选阶段检查了PD和MSA受试者的RT-QuIC最终产物。如前所述，在CSA下，暴露于GdnCl后，MSA脑匀浆中存在的聚集物明显不如PD脑匀浆中发现的稳定(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, e).这种构象稳定性的差异被保留在表位(氨基酸15-123)中，用于探测dna序列之后的结构gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba通过RT-QuIC进行扩增，MSA大脑衍生的最终产物比PD大脑衍生的最终产物更不稳定(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).热溶素消化的结果表明，MSA匀浆和MSA衍生的RT-QuIC最终产物在~ 10 kDa处有一个带，在~ 15 kDa处有一个突出的附加带(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).然而，尽管PD匀浆在~ 10 kDa处出现了一条条带，但PD RT-QuIC终产物中存在的α-突触核蛋白不耐热溶素。这些结果以及超微结构数据表明，在我们的实验条件下，以MSA α-突触核蛋白原纤维为种子的RT-QuIC反应产物与以pd源原纤维为种子的RT-QuIC反应产物具有构象上的区别。gydF4y2Ba

MSA患者呈现明显的α-突触核蛋白播散gydF4y2Ba

除了观察到不同组患者AUC和ThT最大值的差异外，我们还观察到15例MSA患者AUC和ThT最大值的差异高达10倍(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag, h).根据SN样本的数据，根据体外重组α-突触核蛋白单体错折叠的能力，我们将纳入研究的MSA受试者进一步分为3组:高、中、低种子组。为了检验在MSA中存在α-synuclein播种异质性的假设，我们从15个MSA受试者中选择了6个(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah)，根据α-突触核蛋白的播撒行为，将其分为低播种者(MSA 1和MSA 6)、中播种者(MSA 3和MSA 4)和高播种者(MSA 2和MSA 5)。为了评估这些差异是否可能是由于种子浓度或种子特性的差异，我们对分别分为高播种者和低播种者的两个MSA病例进行了小脑pbs可溶性部分的终点稀释(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。不管用多少脑匀浆来播种RT-QuIC反应，来自高种子者的错误折叠α-突触核蛋白的播种活性比来自低种子者的播种活性更强gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。然后，在这些受试者的13个不同大脑区域评估α-突触核蛋白播种行为。从每个病例中，我们对以下区域进行微解剖并随后制备了pbs可溶性提取物:前扣带皮层、前扣带白质、额叶皮层、额叶白质、壳核、苍白球、杏仁核、海马、颞叶皮层、颞叶白质、SN、脑桥基底和小脑白质(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。所有样品重复四次，每个反应获得的RT-QuIC曲线被评估为α-突触核蛋白播种行为的衡量标准(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5)。AUC值转换为0到3的分数。根据这些值，我们生成了α-突触核蛋白播种的热图，以说明大脑区域和患者之间的差异(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).有趣的是，根据各区域的平均AUC值，两个高种子患者的AUC值明显高于中间- (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)或低种子(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)患者。当分别检查不同的大脑区域时，脑桥基底显示出最高的α-突触核蛋白播种。令人惊讶的是，小脑白质和壳核的α-突触核蛋白含量最低。当检查不同的皮层时，我们发现额叶和颞叶皮层显示中等播种，而扣带皮层有更高的播种。与灰质相比，在三个皮层的白质中始终观察到更高的播种。总体而言，海马呈中等播散，苍白球、SN和杏仁核中α-突触核蛋白播散程度较高。gydF4y2Ba

α-突触核蛋白的生化和神经病理学特征gydF4y2Ba

不同MSA患者α-突触核蛋白水平升高的原因gydF4y2Ba与gydF4y2Ba低播种数目前未知。为了进一步研究这一点，我们对来自脑匀浆的α-突触核蛋白进行了生化检查，并对相应样本中α-突触核蛋白沉积进行了详细的免疫组织化学定位。首先，我们用酶联免疫吸附法(ELISA)定量了总α-突触核蛋白和聚集α-突触核蛋白的数量，并将这些测量结果与它们的α-突触核蛋白播种行为相关联。在MSA病例中，每毫克pbs可溶性部分的组织中有0.6-4 ng的总α-突触核蛋白。高、低、中种子间α-突触核蛋白总量无显著差异。α-突触核蛋白总量较高的区域是杏仁核和额叶皮层，而小脑白质和脑桥的α-突触核蛋白总量较少gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6)。采用α-synuclein Patho ELISA法测定聚集α-synuclein的数量。MSA病例每mg组织中pbs可溶性部分有3-362 pg聚集α-突触核蛋白。有趣的是，聚集α-突触核蛋白的数量显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0165)。α-突触核蛋白聚集负担较高的区域是颞叶和前扣带皮层，而小脑白质和脑桥的α-突触核蛋白聚集负担最少(补充文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6)。pbs -可溶性部分中α-突触核蛋白的总量与聚合α-突触核蛋白的总量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.171)或α-synuclein播种活性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.648)。而聚合α-synuclein水平与α-synuclein播种活性呈负相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.035,gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.241)。这些数据，以及来自没有明显α-突触核蛋白积聚的大脑区域的可溶性部分的显著播种活性，使我们测试如果使用较大的、萨科齐-不溶性(SI)的α-突触核蛋白聚集物来播种RT-QuIC试验，区域和患者之间的异质性是否也保持不变。为了验证这一假设，我们从一个低种子型MSA病例(MSA 1)和一个高种子型MSA病例(MSA 2)的小脑、壳核和额叶皮层中提取α-突触核蛋白SI聚集物。等量(5 μg)的总蛋白用于所有反应的种子，并从这些样本中提取四倍的α-突触核蛋白SI聚集物及其相应的pbs可溶性部分进行评估。此外，由于SI聚集物的不溶性和纤维末端可能无法接近，我们还包括了超声SI样品。当RT-QuIC曲线被评估时，两个主题的SI聚集在区域之间没有显著差异。然而，来自高播种者(MSA 2)三个大脑区域的SI聚集物聚集得更快，并且比来自低播种者(MSA 1，附加文件)的SI聚集物达到更高的荧光平台gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7a)。无论检查的区域或患者，SI聚集物促进更快的聚集，并达到比相应的pbs可溶性部分中存在的α-突触核蛋白聚集物更高的荧光平台(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7b, c;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S8)。同样的模式也被观察到，在有和没有超声处理的SI聚集物之间检查α-突触核蛋白聚集动力学的差异，其中超声处理的SI聚集物比未超声处理的SI聚集物促进更快的聚集，达到更高的荧光平台(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S7b, c)。gydF4y2Ba

最后，我们的目的是评估α-突触核蛋白播种的异质性是否反映在同一受试者大脑的免疫组织学结果中。首先，我们进行了表位定位，比较哪一种α-突触核蛋白抗体能够在福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中检测最多的MSA α-突触核蛋白病理。使用来自我们6名MSA患者队列的壳核和小脑的连续切片，我们使用四种不同的α-synuclein抗体进行了形态测量分析:识别聚集形式的α-synuclein的5G4构象抗体，识别Ser129磷酸化的α-synuclein的pSyn#64，以及两种针对截断(c端裂解)和硝化形式的α-synuclein的抗体(分别克隆A15127A和Syn514)(另文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S9)。在所有检查的病例和区域中，构象5G4抗体始终表现出更多的α-突触核蛋白病理，其次是识别Ser129磷酸化α-突触核蛋白和截断α-突触核蛋白的两种抗体gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S9m)。因此，使用5G4抗体对α-突触核蛋白聚集负担进行半定量分析。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S10)。小脑和壳核的α-突触核蛋白聚集量最高，SN、桥脑基底和苍白球的α-突触核蛋白聚集量也较高。颞叶和额叶皮层灰质中聚集α-突触核蛋白含量较少。除了半定量分析聚集α-突触核蛋白的总负荷外，还检查了gci和NCIs的负荷(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S11)。不出所料，NCIs的出现频率低于gci。脑桥基底、SN和壳核，其次是海马体和前扣带皮层，是NCIs较多的区域。在gci负荷评估时，壳核和小脑、苍白球和SN是gci含量较高的区域，而海马体和额叶皮层的gci含量较低。令人惊讶的是，在高、低、中种子间，GCIs、NCIs和聚集α-synuclein的负担没有显著差异，在GCIs负担之间没有发现相关性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.957)或NCIs (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.252)。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们证明了控制α-突触核蛋白体外扩增的物理化学因素可以被定制，以生成用于RT-QuIC的应变特异性反应缓冲液。使用这种新方法，我们生成了一种流线型RT-QuIC检测方法，(1)能够在48小时内测量96个MSA样本的α-突触核蛋白播种，重复4次;(2)要求每孔使用最少量的市售重组α-突触核蛋白单体(5 μg);(3)要求使用极少量的脑物质(5 μg);(4)产生rt - quic衍生的α-突触核蛋白原纤维，这些原纤维在不同的突触核蛋白病变患者之间具有不同的构象;(5)能够根据MSA大脑的α-synuclein播种行为进行亚型。gydF4y2Ba

MSA在临床和病理上具有异质性，尽管gci和NCIs的分布可能与主要临床特征相关[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]， α-突触核蛋白包体的负担并不能完全解释MSA在临床表现和疾病进展速度上的差异。近年来，越来越多的证据强调可溶性脑组分中淀粉样蛋白在朊病毒样病理聚集中的重要作用，这可能有助于神经退行性疾病患者的临床异质性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．几个小组利用错误折叠α-synuclein模板单体α-synuclein的能力，建立了一种RT-QuIC测定法，能够测量一系列PD样品中α-synuclein的播种动力学[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．然而，msa衍生样品中α-突触核蛋白播种的可靠检测仅限于几项研究[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．为了确定在msa衍生样品中评估α-突触核蛋白播种的最佳条件，我们对168种不同的反应缓冲液进行了全面分析，包括一系列pH值和盐。然后，我们验证了两个条件，在更大的神经病理确诊病例队列中，赋予了区分PD和msa衍生样本的最佳能力。虽然RT-QuIC反应使用相同的样品，但两种不同的缓冲液导致动力学曲线明显不同，这表明ThT与来自MSA和PD的α-突触核蛋白的可达性或相互作用可由反应缓冲液的盐类型、pH值或离子强度调节[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．我们选择缓冲液2 (40 mM PB, pH 8, 350 mM NagydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba并进一步证明rt - quic衍生的MSA-原纤维保持了用于种子反应的MSA聚集物的生化性质。gydF4y2Ba

我们在MSA中对13个不同大脑区域的α-突触核蛋白播种的多区域映射显示，脑桥基底的播种量最高。令人惊讶的是，从MSA中受影响最严重的两个区域，小脑和壳核中提取的α-突触核蛋白，表现出最低的播种量。一种可能的解释是，α-突触核蛋白种子的分析是使用pbs可溶性部分进行的。α-突触核蛋白的播种活性可能随着时间的推移而降低，因为在疾病早期阶段存在的更可溶性的种子能力较强的α-突触核蛋白物种在疾病后期被隔离在更大的不可溶性聚集物中。这可能导致从病程早期受影响区域提取的α-突触核蛋白的播种减少[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．这种可能性使我们比较了SI α-突触核蛋白聚集物和存在于不同大脑区域的pbs可溶性部分的α-突触核蛋白种子的播种行为。当比较α-synuclein播种时，只观察到pbs可溶性部分的区域差异，而SI聚集体则没有。然而，无论检查的区域或患者，在pbs -可溶性部分中，SI聚集物始终比α-synuclein种子促进更快的聚集，这表明SI部分中有更多的α-synuclein物种。我们的发现支持了早期的观察，即α-突触核蛋白在MSA中的修饰和溶解度可能比组织病理学更广泛[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]而不同的突触核蛋白病之间可能有所不同[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．未来的研究应进一步研究pbs -可溶性α-synuclein是MSA播种行为中观察到的区域差异的主要贡献者这一奇怪发现。有趣的是，不考虑SI和可溶性部分之间的差异，还观察到患者之间播种活性的显著差异。gydF4y2Ba

我们的研究有一些局限性。我们的数据清楚地表明，选择合适的条件进行种子扩增是非常重要的。总的来说，在这一领域，我们对特定种子构象体可以繁殖的最佳体外物理化学因素的理解仍处于起步阶段。使用次优条件，没有播种活动可能反映了种子的缺乏，但也可能反映了特定的RT-QuIC条件无法支持这些特定种子的扩增[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们的发现为未来的研究铺平了道路，以解决不同MSA患者α-突触核蛋白能力的分子机制gydF4y2Ba与gydF4y2Ba降低播种。事实上，我们的结果支持了一个模型，即在不同大脑区域之间和不同MSA患者之间观察到的异质性可能是由于细胞环境的差异[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]以及翻译后修饰的存在[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]和其他辅助因子，如p25α [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]，这可能会赋予一种α-突触核蛋白构象相对于另一种构象的选择压力[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这项研究表明，控制α-突触核蛋白体外扩增的物理化学因素可以被定制，以生成用于RT-QuIC的应变特异性反应缓冲液。使用这种新方法，我们在一组神经病理上可比较的MSA大脑中发现了种子能力α-突触核蛋白的意想不到的差异。了解种子差异与α-synuclein生物活性之间的关系对于未来MSA的亚分类至关重要，应超越常规的临床和神经病理表型，考虑这些患者中α-synuclein的结构和生化异质性。这将为这种毁灭性疾病开发新的个性化治疗策略。此外，更深入地了解物理化学因素如何影响不同α-突触核蛋白株的聚集，将为MSA和其他突触核蛋白病的诊断提供急需的、快速和敏感的体内检测方法的发展提供支持。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

客服人员:gydF4y2Ba

构象稳定性测定gydF4y2Ba

CSF:gydF4y2Ba

脑脊髓液gydF4y2Ba

快:gydF4y2Ba

少突细胞胞质包体gydF4y2Ba

MSA:gydF4y2Ba

多系统萎缩gydF4y2Ba

帕金森病:gydF4y2Ba

帕金森病gydF4y2Ba

PMCA:gydF4y2Ba

蛋白质错误折叠循环扩增gydF4y2Ba

RT-QuIC:gydF4y2Ba

实时震动诱导转换gydF4y2Ba

ThT基金会:gydF4y2Ba

Thioflavin TgydF4y2Ba

作者特别感谢患者及其家属的捐赠，以及Navarrabiomed生物银行的合作。我们还要感谢多伦多大学Temerty医学院的Lindsey Fides和显微镜成像实验室对电子显微镜的支持。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba被设计成gydF4y2BaBiorender.comgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

这项研究得到了Edmond J Safra慈善基金会、Krembil基金会和Rossy基金会的支持。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析或解释，也没有参与手稿的撰写。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Sohaila AlshimemerigydF4y2Ba

   现居地:沙特阿拉伯利雅得沙特国王大学医学系神经内科gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 神经退行性疾病Tanz研究中心，多伦多大学，安大略省多伦多gydF4y2Ba

   伊万·马丁内斯-瓦尔布埃纳，艾因·金，希瑟·h·c·刘，拉斐尔·w·l·索，乔尔·c·瓦茨，安东尼·e·朗和加伯·g·科瓦奇gydF4y2Ba

2. Edmond J. Safra项目在PD和Morton和Gloria Shulman运动障碍诊所，多伦多西部医院，多伦多，ON，加拿大gydF4y2Ba

   Naomi P. Visanji, Sohaila Alshimemeri, Anthony E. Lang和Gabor G. KovacsgydF4y2Ba

3. 多伦多大学检验医学与病理生物学系，多伦多，ON，加拿大gydF4y2Ba

   Naomi P. Visanji, Andrew Gao, Michael A. Seidman & Gabor G. KovacsgydF4y2Ba

4. Krembil大脑研究所，大学健康网络，多伦多，安大略省，加拿大gydF4y2Ba

   Naomi P. Visanji, Anthony E. Lang和Gabor G. KovacsgydF4y2Ba

5. 多伦多大学生物化学系，安大略省多伦多，加拿大gydF4y2Ba

   刘慧聪，苏伟强，乔尔·瓦茨gydF4y2Ba

6. 实验室医学项目，大学卫生网络，多伦多，安大略省，加拿大gydF4y2Ba

   Andrew Gao, Michael A. Seidman & Gabor G. KovacsgydF4y2Ba

7. 西班牙纳瓦拉市潘普洛纳纳瓦拉大学神经内科gydF4y2Ba

   玛丽亚·r·卢昆gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

IMV和GGK设计了实验。IMV、AK、HHCL、RWLS、SA、AG、MRL、MS、GGK进行实验并提供样品。IMV、NPV、HHCL、RWLS、JCW、AEL和GGK对数据进行分析和解释。IMV、NPV和GGK撰写了手稿。AEL和JCW对手稿提供了重要的意见。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaGabor G. KovacsgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

这项研究得到了大学卫生网络研究伦理委员会(no . 20-5258)的批准。此外，在患者或其亲属知情同意并获得当地机构审查委员会批准的情况下，从人脑中收集尸检组织。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

GGK拥有5G4抗体共享专利。其他作者宣称没有竞争利益。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba