慢性肾脏疾病中的唾液微生物群:它与糖尿病、高血压和免疫有什么联系?

背景

口腔生态失调与慢性肾脏疾病(CKD)之间的关系近年来受到越来越多的关注。糖尿病和高血压是CKD中最常见的疾病。然而，CKD患者唾液微生物组以及糖尿病和高血压对微生物组影响的匹配混杂变量的病例对照研究从未报道过。

方法

在我们的研究中，我们使用16S核糖体DNA测序比较了CKD患者和健康对照(HC)之间的唾液微生物组谱，并研究了其与糖尿病、高血压和免疫的关系。

结果

我们观察到CKD患者唾液中的细菌群落是倾斜的，增加Lautropia而且假单胞菌，减少放线菌，普氏菌，普氏菌7,Trichococcus．CKD患者合并和不合并糖尿病、合并和不合并高血压之间的细菌群落没有差异。普氏菌CKD伴/不伴高血压患者相对HC下降7，而假单胞菌伴有/不伴有高血压的CKD患者增加。假单胞菌与CKD患者的免疫球蛋白G呈负相关。抗链球菌溶血素O阳性和阴性的CKD患者均有下降普氏菌7和Trichococcus相比HC，而增加假单胞菌．

结论

我们的研究在CKD患者中发现了一种独特的细菌唾液微生物组，其特征是成分的改变。我们在这里揭示了糖尿病和高血压的共发疾病与特定的细菌改变无关，这表明无论糖尿病和高血压是否发生，唾液中的细菌生态失调都在肾损害中发挥作用。

慢性肾病(CKD)是一种严重的全球健康负担，可导致肾衰竭和全身性疾病。在CKD患者中观察到肠道生态失调-肠道微生物多样性的变化[1］．许多研究表明，口腔中的微生物群也可能对宿主的健康起着重要作用[2]，口腔微生物组和CKD发病机制之间的关系已经得到解决。例如，Hu J等发现富集奈瑟氏菌属伴随着韦永氏球菌属而且链球菌CKD患者[3.］．此外，他们发现了一种负相关奈瑟氏菌属而且链球菌与估计的肾小球滤过率(eGFR) [3.］．段X等报道CKD患者终末期肾脏疾病改变了唾液微生物群，并与口腔健康状态相关[4］．值得注意的是，CKD患者血液透析时牙周病原体丰富[4］．Guo S等发现CKD患者口腔微生物多样性增加。链球菌，放线菌,纤毛菌属在CKD患者中富集，而普氏菌而且嗜血杆菌在CKD患者中减少[5］．

近年来，唾液微生物组对糖尿病的潜在影响已得到证实。一些研究使用下一代序列将糖尿病患者的唾液微生物组与健康受试者的唾液微生物组进行了比较。数据显示，糖尿病与唾液微生物群的细菌多样性减少有关[6，7，8］．此外，唾液水平较高p . gingivalis，t .连翘而且f . alocis在妊娠期糖尿病患者中有报道[9］．尽管约40%的糖尿病患者会发生糖尿病肾病，并且是全球CKD的主要原因[10]，而肠道微生物组与糖尿病之间的关系已被广泛探索[11，12，13]，很少有研究报道唾液微生物组对CKD合并糖尿病患者的影响。

由于大约50%的成年人患有高血压[14]，微生物组在高血压中的病理作用，包括唾液微生物组，已得到越来越多的关注。Barbadoro P.等人报道了牙齿病理的细菌种类，如放线杆菌actinomycetemcomitans在高血压患者的口腔斑块中浓度较高[15］．Gordon JH发现普氏菌口服而且链球菌oralis与血压正常的女性相比，服用抗高血压药物的女性高血压增加[16］．然而，迄今为止，高血压合并肾损害患者唾液微生物组的改变尚未见报道。

肾脏是系统性免疫和自身免疫性疾病的常见目标，包括系统性自身免疫和血管炎、免疫复合物相关的血清疾病和补体疾病[17］．人体微生物组与免疫反应的诱导、发展和调节有关[18］．因此，CKD患者唾液微生物组和免疫谱可能存在生物学上的互联性。

在这里，我们假设CKD患者与健康对照(HC)相比，唾液中的微生物特征不同。微生物组的这种偏差在CKD中糖尿病和高血压等常见疾病的病因学及其免疫结果中具有潜在作用。

研究对象

本研究由南京医科大学无锡第二医院机构评审委员会批准(Ref. 2018051)。所有参与者在参与前均给予书面知情同意，研究按照《赫尔辛基宣言》中的道德标准进行。CKD组和HC组的入选标准为:≥18岁，取样前≥1个月未使用抗生素，无急性并发疾病和感染/腹泻/肾移植/怀孕/哺乳，入组前1个月内未使用抗生素/益生菌/免疫抑制等药物。CKD的诊断标准是:肾脏损害或Egfr < 60 ml/min/1.73 m²存在时间≥3个月。肾损害的标志物包括蛋白尿[白蛋白排泄率≥30 mg/24 h;尿白蛋白肌酐比值(UACR)≥30 mg/g]、尿沉积物异常、电解质等小管疾病异常、组织学异常、影像学结构异常[19］．肾脏损害是指病理异常或损害标志，包括血液或尿液检查或影像学检查的异常[20.］．本研究中的CKD患者从未进行过血液透析。肾损伤(如上所述的肾损伤标志物)或eGFR高于90 ml/min/1.73 m的受试者²HC组排除了当前疾病包括糖尿病和高血压，以及急性或慢性感染。

我们通过面对面访谈和医学审查收集了人口统计和健康状况信息。招募当天评估空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)和血压。采用免疫比浊法检测采集样本当天的血清免疫参数，采用Freelite试验(AU5421;Beckman Coulter，美国)。

为了研究CKD中糖尿病和高血压同时发生对唾液微生物群的影响，我们将CKD患者分为糖尿病性CKD (DM-CKD)和非糖尿病性CKD (nonDM-CKD)亚组，以及高血压性CKD (HTN-CKD)亚组和非高血压性CKD (nonHTN-CKD)亚组。

样本采集，DNA分离，生物信息学分析

在收集唾液前至少1小时，参与者不吃、不喝、不吸烟、不刷牙，将1ml唾液收集到无rna的无菌容器中。将样品加入500 μL裂解液中，- 80℃保存至DNA分离。DNA提取、16S rRNA定量PCR、定性16S靶向宏基因组测序、生物信息学分析等步骤已在我们之前的研究中描述[21］．此外，采用受试者工作特征(ROC)曲线来说明细菌属的诊断能力。线性判别分析效应量(LefSe)用于寻找组间的生物标志物。使用R studio(3.6.3版本)进行生物信息学分析。基于唾液微生物组的16S rRNA测序数据，使用PICRUSt2(通过重建未观察状态对群落进行系统发育调查)v2.0.3 (https://github.com/picrust/picrust2)，利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)直方图预测功能基因丰度。

统计分析

描述统计的人口统计学和临床和免疫组参数提出。为了比较两组间的人口统计学和临床特征，连续变量采用独立的方法进行评估t-检验和类别变量使用卡方或Fisher精确检验，在适当的时候。组数≥3组间定量变量比较采用单因素方差分析。采用Wilcoxon秩和检验/ Kruskal-Wallis单向检验比较各组间细菌多样性和细菌类群相对丰度(≥总丰度的1%)，并校正Benjamini Hochberg假发现率(FDR)P-value用于对比测试。一个P以< 0.05为比较统计学检验的分界点。使用SPSS (v. 24.0)比较组间的人口统计数据。

接下来，我们检查了在CKD和HC组之间表现出显著差异的细菌属与血清免疫谱水平之间的关联。对于连续变量，我们使用皮尔逊分析和aP以< 0.05为显著临界值相关分析。对于分类变量，如抗链球菌溶血素O (ASO)，我们将CKD患者分为ASO阳性CKD样本亚组(ASOPOS-CKD)和ASO阴性样本亚组(ASONEG-CKD)，并比较ASOPOS-CKD、ASONEG-CKD和HC组之间的细菌微生物群。

参与者的人口统计学和唾液微生物组特征

共分析了200份唾液样本，其中100份来自CKD患者，100份来自HC患者(表2)1)．CKD和HC组的参与者年龄-性别- bmi相匹配。在CKD组中，分别有29、64和58例患者同时患有2型糖尿病(T2DM)、高血压和可检测到的ASO1:表S1，附加文件2:表S2和附加文件3.:表S3)。29例T2DM患者中，25例有高血压，18例ASO可检出;64例高血压患者中，T2DM 25例，ASO检测35例;58例ASO检出患者中，18例为T2DM, 35例为高血压。正如预期的那样，CKD组eGFR下降，血清尿素、血清肌酐、血清尿酸、尿蛋白、尿肌酐和血压水平升高(P< 0.05)。此外，患者组血清c反应蛋白，κ FLC和λ， FLC (P< 0.05)， C3和C4水平降低。在CKD患者中，ASOPOS受试者占58%(附加文件3.:表S3)。

在PCR中剔除带有不可见条带的样本后，我们对198名受试者的唾液样本进行了细菌组成特征分析，其中包括98名诊断为CKD的受试者和100名健康受试者。总共识别出16,504,359个原始读取，在去除低质量或模糊的读取后，还剩下14,869,458个有效读取。在提纯到15,193个reads后，我们得到10,388个asv。每个样本的Good’s覆盖指数在扩增子序列变异(ASV)水平上的测量值为100%。

CKD中的细菌群落和多样性

对于显著差异的asv, PCoA表明CKD患者唾液中的细菌群落与HC组不同(P< 0.05;无花果。1A).在10388个观察到的asv中，28.26%的asv是由两组共享的(图。1B)，但比较细菌丰富度和多样性时，CKD组和HC组Chao 1、Shannon、Simpson指数均无差异(P> 0.05;无花果。1C)。

CKD中的细菌组成

无花果。1D显示，CKD和HC组中细菌门数量最多的是厚壁菌门(Firmicutes, CKD为44.25%，HC为43.38%)及其属链球菌(CKD 30.50%， HC 28.45%)。厚壁菌门次之为变形菌门(CKD为26.61%，HC为22.40%)奈瑟氏菌属在CKD和HC中都是第二丰富的细菌(分别为14.00%和12.94%)。放线菌在CKD组(10.77%)比HC组(13.77%)下降。同时,罗思氏菌属放线菌属(Actinobacteria)， CKD(6.99%)相对HC(8.37%)呈下降趋势。

CKD中一个细菌分类单元的改变

比较CKD组和HC组的细菌门。CKD组放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度显著降低，变形菌门(Proteobacteria)丰度显著升高(P < 0.05;无花果。2一个)。

当应用Wilcoxon秩和检验时，细菌属放线菌，普氏菌，Provotella7,TrichococcusCKD明显低于HCLautropia而且假单胞菌CKD (P< 0.05;无花果。2B). AUC测量的ROC表明假单胞菌AUC值为0.804(图;2C). LefSe显示Proteobacteria及其属假单胞菌可归类为CKD生物标志物，而普氏菌，普氏菌7,Trichococcus可被认为是唾液中健康的生物标志物(图2)。2D)。

功能通路的改变

为了确定CKD中微生物组成的功能意义，我们使用PCIRUSt2从16S rRNA基因数据中推断微生物基因含量，并将功能基因的相对丰度聚合到代谢途径中。CKD唾液样本中氨基酸代谢、脂质代谢、异种生物降解代谢等水平显著高于对照组，而辅助因子和维生素代谢、糖基生物合成代谢、心血管疾病等水平较对照组低(P < 0.05;无花果。3.)．

DM-CKD和HTN-CKD患者唾液微生物群的改变

当我们将CKD患者分为DM-CKD和非DM-CKD亚组时，两者都显示出与HC患者明显不同的细菌群落(P< 0.05;无花果。4A)，而DM-CKD与nonDM-CKD之间无差异(P> 0.05;无花果。4A).细菌丰富度和多样性，包括Chao 1、Shannon、Simpson指数在DM-CKD、non - ckd、HC组间无显著性差异(P> 0.05;无花果。4B).细菌属数量居前5位的为链球菌，奈瑟氏菌属，罗思氏菌属，Gemella,而且嗜血杆菌DM-CKD组;非DM-CKD组细菌属数量与DM-CKD组相同;链球菌，奈瑟氏菌属，罗思氏菌属而且嗜血杆菌HC组的细菌也最多，而普氏菌7在HC中表现突出(图。4D)。令人惊讶的是,Lautropia而且假单胞菌HC组与非DM-CKD组相比仅表现出下降，而不是DM-CKD组(P< 0.05;无花果。4D)。同样的,普氏菌7只在HC组相对于非DM-CKD组增加，而不是DM-CKD组(P< 0.05;无花果。4D)。

与DM-CKD的变化趋势相似，HTN-CKD组和非ckd组与HC组的细菌群落差异均有统计学意义(P< 0.05;无花果。5A)，而HNT-CKD组与非htn - ckd组无差异(P> 0.05;无花果。5A).此外，HTN-CKD组、非HTN-CKD组和HC组的细菌丰富度和多样性没有差异(P> 0.05;无花果。5B)。5C显示HTN-CKD组中丰度最高的5个细菌属序列为链球菌，奈瑟氏菌属，罗思氏菌属，Gemella,而且嗜血杆菌，非htn - ckd组中数量最多的细菌属为链球菌，奈瑟氏菌属，罗思氏菌属，嗜血杆菌而且Gemella．当比较细菌属时，HTN-CKD组和非HTN-CKD组的普氏菌比HC组多7个。相比之下，他们都有较高的假单胞菌比HC组(P< 0.05;无花果。5D)。

唾液微生物群与免疫的关系

为了寻求细菌微生物组与免疫之间的关系，我们将CKD中出现显著增加或减少的细菌属与CKD中免疫学指标参数进行Pearson相关分析，并注意到假单胞菌与血清IgG (P< 0.05;无花果。6A).将CKD患者分为ASOPOS-CKD亚组和ASONEG-CKD亚组时，两者均表现出与HC不同的细菌群落，而ASOPOS-CKD亚组与ASONEG-CKD亚组之间没有观察到差异(P< 0.05;无花果。6B). ASONEG-CKD患者Chao 1的细菌丰富度明显高于ASOPOS-CKD患者和HC (P< 0.05;无花果。6C);这两个普氏菌7和TrichococcusASOPOS-CKD组和ASONEG-CKD组明显低于HC组假单胞菌与HC相比，ASOPOS-CKD和ASONEG-CKD富集(P< 0.05;无花果。6D)。

随着对人体肠道微生物组在不健康状态下的大量研究，唾液微生物组在健康中的作用逐渐被探索[2］．作为一项研究，病例和对照组之间的年龄-性别- bmi并不均匀匹配，混淆的微生物组分析可能会产生与人类疾病的虚假微生物关联[22]，我们进行了年龄-性别- bmi匹配的病例对照研究，以检查非透析CKD患者的唾液微生物群。此外，本研究还对糖尿病和高血压合并与免疫的关系进行了评估，这方面的报道较少。

我们在CKD患者的唾液中观察到一个独特的细菌群落。以前的研究也报道了CKD患者的这种改变[3.，5］．此外，我们注意到CKD患者中没有观察到细菌丰富度和多样性的变化，这与以往的研究不同[4］．Duan X等和Guo S.等报道了中国人群中CKD患者唾液中较高水平的细菌多样性[4，5］．然而，他们的研究并没有一致的发现CKD患者细菌丰富度的变化趋势。根据之前的两项研究和我们目前的研究，很难得出中国CKD人群唾液微生物群中细菌丰富度和多样性之间存在关联的结论。

由于糖尿病和高血压在肾脏损害的发展过程中起着至关重要的作用[23]，我们评估了伴有和不伴有糖尿病/高血压的CKD患者的唾液微生物群。虽然DM/HTN-CKD和非DM/HTN-CKD患者的细菌群落和细菌多样性与对照组不同，但在有糖尿病/高血压并发症和没有糖尿病/高血压并发症的患者之间没有观察到差异。一项人类肠道微生物组研究也报告了类似的发现[24］．Tao S等在他们的研究中也注意到CKD患者与非糖尿病患者的微生物群落和多样性没有差异[24］．在这一视角下，虽然肾脏损害与唾液微生物组之间的关系可以确定，但对于糖尿病和高血压肾病的微生物组特征，应通过更多的临床和动物研究来探索。

值得注意的是，虽然ASOPOS-CKD和ASONEG-CKD患者的细菌群落没有差异，但ASONEG-CKD患者的细菌丰富度高于ASOPOS-CKD患者。唾液微生物组与抗链球菌溶血素O之间的关系从未被报道过，而其与肠道微生物组的关系显示与抗链球菌溶血素O呈负相关乳酸菌抗溶血素O滴度的浓度[25]，这表明ASO阳性抑制了益生菌的生长，如乳酸菌．

有几种细菌类群表现出以前CKD唾液研究从未报道过的变化，如放线菌门及其属放线菌在CKD患者中急剧减少。这一发现与Guo S.等人的报道不一致。在他们的研究中，放线菌在CKD组增加[5］．

普氏菌，是口腔微生物群中的主要细菌属之一[26]，在CKD患者中已耗尽。HTN-CKD、非HTN-CKD和HC三组细菌属的比较表明普氏菌7在CKD中起作用，与高血压并发症无关。普氏菌Spp .是一种蛋白水解/氨基酸降解细菌，可将蛋白质和多肽分解为氨基酸，并通过特定途径进一步降解，产生短链脂肪酸[27]，其种类被认为是口腔内的共生微生物[28］．然而，最近的一些研究表明普氏菌与疾病有关，如根尖周感染[29]，痛风[30.]，以及多发性硬化症[31］．因此,尽管普氏菌在CKD患者(包括高血压和无高血压患者)中，其作用需要通过CKD患者和动物模型的唾液微生物组移植进一步研究。

丰富假单胞菌通过Wilcoxon符号秩检验、ROC曲线和LefSe分析证实，在我们的研究中CKD患者中具有显著性。此外，丰富的假单胞菌与对照组相比，伴有和不伴有高血压的CKD患者的死亡率都有所下降。我们注意到免疫球蛋白G (IgG)抗体水平与细胞丰度呈负相关假单胞菌．IgG是体液免疫的主要成分[32］．文献资料显示，血清IgG水平较低与慢性病理改变比例较高、eGFR较低、肾转归较差相关[33］．Ig G和假单胞菌表明唾液微生物组在调节CKD患者的免疫中起着重要作用。

我们观察到Lautropia在CKD患者中增加。唾液丰富Lautropia可能表明人类口腔的不健康状态，正如之前的几项研究所证明的那样Lautropia各种疾病的发病率都在上升例如，Yu F和他的小组报道，口腔扁平苔藓糜烂病变患者有较高水平的Lautropia与无糜烂病变和健康受试者相比[34］．Snider E J等人发现Lautropia可以被列为巴雷特食管患者的诊断生物标志物[35］．Li D等报道Lautropia可用于诊断乙型肝炎[36］．

消耗Trichococcus可能与口腔的不健康状态有关。之前的一项研究也证明了Trichococcus患有阻塞性睡眠呼吸暂停的儿科患者[37］．功能的进一步研究Trichococcus使用动物模型是必要的。

在比较唾液微生物组的代谢途径数据时，我们发现几种代谢途径与CKD相关。脂质代谢通路的上调与既往CKD患者口服研究不一致[3.]，而辅助因子和维生素代谢的下调与CKD的肠道研究相似[38］．需要进一步的代谢组鉴定来探索CKD的代谢及其与唾液微生物组的关系。

就像之前对人类唾液微生物群的研究一样[4，5]，我们目前的研究再次证明CKD患者与对照组有不同的微生物组。然而，糖尿病和高血压的并发症在CKD患者的微生物群落中发挥作用。由于唾液是一种易于无创采集的诊断液，其潜在价值假单胞菌作为唾液中CKD的生物标志物，这表明我们应该在临床环境中进行详细的调查。

虽然旨在恢复CKD患者唾液菌群的治疗干预可能是未来的目标，但目前单中心的唾液微生物组研究有限，需要进一步研究。为了更好地解释唾液微生物组作为潜在的诊断生物标志物，并研究其在CKD患者中的诊断价值和治疗效果，需要进一步将唾液微生物组与肠道微生物组、肠道渗透性标志物、炎症标志物、表观遗传因素以及CKD的各种病因学进行多中心研究。当诊断价值被多个大型多中心研究证实时，应研究唾液微生物组移植，以取代粪便微生物组移植治疗CKD的治疗方案。因为与粪便样本相比，使用无菌收集管更容易收集健康捐赠者的唾液。

我们目前的研究有一定的局限性。首先，只有当地社区参与者参与了这项研究。人类微生物组研究表明，对代表不同文化传统的广泛人群进行采样，为发现我们的微生物组在人群之间的差异提供了一个机会[39］．因此，在地理位置不同的地区进行多中心研究，有更多的研究参与者，以及考虑CKD个体唾液微生物群的个体差异的纵向研究设计，对于这种患病率的生态失调至关重要。第二，虽然看起来CKD患者的糖尿病和高血压并发症与唾液微生物组的改变无关，但DM-CKD/HTN-CKD和非DM-CKD/nonHTN-CKD亚组的样本量太小且不相等，可能导致统计学上的偏倚。为了重新评估本研究的结果，有必要进行更大且相同样本量设计的进一步研究。

在我们的研究中，我们在CKD患者中发现了一种独特的细菌唾液微生物组，其特征是成分的改变。同时，我们在这里揭示了糖尿病和高血压的共发疾病与特定的细菌改变无关，这表明无论糖尿病和高血压是否发生，唾液中的细菌生态失调都在肾损害中发挥作用。

16S rRNA测序信息已存入国家生物技术信息中心(NCBI)序列阅读档案(SRA)，参考文献PRJNA835723 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA835723)．

CKD:

慢性肾病

肾小球滤过率(GFR):

估计肾小球滤过率

HTN:

高血压

HC:

健康对照组

UACR:

尿白蛋白肌酐比值

中华民国:

接收机工作特性

麻生太郎:

Anti-streptolysin O

我们感谢参与我们研究的志愿者。

无锡市“太湖人才计划”医药卫生高层次人才项目(THRCJH20200901);无锡市“医学重点学科建设”市级临床医学中心(市公共卫生中心)项目(LCYXZX202103);浙江省自然科学基金(LXR22H160001);国家自然科学基金(81874142和82073041)。

作者指出

1. 刘凤平、盛佳一、胡磊、张斌、郭伟对这项工作做出了同样的贡献

作者及隶属关系

1. 江南大学无锡医学院，江苏无锡214122

   刘凤平和Brako Lydia

2. 无锡市第二人民医院，南京医科大学附属无锡市第二医院泌尿外科，江苏无锡，214000

   盛佳宜，胡磊，郭伟，王阳，姜鹏，林浩，孙一凡，唐一凡，冯宁汉

3. 苏州大学第一附属医院泌尿外科，江苏苏州215006

   张斌，陈卫国

4. 浙江大学第一附属医院医学院传染病诊疗协同创新中心，传染病诊疗国家重点实验室，浙江杭州310003

   翳风谷

5. 南通大学医学院，江苏南通226019

   顾超群，魏世超

6. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室、食品学院，江苏无锡214122

   Qixiao翟

贡献

概念化:QZ, WC, NF。方法:FL, JS, LH, BZ, WG, PJ, YW, HL, YS, SW, YS, CG。软件:FL, YG。验证:NF。写作:FL, QZ, WG, BL。监督:NF。资金获取:NF。项目管理:PJ, LH, JS, CG。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Qixiao翟，上海市陈或Ninghan冯．

伦理批准并同意参与

本研究由南京医科大学无锡第二医院机构评审委员会批准(Ref. 2018051)。所有参与者在参与前均给予书面知情同意，研究按照《赫尔辛基宣言》中的道德标准进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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