Lumican在人类和实验性急性呼吸窘迫综合征患者的肺中升高，并促进肺损伤的早期纤维化反应

背景

纤维增生性修复在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的炎症期早期开始，提示预后不良。Lumican是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，与体内平衡和纤维发生有关，但它在ARDS中的作用尚不清楚。

方法

支气管肺泡灌洗液(BALF)样本取自诊断后24小时内入组的ARDS患者(n = 55)，机械通气(n = 20)和自主呼吸(n = 29)对照组。用脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠模型气管内注射表达lumican shRNA的腺相关病毒(AAV)载体。原代人肺成纤维细胞(HLF)和小气道上皮细胞(SAECs)与肿瘤坏死因子(TNF)-α或lumican一起培养。进行Luminex/ELISA、组织化学/免疫组织化学、免疫荧光显微镜、实时荧光定量PCR和western blotting。

结果

ARDS患者BALF中Lumican水平明显高于通气或自主呼吸对照组(两者均为阳性)p< 0.0001);它们与PaO相关₂/ FiO₂促炎细胞因子(白细胞介素-6、白细胞介素-8和TNF-α)和前纤维化因子(纤维连接蛋白、α -1型I胶原[COL1A1]和α -1型III胶原[COL3A1])的比例和水平。在ALI小鼠模型中，Lumican在肺泡壁和气道上皮中表达增强。小鼠lumican水平也与BALF中的促炎和促纤维化细胞因子水平相关。在体外，TNF-α可诱导HLF合成和分泌lumican。lumican增加HLF中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COL1A1和COL3A1的表达，上调α-SMA和COL3A1，下调E-cadherin，引起SAECs纺锤状形态改变。此外，在lumican处理的HLF和SAECs中，ERK磷酸化和Slug均有所增加。在体内，aav介导的lumican的下调抑制了肺纤维连接蛋白和COL3A1的产生，并缓解了lps刺激小鼠的肺纤维化病变。

结论

在人类和实验性ARDS中，肺lumican水平在早期升高，并与疾病严重程度和炎症纤维化过程有关。Lumican可能通过ERK/Slug途径触发肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化和saec中的上皮-间充质转化。ALI小鼠肺lumican减毒细胞外基质沉积的抑制。总的来说，lumican促进ARDS早期的纤维化反应，提示其作为治疗靶点的潜力。

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)可由肺炎、败血症、误吸和创伤等疾病引起，其特征为进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症[1］．尽管越来越多的机制涉及ARDS，但该综合征仍然导致显著的发病率和死亡率[2］．ARDS涉及多种病理改变，包括急性/早期渗出性组织期或增生期和晚期消退期或纤维化期[3.］．早期渗出期通常伴随着许多炎症细胞的激活和促炎细胞因子的大量产生。增殖期通常表现为细胞外基质(ECM)的合成、肌成纤维细胞的增殖和上皮-间充质转化(EMT) [4］．有趣的是，最近的研究表明，ARDS的各个阶段是连续发生的，而不是按顺序发生的[5，6］．在组织学评估(肺组织活检和尸检)中，ARDS患者肺部已发现早期纤维增生活性[7，8]，高分辨率计算机断层扫描(HRCT)诊断急性呼吸窘迫综合征[9]，以及在ARDS诊断的几天内连续测量血液和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的前胶原蛋白浓度[10，11］．早期ARDS的肺纤维增生预示着死亡率增加、机械通气持续时间延长、通气相关并发症(气压性创伤和呼吸机相关肺炎)发生率升高以及多器官衰竭易感增加[9，10，11，12，13］．因此，ARDS早期发生纤维增生，提示预后较差，提示有必要揭示可能的治疗靶点和潜在机制。

在纤维增殖反应期间，ARDS的早期炎症期通常伴随着许多ECM成分的沉积[5，14］．富含亮氨酸的小重复蛋白(SLRP)家族是细胞外超分子组合之一，对维持周围结构的平衡至关重要，并参与许多细胞功能[15，16，17］．Lumican是II型SLRPs之一，其串联富亮氨酸重复序列中含有多乳酸胺或角蛋白硫酸盐链[15，18］．据报道，lumican在某些肿瘤的活性调节中是必需的，包括胃癌、胰腺导管腺癌和乳腺癌[19，20.，21］．Lumican还可调节上皮细胞的迁移[22]、成纤维细胞的增殖和凋亡[23，24]，以及胶原原纤维的组织[24，25，26］．此外，研究发现lumican可与促炎细胞因子作用于小鼠心脏成纤维细胞的炎症调节[27］．lumican缺陷小鼠巨噬细胞对脂多糖(LPS)暴露的反应显示先天免疫功能受损[28］．此外，lumican可调节高潮气量机械通气致小鼠肺损伤的EMT [29］．然而，lumican在ARDS早期肺细胞中的潜在作用及其相互作用功能尚不清楚。

我们推测lumican可能参与ARDS早期的炎症反应和损伤修复。本研究旨在确定肺lumican水平是否与ARDS的肺部炎症、前纤维化反应和疾病严重程度相关，如果是这样，则通过临床和体外研究以及急性肺损伤(ALI)动物模型的结合，来阐明lumican在急性炎症和纤维增生修复过程中的可能作用，以探索潜在的机制。

研究人群

55名根据柏林定义被诊断为急性呼吸窘迫综合征而入住华西医院重症监护室(ICU)的受试者[30.都参与了这项研究。所有ARDS患者均接受机械通气。20例不符合ARDS标准的ICU机械通气患者作为通气对照。29名来自门诊、转诊进行纤维支气管镜检查且未发现临床显著肺部疾病的患者被纳入自主呼吸控制。年龄小于18岁和怀孕的患者被排除在外。所有患者在2017年12月至2021年4月期间接受筛查和登记。本研究方案根据《赫尔辛基宣言》原则设计，经四川大学华西医院临床伦理委员会批准(批准文号2017.195)。获得所有患者或其法定代理人的知情同意。

临床资料及样本的获取

通过仔细的病史记录获得人口统计学和人体测量数据(年龄、性别、身高和体重)、主要主病、病史和其他临床信息。BALF样本根据美国胸科学会指南采集[31］．纤维支气管镜的禁忌症标准是心肺不稳定或严重出血性。在ARDS诊断后24小时内采集样本(包括血清和BALF)。对照组也收集了同样的信息。西藏扶贫办₂/ FiO₂从ARDS患者插管后抽取的第一次血气标本中采集血气比值、血乳酸和血pH值。

抗体和试剂

兔抗lumican (cat.ab168348)和E-cadherin (cat.ab40772)单克隆抗体购自Abcam公司(Cambridge, MA, USA)。兔抗slug (cat.9585)、β-肌动蛋白(cat.4970)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA;MAPK (ERK;cat.4695)，磷酸化p44/42 MAPK (p-ERK;cat.4370)单克隆抗体购自Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)。兔抗α -1型ⅲ胶原蛋白(COL3A1;cat.A3795)多克隆抗体购自ab克隆科技(武汉)有限公司。小鼠抗纤维连接蛋白单克隆抗体(cat.250073)购自禅生物科技(成都)有限公司。Alexa Fluor®488山羊抗兔(cat.4412)和Alexa Fluor®594山羊抗小鼠(cat.8890)二抗均购自Cell Signaling Technology。重组人白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α和lumican蛋白购自研发系统公司(Minneapolis, MN, USA)。

动物模型

所有在动物身上进行的实验步骤均符合arrival (Animal Research: Reporting of in Vivo Experiments)准则，并得到四川大学华西医院动物伦理委员会的批准。6 - 8周龄雄性C57BL/6小鼠购自北京华福康生物科技有限公司(北京，中国)。小鼠被安置在特定的无病原体动物设施中，在一个保持适当温度和湿度的房间里，以12小时光照/12小时黑暗为周期。在给予异氟醚吸入麻醉后，小鼠经气管内用LPS (大肠杆菌O111:B4, Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)溶解于生理盐水中，剂量为5mg /kg，每只小鼠的总体积为50 μL，或单独使用50 μL生理盐水作为对照，使用非侵入性气管内MicroSprayer™(Penn-Century Inc.， Wyndmoor, PA, USA)，如我们之前所述[32］．LPS攻毒后第1、3、7天，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)处死小鼠，心脏穿刺放血。结扎左主支气管，右肺灌洗0.5 mL无菌冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)加蛋白酶抑制剂3次，回收率达90%以上。然后解剖右肺叶，快速冷冻，并储存在液氮中进行进一步分析。取左肺，4℃4%中和甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，5 μm切片。冷冻肺切片，左肺注射200 μL包埋液(100 μL 4%多聚甲醛和100 μL最佳切割温度化合物的混合物)，4℃4%多聚甲醛固定24 h, 4℃30%蔗糖脱水48 h, 5 μm冷冻切片，-20℃保存。

在活的有机体内腺相关病毒9介导的lumican基因敲除

腺相关病毒-9 (AAV-9)载体是将小鼠荧光短发夹RNA (shRNA)片段克隆到腺相关病毒载体GV628(上海基因化学股份有限公司，中国上海)。将携带小鼠lumican shRNA或打乱shRNA的重组AAV以3.5 × 10的剂量气管内给药¹¹每只小鼠50 μL PBS中的V.G/mL。对照组小鼠接受等量的PBS。四周后，小鼠经气管内注射LPS进行ARDS建模，并在LPS攻毒24小时后处死。

组织化学、免疫组织化学和免疫荧光分析

肺组织石蜡切片用苏木精-伊红和马松三色染色。为了进行免疫组化分析，组织切片在二甲苯中去亲和，在酒精中再水化，在清洗和正常血清阻塞后，与包括人抗卢米卡抗体(1:100)在内的一抗在室温下孵育1小时。然后，用抗兔二抗和结合链霉亲和素-辣根过氧化物酶孵育。然后用新制备的二氨基联苯胺显色剂覆盖每个组织切片几分钟，以证明最佳染色。最后，所有载玻片用苏木精反染色，用酒精和丙酮脱水后装入。为了进行免疫荧光分析，将肺冷冻切片在PBS中洗涤，在5%牛血清白蛋白(BSA)和0.3% Triton中室温封闭1小时，并与兔抗lumican抗体(1:100)和小鼠抗纤连蛋白抗体(1:50)在4℃孵育过夜。接下来，切片用荧光染料偶联二抗(1:500)孵育。最后，切片用含有4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI;Abcam, Cambridge, MA, USA)。图像由Eclipse E800显微镜(尼康，日本)拍摄。

细胞培养

原代人肺成纤维细胞(HLF)和原代人小气道上皮细胞(SAECs)购自Lifeline Cell Technology (Oceanside, CA, USA)。saec在补充了支气管生命生命因子试剂盒的支气管生命上皮基础培养基中培养，HLF在纤维生命成纤维细胞基础培养基中使用纤维生命S2成纤维细胞生命因子试剂盒(均来自Lifeline Cell Technology)培养。所有细胞在37℃5% CO中培养₂环境。

细胞刺激

基于细胞活力测定结果(数据未显示)和以前的研究[25]，用10 ng/mL IL-6、10 ng/mL IL-8和20 ng/mL TNF-α以70%-80%汇合处理HLF和saec 24 h。用25 ng/mL和50 ng/mL重组人lumican处理SAECs。在lumican处理后48 h收集总RNA，在72 h收集总蛋白和细胞培养上清。分别用50 ng/mL和100 ng/mL重组人lumican处理HLF 48 h，收集mRNA。处理72 h后收集蛋白和细胞培养上清。对于所有体外研究，进行了三个独立的实验，每个实验中每个处理都有三个孔。

实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

总RNA使用E.Z.N.A.总RNA试剂盒I (Omega Bio-tek Inc, Norcross, GA, USA)提取。接下来，按照制造商的方案，使用PrimeScript™RT Reagent Kit和gDNA Eraser (RR047A, Takara, Japan)将mRNA逆转录并合成为互补DNA。采用FastStart Essential DNA Green Master (Roche, Penzberg, Germany)进行实时RT-PCR，重复3次。引物序列在附加文件中列出1:表S1。所有结果均以归一化到GAPDH的折差形式表示。数据采用定义为2的比较阈值循环法进行分析^−ΔΔCT．

磁光测定

所有人类研究参与者和小鼠的血液和BALF样本在230 g和4℃下离心10分钟。收集上清液，3685 g 4℃离心15 min， -80℃保存，待进一步测定。根据制造商说明，使用人磁Luminex法(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)在Bio-Plex 200系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)上测定人血清和BALF中的Lumican、纤连蛋白、IL-6、IL-8和TNF-α水平。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

收集的细胞培养上清液立即以250 g离心5 min，保存顶部清澈透明的液体，-80℃保存。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒(研发系统)测量细胞培养上清液中lumican的浓度和人BALF α -1型胶原蛋白(COL1A1)水平。使用小鼠Lumican ELISA试剂盒(Biovision, Milpitas, CA, USA)测量小鼠BALF中的Lumican水平。使用从DLDevelop(中国无锡)购买的ELISA试剂盒检测BALF中的人COL3A1和小鼠COL3A1、纤连蛋白和TNF-α水平。

Western blotting分析

收集细胞，并使用双吲哚酸法测定总蛋白浓度(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)。用抗COL3A1(1:500)、α-SMA(1:100 000)、E-cadherin(1:100)、ERK(1:100)、p-ERK(1:100)、Slug(1:100)和β-actin(1:100)的一抗检测样品，4℃孵卵过夜。二抗(抗兔IgG, Cell Signaling Technology)用Tween (TBST;1:500)室温孵育1小时。信号检测采用Tanon-5200化学发光系统(Tanon科技有限公司，中国上海)。

统计分析

未配对的t-test或Mann-Whitney检验根据数据的分布进行比较。对三个或三个以上组的数据进行单向方差分析，然后根据数据的分布进行Tukey的事后检验或Kruskal-Wallis检验。采用双因素方差分析比较两个自变量组间的均数。采用Spearman相关分析(临床数据)或Pearson相关分析(体内数据)检验两因素之间的关系。使用SPSS for Windows版本20 (IBM Corp.， Armonk, NY, USA)或GraphPad Prism版本8.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)进行统计分析。所有统计数字均由GraphPad Prism 8.0创建。一个p-value < 0.05为有统计学意义。

研究参与者的配置

研究共纳入55例ARDS患者，20例机械通气对照组和29例自主呼吸对照组。ARDS组包括感染性肺炎24例，非肺脓毒症11例，术后7例，创伤相关6例，其他类型ARDS 7例。两组间在体重指数、年龄或性别方面无显著差异。研究参与者的一般临床特征见表1．

ARDS组BALF lumican升高，且与促纤维化因子呈正相关

虽然ARDS组、通气对照组和自主呼吸对照组之间的血清lumican水平无显著差异(p> 0.05;无花果。1A)， ARDS组BALF中lumican水平(12968.47 pg/mL [5387.91-34,446.62] pg/mL)明显高于通气对照组(2472.10 pg/mL [1070.86-3887.35 pg/mL])和自主呼吸对照组(677.87 pg/mL [291.27-2047.76 pg/mL];p< 0.0001;无花果。1B). ARDS组BALF中纤维连接蛋白、COL1A1和COL3A1的水平也明显高于对照组(所有p< 0.0001;无花果。1一部)。此外，BALF中lumican水平与BALF中纤连蛋白、COL1A1和COL3A1水平呈正相关(图2)。1F-H)。

BALF lumican与BALF促炎细胞因子(PaO)水平相关₂/ FiO₂比例，以及SOFA得分

ARDS组BALF中促炎细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α水平明显高于对照组(图2)。2a - c)。Spearman相关分析显示BALF中lumican水平与BALF中IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关(图2)。2D-F)。

我们试图确定BALF荧光蛋白水平与PaO之间的关系₂/ FiO₂比率，用来定义急性缺氧呼吸衰竭。我们发现BALF荧光蛋白水平与PaO呈负相关₂/ FiO₂比例(图。3.一个;r= -0.5142,p< 0.0001)。此外，BALF lumican水平与SOFA(序贯器官衰竭评估)评分呈正相关(图2)。3.B;r= 0.3505,p= 0.0025)，这表明这些患者病情危重。

Lumican在lps诱导的ALI小鼠肺中增加

LPS刺激小鼠的肺组织显示典型的肺损伤，包括弥漫性肺泡损伤、炎症细胞浸润和更多纤维的组装，早在对苏木精-伊红和马松三色染色进行LPS刺激24小时后(图。4A)。与此同时，免疫组化显示，在lps诱导的ALI小鼠的肺泡壁和气道上皮中lumican的表达增加(图。4A)。此外，肺纤维化病变在LPS攻毒后的第3天和第7天保持不变(补充文件1:图S1 A)。

脂多糖诱导ALI小鼠BALF lumican与BALF促炎细胞因子和促纤维化细胞因子的相关性

荧光酸的浓度(图;4B)， TNF-α，纤维连接蛋白和COL3A1(附加文件1:图S1 b d)在LPS攻毒后第1天，ALI小鼠BALF中的含量明显高于对照组小鼠。BALF TNF-α和纤连蛋白水平在第1 - 7天呈下降趋势，而lumican和COL3A1水平保持相对稳定。此外，BALF荧光蛋白水平与BALF中TNF-α、纤维连接蛋白和COL3A1水平呈正相关(图2)。4一部)。

TNF-α增加了HLF中lumican的表达

TNF-α是一种促炎细胞因子，据报道可诱导心脏成纤维细胞释放lumican [27］．既往研究表明TNF-α参与ARDS的发展，并可调节早期ARDS的纤维化过程[33］．在本研究中，为了研究TNF-α和lumican对HLF激活的影响，我们给药20 ng/mL TNF-α刺激细胞(浓度根据之前的研究选择[25]和细胞活力测试)。刺激后，我们发现lumican mRNA的表达显著增加(图。5A).与对照组相比，TNF-α处理组在培养基中分泌了更多的lumican蛋白(图;5B).然而，IL-6和IL-8对HLF中lumican mRNA的表达均无显著影响(附加文件1:图S2)。

Lumican可调节HLF中成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变

接下来，我们试图探索从HLF释放的lumican的功能。我们用不同浓度的重组lumican培养HLF。用lumican培养的细胞表现出较高的α-SMA mRNA表达，在Western blotting实验中也得到了类似的结果(图2)。5我们还证明了lumican处理的HLF中磷酸化ERK和Slug蛋白的水平高于对照细胞(图2)。5D)。

Lumican调节saec的上皮-间充质转化

正如我们自己的研究团队和其他研究人员所观察到的[34]，免疫组化染色显示lumican也分布于肺泡和小气道上皮细胞(图。4因此，我们用lumican (25 ng/mL和50 ng/mL)处理SAECs，以确定lumican在肺上皮中是否具有类似的促纤维化作用。用lumican培养24小时后，SAECs呈纺锤状形态(图2)。5E)， E-cadherin表达降低，α-SMA和COL3A1表达上调(图。5此外，lumica处理的saec中磷酸化的ERK和Slug蛋白水平升高(图2)。5G)。

Lumican敲除可减少lps诱导ALI小鼠肺ECM沉积

为了进一步证实lumican在体内参与了ALI早期的肺纤维化过程，我们通过气管内给药aav -包装的shRNA在小鼠体内实现了lumican在肺中的敲除。结果表明，在凌乱shRNA和PBS处理之间，lumican的表达没有差异，但给药lumican shRNA显著降低了盐水和lps处理小鼠肺组织中lumican的表达(图2)。6此外，在lumican shrna处理的小鼠中，纤维连接蛋白和COL3A1的BALF水平明显低于打乱shrna处理的小鼠(图。6B, C)。组织免疫荧光染色证实，aav介导的lumican shRNA递送降低了lumican蛋白的表达，并抑制了lps诱导的肺纤维连接蛋白沉积(图。6D)。此外，Masson的三色染色进一步证实，在lps刺激的小鼠肺部炎症早期，lumican的敲除缓解了纤维化病变(图。6E)。

越来越多的证据表明，ARDS的经典三个阶段，即初始炎症期、纤维增生、间质和肺泡内纤维化，并不是独立的步骤，而是一个不可分割的相互作用的过程。例如，先前的一项研究表明，早在诊断后24小时，ARDS患者的BALF中，有丝分裂活性强，n端前胶原肽- iii水平升高，这是驱动肺胶原沉积的两个关键机制[10］．一项大型人群样本临床尸检的前瞻性队列研究也显示，ARDS发病后早期发生纤维增生性改变;超过一半的ARDS患者在进化的第一周内就注意到了这些变化[7］．此外，ARDS诊断当天进行的HRCT可检测到纤维增性放射学异常，HRCT评分较高预示预后不良和机械通气延长[9］．同样，在实验性ARDS动物模型中，在LPS刺激后24小时，发现小鼠肺的肺泡间隔中沉积了一层薄薄的III型胶原[35]，并且早在损伤诱导后24小时，百草枯诱导的ALI大鼠的胶原蛋白和弹性成分就显著增加[36］．在本研究中，在诊断后24小时内从ARDS患者收集的BALF样本中，纤维连接蛋白、COL1A1和COL3A1水平远高于从对照组收集的BALF样本。在博莱霉素诱导的大鼠肺损伤模型的早期炎症期，纤维连接蛋白也出现了类似的升高，并伴有透明质酸的产生和肺纤维化的发展[37］．缺乏含有额外III型结构域的纤维连接蛋白的小鼠在博莱霉素攻击后没有发生明显的肺纤维化[38］．胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白，在修复过程中被强烈诱导，包括肺纤维化[39］．III型胶原蛋白的积累形成原纤维并调节其直径，也是许多慢性纤维化疾病的关键过程，包括心脏纤维化和肺纤维化[40］．我们研究的一个值得注意的发现是肺泡内的lumican水平，一种不可或缺的ECM成分[17，41]， ARDS组明显高于对照组(通气或自主呼吸)组，且与纤连蛋白、COL1A1和COL3A1水平呈正相关。此外，在我们的体内研究中，正如预期的那样，在LPS刺激后24小时内，LPS刺激小鼠的肺组织中比盐水处理小鼠的肺组织中沉积了更多的lumican。与我们在临床实验中的发现一致，小鼠BALF lumican水平与BALF纤连蛋白和COL3A1水平呈正相关。这些结果表明，释放到肺泡间隙的lumican可能在ARDS的早期纤维化反应中起重要作用。

急性低氧血症是ARDS的一个标志，难治性低氧血症继续对ARDS的治疗构成重大挑战，并导致相当高的死亡率[42，43］．西藏扶贫办₂/ FiO₂通过动脉血气分析来评估低氧血症程度的比值在评估ALI/ARDS患者中至关重要[44］．这项研究提供了新的数据，表明BALF中lumican水平与PaO呈正相关₂/ FiO₂比率。此外，我们发现BALF lumican水平与SOFA得分呈正相关。该评分系统广泛用于评估ARDS患者的病情严重程度和预测预后[45］．此外，我们观察到ARDS组BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平远高于对照组。有研究表明，几种促炎细胞因子在ARDS的发病机制中是必不可少的。例如，IL-8可以引发中性粒细胞呼吸爆发[46]， TNF-α刺激促炎细胞因子的产生并增加氧化应激[33]，当可溶性IL-6及其受体锚定在膜gp130上时，即使是基质细胞和上皮细胞也可诱导COVID-19急性呼吸综合征的明显炎症反应[47］．有趣的是，我们发现在ARDS患者和对照组中，lumican与上述所有促炎细胞因子均呈正相关。在我们的ALI小鼠模型中，BALF中lumican、TNF-α、纤连蛋白和COL3A1的水平早在LPS攻毒后24小时(第1天)就升高了。与第1天的浓度相比，TNF-α在第3天和第7天显著下降，而lumican和COL3A1水平随着时间的推移保持相对稳定。这些结果表明，纤维化反应可能在损伤和炎症反应发生后立即开始，即使炎症减轻，纤维化过程也可能持续一段时间。

既往研究表明，在正常肺组织中，lumican常在支气管周围结缔组织、支气管上皮和成纤维细胞中弱表达，但在各种病理状态下lumican表达升高[48，49］．我们目前的研究发现，在lps刺激小鼠的肺组织中，lumican的表达显著增加。此外，ARDS患者BALF lumican水平显著升高，并与BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平呈正相关。因此，我们试图确定这些促炎细胞因子是否会通过IL-6、IL-8和TNF-α刺激HLF来刺激肺细胞产生更多的lumican。有趣的是，只有TNF-α可以激活HLF产生更多的荧光素。有研究表明TNF-α可刺激成纤维细胞分泌荧光素，促进单核细胞向纤维细胞分化[25］．我们目前的研究结果表明，肺损伤后lumican的释放增加可能归因于ARDS炎症过程中早期促炎细胞因子的释放增加。

接下来，我们试图确定升高的lumican在ARDS损伤肺中是否具有自身的生物活性。最近的一项研究表明，在lumican缺陷小鼠的主动脉束带后，胶原交联和肌成纤维细胞转分化显著减少[50］．研究发现Lumican可增加心脏成纤维细胞胶原蛋白的表达[27]并在肝纤维化中发挥重要作用[51］．此外，在通气诱导的肺损伤小鼠模型中，升高的lumican被证明通过ERK途径参与EMT过程[29］．为了确定lumican在肺损伤中的可能作用，我们用不同浓度的重组lumican培养原代人SAECs和HLF，发现lumican诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化以及SAECs中的EMT。肌成纤维细胞的聚集对病理性纤维化和正常组织伤口愈合至关重要[52］．此外，当肺上皮细胞对损伤做出反应时，会发生EMT，这有助于纤维化组织的形成[53］．先前的研究表明，ERK/ MAPK信号通路的突变有助于EMT程序的激活和癌症的进展[54］．Slug是蜗牛家族转录因子中的一员，据报道与EMT有关，其合成在伤口愈合中受ERK调节[55］．在我们的研究中，我们发现lumican显著增加了HLF和SAECs中的ERK磷酸化和Slug表达。因此，我们的研究结果表明，由促炎细胞因子(如TNF-α)诱导的lumican可以通过激活ERK/Slug信号通路诱导肌成纤维细胞向肺成纤维细胞的转分化和肺上皮细胞的EMT。在体内进一步探讨lumican在肺损伤早期肺纤维化过程中的作用。我们证明，aav介导的lumican敲除可显著抑制LPS刺激后24小时ALI小鼠肺中纤维连接蛋白和胶原蛋白等ECM成分的产生，并缓解肺纤维化病变，证实了lumican在ARDS发展的早期纤维化前反应中的潜在作用。

我们的研究有一些局限性。首先，尽管我们发现lumican在lps刺激的小鼠肺组织中上调，但我们无法获得患者ARDS早期过程中的肺组织病理学。其次，ARDS患者诊断为ARDS后，长期未随访其肺纤维化过程和lumican产生的变化。然而，据我们所知，这是第一个证明BALF中lumican水平在ARDS中显著升高，并与临床指标和BALF中促纤维化细胞因子和促炎症细胞因子水平呈正相关的研究，提示肺损伤后lumican在ARDS早期过程中发挥作用。此外，我们的体外和体内联合研究表明，lumican的产生是由炎症诱导的，并可以促进肺损伤的纤维化反应。

总之，这项研究表明，在ALI/ARDS早期，肺部lumican水平升高，并与肺部炎症、前纤维化反应和疾病严重程度相关。此外，促炎细胞因子TNF-α诱导HLF产生lumican, lumican可以通过ERK/Slug信号通路触发HLF肌成纤维细胞和SAECs EMT肌成纤维细胞的转分化，从而促进纤维化过程(图2)。7)．此外，在肺组织中敲除lumican可减弱lps诱导的ALI小鼠模型中肺ECM沉积和纤维化病变。因此，lumican可能在ALI/ARDS的发展过程中充当炎症和纤维化之间的桥梁，可能是一种新的治疗ARDS的靶点。

用于支持本研究结果的数据可根据合理要求从相应作者处获得。

AAV:

腺相关病毒

ARDS:

急性呼吸窘迫综合征

αsma:

α-平滑肌动蛋白

BALF:

支气管肺泡灌洗液

COL1A1:

α -1型胶原蛋白

COL3A1:

α -1型胶原蛋白

ECM:

细胞外基质

EMT:

Epithelial-to-mesenchymal过渡

HLF:

人肺成纤维细胞

有限合伙人:

脂多糖

il - 6:

白介素- 6

引发:

白介素8

PaO₂/ FiO₂：

O分压₂/灵感的分数₂

PBS:

磷酸盐

SAECs:

人小气道上皮细胞

成分:

短发夹RNA

SLRP:

小的富含亮氨酸的重复蛋白

沙发:

顺序器官衰竭评估

肿瘤坏死因子-α:

肿瘤坏死因子-α

不适用。

本研究由四川大学华西医院1·3·5优秀学科项目(ZYGD18006)资助;国家自然科学基金项目(81230001、81900080);四川省科技厅重点研发计划项目(批准号:2020YFS0146);

作者指出

1. 王珂、王友宇、曹玉芳、王浩对这项工作贡献很大

作者及隶属关系

1. 四川大学华西医院肺疾病科，生物治疗国家重点实验室，呼吸与重症医学科，四川省成都市国学巷37号，610041

   王珂，王浩，高丽娟，曾子健，程梦新，陈军，文富强，王涛

2. 四川省医学科学院、四川省人民医院胸外科，中国成都

   右玉王

3. 中南大学湘雅医学院附属海口医院重症医学科，海口，中国

   裕方曹

4. 四川大学华西医院重症医学科，成都，中国

   周永芳，金晓东

贡献

KW, FW, TW设计实验，分析数据，撰写论文;KW、HW、LG进行实验;YW、CY、YZ、XJ获得人体样本，收集临床资料;ZZ、MC和JC分析了数据。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到富强温或王涛．

伦理批准并同意参与

临床研究方案经四川大学华西医院临床伦理委员会批准(批准文号:2017.195)。获得所有患者或其法定代理人的知情同意。动物研究方案符合arrival指南，经四川大学华西医院动物伦理委员会批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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