血清三甲胺- n -氧化物与中老年人发生2型糖尿病相关:一项前瞻性队列研究

背景

三甲胺- n -氧化三甲胺(TMAO)在糖尿病发展中的作用仍然存在争议，前瞻性数据很少。本研究旨在调查中老年人血清氧化三甲胺与2型糖尿病发病之间的关系。

方法

本研究基于广州营养与健康研究(GNHS)，这是一项基于社区的前瞻性队列研究。从2008年到2010年，共有2088名年龄在40-75岁之间的无糖尿病参与者被纳入研究。在随访中确定了2型糖尿病的发生。采用高效液相色谱-在线电喷雾电离串联质谱法测定基线血清TMAO。使用Cox比例风险模型计算糖尿病在血清三甲氧化三甲胺中风险比(HRs)和95%置信区间(95% ci)。使用线性混合效应模型(LMEMs)估计血清TMAO与血糖指标(空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、HOMA-IR)随时间变化的前瞻性相关性。

结果

在中位数8.9年的随访中，我们确定了254例2型糖尿病发病病例。血清TMAO中位数(四分位范围)为1.54 (0.86 ~ 2.91)μmol/L。从血清TMAO的第一至第三百分位，糖尿病的多变量调整hr分别为1.00(参考)、1.17 (95% CI: 0.84-1.61)和1.42 (95% CI: 1.03-1.96) (P-trend = 0.031)。LMEMs显示，血清TMAO最高不育点的估计空腹葡萄糖年变化为0.011 (0.001-0.022)mmol/L/y，与最低不育点(P-interaction = 0.044)。血清TMAO与HbA1c、胰岛素或HOMA-IR的纵向变化无关。

结论

我们的研究结果表明，在中国中老年成年人中，较高的血清TMAO与较高的2型糖尿病风险和空腹血糖升高有关。

试验注册:NCT03179657。https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03179657?term=NCT03179657&draw=2&rank=1

糖尿病已经成为一个严重的公共卫生问题。2021年，全球成人糖尿病患者人数已上升至5.37亿[1］．中国正在经历前所未有的糖尿病流行，患病率从1980年的0.67%上升到2018年的12.4% [2］．2型糖尿病是糖尿病中最常见的一种，患有2型糖尿病的患者心血管疾病的风险很高[3.］．心血管疾病是糖尿病的主要并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因[4，5，6，7］．

生活方式因素有助于2型糖尿病的发生和发展，研究表明饮食和肠道菌群可能会影响2型糖尿病[8］．氧化三甲胺(TMAO)天然存在于海鱼中，而含有胆碱、甜菜碱或肉碱的动物或植物源食物也会产生TMAO [9］．膳食中的胆碱、甜菜碱和肉碱被肠道菌群转化为三甲胺(TMA)。TMA随后在肝脏中被含黄素的单加氧酶-3 (FMO3)氧化为TMAO [10］．最近的动物研究表明，TMAO在葡萄糖和脂质稳态中发挥作用，这可能导致糖耐量受损、胰岛素抵抗、脂肪组织氧化应激[11，12］．氧化三甲胺可能是饮食、肠道菌群和生活方式相关疾病之间的潜在联系[13］．流行病学研究的大量证据表明，循环中氧化三甲胺水平较高与肥胖风险增加有关[14]、非酒精性脂肪肝[15]，以及心血管疾病[16]。一方面，肥胖、炎症和其他心血管危险因素在2型糖尿病的发生中起着重要作用[17，18，19，20.];另一方面，2型糖尿病与上述生活方式相关疾病有许多共同的危险因素或潜在机制，因此TMAO水平升高也可能增加2型糖尿病的风险。

最近的一项荟萃分析表明，循环三甲氧化三甲胺水平与2型糖尿病风险增加之间存在剂量依赖性正相关[21］．由于报道有限，本荟萃分析中纳入的大多数研究都检查了TMAO与心血管疾病或纳入了心血管高风险参与者之间的关系，但很少有研究是针对糖尿病的。因此，一系列心血管相关指标可能导致异质性。虽然横断面研究和病例对照研究发现，较高的循环氧化三甲胺水平与糖尿病风险增加有关[22，23]，来自心血管健康研究的一项针对美国老年人的前瞻性研究并没有显示出积极的相关性[24］．最初调查循环氧化三甲胺与糖尿病风险之间关系的纵向观察性研究很少，且结果不一致。一项地中海老年人的病例队列研究报告了反相关性[25];挪威疑似稳定型心绞痛患者的前瞻性队列研究报告无相关性[26］．不同地区研究人群的饮食模式差异和遗传变异也可能是结果不一致的潜在原因。在这些研究中，大多数参与者来自美国和欧洲，而在亚洲进行的研究很少[27，28］．

因此，在这项中位随访8.9年的基于社区的前瞻性队列研究中，我们旨在检查血清TMAO与(1)2型糖尿病发病率之间的时间关系和相关程度;(2)华南地区空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素等血糖指标的年度变化及胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)。

研究设计

本研究的数据来自广州营养与健康研究(GNHS)，这是一项正在进行的基于社区的前瞻性队列研究。在2008年7月至2010年6月期间，我们纳入了3169名参与者，他们在广州(华南)生活了5年以上，年龄在40-75岁之间。在基线和每三年进行一次问卷调查、人体测量、血压测量和空腹采血，并进行三次随访，直至2021年3月。GNHS的研究方案已在ClinicalTrials.gov上注册，编号为NCT03179657，并获得了中山大学公共卫生学院伦理委员会的批准。获得每位参与者的书面知情同意。

我们根据预先规定的标准排除了参与者:(1)基线时的糖尿病(n= 197);(2)自述恶性肿瘤(n= 10)、慢性肾功能衰竭(n= 6)、中风(28)或心肌梗塞(n= 20)基线;(3)未测量TMAO (n= 196)或空腹血糖(n= 150);(4)能量摄入极高或极低(男性>为4000千卡/天或< 800千卡/天;女性>为3500千卡/天或< 500千卡/天)(n= 37);(5)饮食变量或其他变量(如社会人口统计)的数据缺失(n= 75);(6)没有任何关于2型糖尿病的随访数据(n= 362)。最后，2088名参与者被纳入本分析(附加文件1:图S1)。

实验室分析

夜间禁食12 h后采集静脉血，3000r/min离心15 min, alialic保存，待分析。我们采用高效液相色谱-在线电喷雾电离串联质谱(HPLC-MS /MS)检测血清TMAO、胆碱和甜菜碱(Agilent 6400系列Triple Quad LCMS;美国CA)，如上文所述[15］．简而言之，将60 μl血清样品或标准品与100 μl乙腈混合，其中含有10 μM内部标准品9-TMAO (Toronto Research Chemicals Inc, Toronto, Canada) d9-胆碱和d9-甜菜碱(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)。然后在13000 × g下离心10 min，沉淀蛋白。剩余上清液注入SiO₂柱(2.1 mm × 100 mm, 5 μm)。采用30% A溶液(15 mmol/L甲酸铵，pH = 3.0)和70% B溶液(乙腈)等容洗脱，流速为0.2 mL/min。洗脱后用质谱法检测样品。TMAO的分析内变异系数为6.0%，胆碱为4.91%，甜菜碱为6.21%。

使用罗氏cobas 8000 c702自动分析仪在基线和随访时测量空腹血糖和胰岛素。HbA1c检测采用高效液相色谱法，采用Bole -10血红蛋白A1c程序在Bole -10血红蛋白检测系统上进行。空腹血糖和糖化血红蛋白的实验内变异系数分别为2.52%和0.75%。HOMA-IR计算公式为:血清空腹葡萄糖(mmol/L)*血清胰岛素(μIU/mL)/22.5 [29］．使用罗氏cobas 8000 c702全自动分析仪测定基线时血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。TC、TG、LDL-C和HDL-C的分析内变异系数分别为2.17%、2.86%、4.67%和3.47%。血脂异常定义为TC≥6.2 mmol/L;LDL-C≥4.1 mmol/L;HDL-C男性< 1.03 mmol/L，女性< 1.29 mmol/L;TG≥2.3 mmol/L;或自我报告用药[30.］．在第一次随访时，使用日立7180自动分析仪使用酶比色法(Sekisui Chemical Co.， Ltd, Tokyo, Japan)测定血清肌酐。分析内变异系数为4.43%。估算肾小球滤过率(eGFR)采用慢性肾脏病流行病学合作方程[31］．根据2012年KDOQI临床实践指南，肾功能受损定义为eGFR < 60 mL/min/1.73 m²，肾功能正常或轻度下降定义为eGFR≥60 mL/min/1.73 m²［32］．

2型糖尿病病例的评估

根据美国糖尿病协会2型糖尿病诊断，在基线(排除)和随访时确定2型糖尿病病例，如果参与者满足以下条件之一:空腹血糖≥7.0 mmol/L，糖化血红蛋白≥6.5%，或自我报告糖尿病药物[33］．我们确定了254例事件，平均随访时间为8.9年。

协变量的评估

训练有素的调查人员在基线和每次随访时进行面对面访谈。我们收集了人口统计学特征(如年龄、性别、家庭收入和教育水平)、生活方式(如吸烟状况、饮酒和饮茶)、慢性疾病史和药物使用等信息。身体活动，包括锻炼、闲暇时间活动、家务和职业相关活动以及其他日常活动，采用19项问卷和代谢当量·h/d [34］．一份经过验证的79项食物频率问卷用于估计过去一年的习惯性饮食摄入量[35］．能量摄取量根据2004年中国食物成分表计算[36］．

由训练有素的项目成员在基线和每次随访时使用相同的方法和设备测量人体测量和血压。当参与者脱下鞋子，穿着轻薄的衣服时，测量身高和体重的精度为身高0.1厘米，体重0.1公斤。当参与者站直时，测量腰围和臀围，精确到0.1厘米。在参与者舒适地坐着至少10分钟后，用水银血压计测量左臂的血压。所有指标都测量了两次，并计算所有读数的平均值以供数据分析。体重指数(BMI)为体重(kg)除以身高(m)的平方²)．腰臀围之比(WHR)等于腰围(cm)除以臀围(cm)。腹部肥胖定义为男性腰臀比≥0.90 cm或女性腰臀比≥0.85 cm [37］．高血压定义为自我报告的高血压药物，收缩压(SBP)≥140 mmHg或舒张压(DBP)≥90 mmHg [38］．

统计分析

血清TMAO按性别分为3组:男性0.63、1.42、3.73 μmol/L;女性为0.67、1.37、4.30 μmol/L;对连续变量采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验，χ²测试分类变量。定量变量以均数±标准差(SD)或中位数(四分位间距，IQR)表示，分类变量以百分比(%)表示。

我们以最低剂量组为参考，采用Cox比例风险模型估计血清TMAO量与2型糖尿病发病之间的关系。模型1根据年龄和性别进行了调整。模型2对模型1加上家庭收入、吸烟状况、饮酒、饮茶、高血压、WHR、体育活动、总能量、鸡蛋、红肉和加工肉、鱼和贝类的摄入量、血清TG、HDL-C和空腹葡萄糖水平进行调整。给出了风险比(HRs)和相应的95%置信区间(95% ci)。将纺织品血清TMAO水平的中值作为Cox回归模型中的连续变量，计算线性趋势。我们还根据最终模型进行了灵敏度分析。我们重复分析排除基线后1年内发生的2型糖尿病病例或排除不在ln转化血清TMAO平均值±3SD范围内的2型糖尿病病例。我们还对eGFR进行了调整，排除了eGFR < 60 mL/min/1.73m的患者²．此外，血清胆碱和血清甜菜碱(tmao前体)在多变量调整Cox回归模型中进行了调整。使用限制性三次样条模型估计血清氧化三甲胺与糖尿病风险之间的潜在非线性关联。然而，我们没有发现任何显著的非线性关联。

我们对由几个预先定义的变量(年龄、性别、腹部肥胖、高血压、血脂异常、空腹血糖、红肉和加工肉摄入量、鱼和贝类摄入量、血清胆碱和血清甜菜碱)定义的亚组进行分层分析，以测试血清TMAO与2型糖尿病风险之间的相关性是否不同。我们还通过在多变量调整模型中添加乘法项来探索血清TMAO与预定义变量之间的相互作用。在对潜在混杂变量进行校正后，采用线性混合效应模型(LMEMs)检验血清TMAO含量与血糖指标(血清空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、HOMA-IR)年度变化之间随时间的前瞻性相关性。

数据由Epidata 3.0软件输入(Epidata协会，欧登塞，丹麦)，并由STATA统计软件15.0版本执行(STATA Corp.， TX)。一个双边P-value < 0.05为有统计学意义。

在中位随访8.9年(16,214人年)期间，2088名参与者中确定了254例2型糖尿病事件。72.7%的参与者为女性，基线时参与者的平均年龄为57.2岁(SD 4.9)，平均BMI为23.0 (SD 3.0) kg/m²．血清TMAO的中位数(IQR)为1.54 (0.86 ~ 2.91)μmol/L。血清三甲氧化三甲胺各组分的基线特征见表1．血清氧化三甲胺(TMAO)含量最高的参与者更有可能是吸烟者，食用更多的鸡蛋、鱼和贝类，腹部肥胖的患病率更高，糖化血红蛋白(HbA1c)水平也更高。三组间血清TMAO的其他基线特征无显著差异。额外的文件1:表S1列出了纳入的参与者和没有随访信息的参与者的基线特征。没有随访信息的参与者BMI、SBP、DBP、血清空腹葡萄糖和TG水平较高，收入水平低于受试者，但血清TMAO水平相似。

血清氧化三甲胺与2型糖尿病风险之间的关系见表2．在年龄和性别调整模型中，血清TMAO最高不育点的糖尿病HR为1.47 (95% CI: 1.08-2.01，P-trend = 0.033)。在最终模型中进一步调整基线社会人口学、生活方式、饮食因素、血清TG、HDL-C和空腹葡萄糖后，血清TMAO与2型糖尿病风险之间的正相关关系没有改变，HR为1.42 (95% CI: 1.03-1.96)。P-trend = 0.031)，将最高分位数与最低分位数进行比较。在敏感性分析中，血清TMAO与2型糖尿病风险之间的正相关在eGFR进行额外调整后没有改变。此外，排除eGFR < 60 mL/min/1.73m的患者后，无显著差异²，不包括基线后1年内发生的2型糖尿病病例，或不包括那些不在ln转化血清TMAO平均值±3SD范围内的病例1:表S2)。

按年龄(< 56[中位数]，≥56岁)、性别(男性、女性)、腹型肥胖(是、否)、高血压(是、否)、血脂异常(是、否)、空腹葡萄糖(< 4.5[中位数]，≥4.5 mmol/L)、红肉和加工肉类摄入量(< 78.3[中位数]，≥78.3 g/d)、鱼类和贝类(< 44.7[中位数]，≥44.7 g/d)、血清胆碱(< 18.9[中位数]，≥18.9 μmol/L)和血清甜菜碱(< 51.5[中位数]，≥51.5 μmol/L)分层分析如图所示。1．血清TMAO和基线空腹葡萄糖之间存在潜在的相互作用(P-interaction = 0.040)。与血清TMAO的第一胎相比，第三胎糖尿病风险的HR为1.65 (95% CI: 1.15-2.36)。P-trend = 0.006)在空腹血糖水平较高(≥中位数)的参与者中，但在空腹血糖水平较低(<中位数)的参与者中未观察到这种正相关。血清TMAO与其他预定义变量之间没有显著的相互作用。

在LMEMs(表3.)，血清TMAO最高不育点的空腹葡萄糖年变化估计为0.011 (0.001-0.022)mmol/L/y，与最低不育点(P-interaction = 0.044)。然而，血清TMAO与HbA1c、胰岛素或HOMA-IR的纵向变化之间未观察到显著相关性。

在这项为期8.9年的前瞻性队列研究中，我们发现血清TMAO水平较高与2型糖尿病风险增加和空腹血糖升高有关。

先前的研究已证实循环中氧化三甲胺浓度与心血管疾病风险之间存在正相关[16]并提出了对特定心脏代谢生物标志物的不利影响，如同型半胱氨酸、胰岛素和葡萄糖[39］．然而，氧化三甲胺与糖尿病风险之间的关系仍然不一致。我们的发现与几项横断面研究和病例对照研究一致，均显示出正相关[22，23，27]，而另一些人观察到逆[25或空关联[26，28］．一项荟萃分析(包括12项临床研究)报告了循环TMAO水平与糖尿病风险之间的正相关(OR: 1.89;95% ci: 1.63-2.19) [21］．然而，大多数纳入的研究集中在氧化三甲胺与心血管疾病的关系;只有四项研究涉及了氧化三甲胺和糖尿病之间的关系。在这些研究中，与心血管疾病相关指标的混淆可能仍然是一个问题。据我们所知，在充分调整重要生活方式因素的情况下，很少有研究旨在调查循环TMAO与2型糖尿病风险之间的前瞻性关联。在两组中国成年人2型糖尿病风险的代谢组学分析中，观察到正相关，但未达到统计学意义[28］．但是，该研究采用半定量测量的方法检测血浆TMAO，没有标准曲线，这与我们的研究不同。在疑似稳定型心绞痛的挪威患者中，未观察到TMAO与糖尿病发病的显著相关性[26]或在美国老年人中[24］．相反，在西班牙的高心血管疾病风险的老年人群中，Prevención con Dieta Mediterránea研究中的一项病例队列设计研究表明，较高的基线血浆TMAO与2型糖尿病风险降低有关[25］．遗传倾向和饮食习惯的差异可以解释不同地区研究结果的差异[40］．一项国际综合分析和其他基于人群的研究发现，特定动物食物与循环三甲氧化三甲胺水平之间的关联在不同人群中有所不同[39，41］．

TMAO循环浓度受多种因素影响，包括饮食、肠道微生物群和肝脏黄素单加氧酶活性[9]，这可能会改变循环氧化三甲胺和慢性疾病之间的关系。鱼类、红肉和鸡蛋是氧化三甲胺或氧化三甲胺前体的主要来源[42］．在这项研究中，血清TMAO与鱼类和贝类的摄入量有关，但与红肉的摄入量无关1)，结果与部分欧洲及亚洲人口的调查结果一致[39，43，44]，但在美国人群中，红肉与氧化三甲胺的相关性显著[42］．在最终模型中，我们调整了含TMAO食物的摄入量，包括鱼、红肉和鸡蛋，以减少潜在的混淆效应，血清TMAO与糖尿病之间的正相关关系没有改变。本研究缺乏肠道菌群或FMO3活性的数据，我们无法探索饮食、肠道菌群和宿主健康之间的相互作用。另一方面，氧化三甲胺由肾脏排出，而肾功能是影响循环中氧化三甲胺水平的主要因素[45，46］．一项包括32项合格临床研究的荟萃分析显示，循环氧化三甲胺与肾功能呈负相关[47］．为了减少肾功能的残留混杂，我们排除了慢性肾功能衰竭的受试者。估计肾小球滤过率(eGFR)在显示肾功能方面起着至关重要的作用[48］．在本研究中，小于5%的参与者(n = 84)肾功能受损(eGFR < 60 mL/min/1.73m)²)。此外，我们排除了eGFR < 60 mL/min/1.73m的受试者²并在敏感性分析中对eGFR进行了额外调整，但未发现实质性差异(附加文件1:表S2)。考虑到氧化三甲胺与糖尿病之间的关系仍不一致，肾功能可能介导这种关系，需要更多的研究来纳入eGFR，并确定氧化三甲胺、肾功能和糖尿病发病之间的相互作用。

循环氧化三甲胺与糖尿病标志物纵向变化之间关联的流行病学证据有限。在这项研究中，我们发现血清氧化三甲胺与空腹血糖水平的升高呈正相关。然而，一项纵向队列研究显示，在300名无糖尿病成年人中，TMAO水平与2年空腹血糖变化之间无相关性[49］．这一阴性结果可能是由于样本量小，随访时间短，影响了统计效力。未来需要进行大规模、长时间随访的前瞻性研究，以确定循环TMAO浓度与糖尿病发病及血糖指标变化之间的关系。

氧化三甲胺和糖尿病之间有几种可能的潜在机制。在小鼠高脂饮食中添加TMAO会加剧糖耐量受损，抑制肝脏胰岛素信号通路，增加脂肪组织炎症，导致胰岛素抵抗和糖尿病[50］．肠道微生物群启动的TMA-FMO3-TMAO通路已被确定为心脏代谢疾病发生和进展的一个因素[51，52］．Sudha B.Biddinger等发现FMO3通过产生TMAO诱导叉头盒转录因子O1 (FoxO1，代谢性疾病的关键驱动因子)。TMAO结合并激活内质网应激激酶PERK(细胞内应激的关键传感器)，然后PERK诱导FoxO1，促进胰岛素抵抗和代谢功能障碍[11］．此外，在胰岛素抵抗小鼠中，操纵肠道菌群或抑制FMO3可抑制TMAO的产生，降低PERK的激活并抑制肝脏中的FoxO1，这可能会防止高血糖的发生[11，51］．另一方面，我们前期研究报道TMAO可调节胆汁酸代谢，抑制胆汁酸介导的肝核受体法尼类X受体(FXR)信号通路加重肝脏脂肪变性[53］．胆汁酸调节和FXR通路也可调节葡萄糖代谢，导致肥胖和糖尿病[54］．然而，TMAO可能影响胆汁酸和FXR诱发糖尿病的研究尚未见报道。氧化三甲胺在糖尿病发病中的作用机制有待进一步研究。

本研究的优势包括前瞻性和以人群为基础的设计，超过8.9年的随访期和高随访率(> 85%)。此外，我们在统计模型中调整了各种已知的糖尿病危险因素，以减少潜在的混杂效应。然而，这项研究有一些局限性。首先，参与者是中国南方的中老年成年人，我们的发现仅限于推广到其他年龄组或人群。其次，我们仅在基线时测量血清TMAO。血清TMAO随时间的变化不能纳入数据分析。第三，我们没有进行口服糖耐量试验来确定2型糖尿病，这可能会导致未诊断的糖尿病病例。第四，我们的研究缺乏FMO3和肠道微生物群活性的数据，这两个因素决定了循环TMAO水平。

我们的研究表明，在中老年人中，较高的血清TMAO与2型糖尿病风险增加和空腹血糖增加有关。氧化三甲胺在糖尿病发病和进展中的作用尚需进一步研究。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

TMAO:

Trimethylamine-N-oxide

国民幸福总值:

广州市营养与健康研究

人力资源:

风险比

置信区间:

置信区间

差:

四分位范围

TMA,

三甲胺

FMO3:

Flavin-containing monooxygenase-3

HPLC-MS /女士:

高效液相色谱在线电喷雾电离串联质谱

TC:

总胆固醇

TG:

三酰甘油

密度:

低密度脂蛋白胆固醇

高密度脂蛋白胆固醇:

高密度脂蛋白胆固醇

体重指数:

身体质量指数

WHR:

腰臀围的比例

SBP:

收缩压

菲律宾:

舒张压

SD:

标准偏差

表皮生长因子受体:

估计肾小球滤过率

好处:

蛋白激酶r样内质网激酶

FoxO1:

叉头盒转录因子O1

FXR:

法尼索X受体

作者非常感谢所有为这项研究做出贡献的参与者。我们也感谢工作人员在数据和样本收集方面的支持。

国家自然科学基金项目(No. 81773415和81973016)和广州市科技计划重点项目(No. 201704020035)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

作者及隶属关系

1. 中山大学公共卫生学院营养系，广州510080

   李淑义，陈思，陆晓婷，方爱萍，黄荣珠，林新磊，黄子辉，马景飞，黄碧霞，朱慧莲

2. 中华人民共和国广州，中山大学公共卫生学院医学统计与流行病学系

   徼陈

3. 广东省食品、营养与健康重点实验室，中山大学公共卫生学院，广州，中华人民共和国

   方爱萍，朱慧莲

贡献

H-LZ和Y-MC对研究设计有贡献。S-Y L, SC, X-T L, R-Z H, X-L L, Z- H H和J-F M收集数据。S-Y L, B-X H和X-T L对数据进行分析。S-Y L撰写了手稿;H- l Z, SC, A-P F和B-X H对手稿进行了编辑和修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Bi-xia黄或Hui-lian朱．

伦理批准并同意参与

这项研究得到了中山大学公共卫生学院伦理委员会的批准。获得每位参与者的书面知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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