移植的同种异体心脏祖细胞分泌GDF-15，并刺激缺血心肌的主动免疫重塑过程gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

尽管临床研究的结果很有希望，但基于异体细胞的治疗的有益作用机制尚不清楚。巨噬细胞不仅是炎症的重要介质，而且是心脏重构的重要参与者。我们假设移植的同种异体大鼠心脏祖细胞(rcpc)增加t调节细胞，最终促进M2样巨噬细胞的增殖，其机制尚不明确。gydF4y2Ba

方法与结果gydF4y2Ba

为了验证这一假设，我们使用交叉大鼠品系探索同种异体CPCs心肌修复的机制。从接受冠状动脉搭桥术的成年患者中分离出人类cpc (hcpc)，从雄性Wistar-Kyoto (WKY)大鼠心脏中分离出大鼠cpc (rcpc)。体外混合淋巴细胞反应中观察到异基因rCPCs抑制t细胞增殖。移植的同基因或异基因rcpc在大鼠心肌梗死(MI)模型中显著增加心功能，而异种CPCs则没有。异基因rCPCs通过特异性增加t调节细胞和M2极化来刺激免疫调节反应，同时保持其心脏恢复潜力和安全性。gydF4y2Ba

从机制上看，我们通过移植的CPCs衍生的GDF15证实了心肌梗死后Treg细胞NF-kB的失活和心肌M2巨噬细胞的增加，并被免疫细胞上的CD48受体摄取。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

总的来说，这些发现有力地支持了同种异体CPCs在心肌梗死后心功能障碍中的积极免疫调节特性和强大的治疗潜力。gydF4y2Ba

由于心脏干细胞具有抗炎和组织修复的特性，人们越来越多地研究其作为潜在的异体细胞疗法来治疗各种炎症性疾病，包括缺血性心脏病、心力衰竭和先天性心脏病[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．尽管移植的自体细胞诱导很少或没有免疫反应，并在临床试验中显示出疗效，但自体心脏来源的细胞治疗由于从患者心脏组织制备细胞的额外延迟而变得复杂。此外，由于患者的年龄差异、疾病严重程度、共病和药物的不同，自体细胞的临床疗效可能存在显著差异[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．异基因细胞疗法规避了自体细胞制剂的这些限制。与其他类型的细胞相比，某些同种异体细胞的免疫抑制特性和低免疫原性导致免疫反应减少或减弱[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

异基因心球来源细胞(cdc;CAP-1002)和骨髓源性间充质干细胞(MSCs)已用于心肌梗死(MI)/缺血性左室功能障碍和心肌病患者的II期临床试验[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．此外，使用自体c-kit阳性心肌细胞(CPCs)治疗可改善心肌梗死(MI)动物模型的心功能和结构，最近已被证明有益于缺血性心力衰竭患者[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．这些异体细胞疗法的一个重要问题是宿主的免疫反应是否会损害它们的安全性和有效性。对于自体或异基因细胞制剂同样重要的是，它们的治疗效果似乎是由移植细胞分泌的旁分泌因子介导的，而不是由移植细胞分化为心肌细胞或另一种心脏谱系的细胞[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．此外，在任何细胞疗法中，移植细胞的组织植入量都非常低，因为它们在注射后几周内就会迅速从心肌清除[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．目前的共识是旁分泌或内分泌机制触发内源性心肌修复/再生过程，该过程不依赖于移植细胞的持续存在[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．然而，宿主对移植细胞或其分泌的旁分泌因子的免疫反应尚不清楚。gydF4y2Ba

先天免疫和炎症免疫反应在缺血诱导的心脏损伤和修复过程中起着关键作用，它通过触发一系列事件来修复受损组织[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．首先，中性粒细胞和单核/巨噬细胞浸润组织以清除坏死碎片。随后是炎症消退、成纤维细胞活化、替代纤维化和瘢痕组织形成[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．心肌梗死期间调节免疫反应被认为可通过加速心肌恢复提供治疗益处[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．越来越多的证据表明，间充质干细胞通过抑制细胞毒性T细胞和增加调节性T细胞(treg)的增殖来调节免疫反应[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，MSCs通过将巨噬细胞极化向M2表型诱导血管生成[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．此外，cdc已被证明通过激活程序性死亡配体1 (PD-L1)来促进免疫耐受，PD-L1是一种抑制过度免疫激活的免疫检查点调节剂[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．这些由移植细胞引发的关键免疫途径最近受到了一项研究的质疑，该研究表明移植的cpc不能减少炎症，并且当炎症被移植的死亡cpc刺激时，在小鼠心肌梗死模型中观察到类似的功能恢复[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．因此，有必要进一步研究免疫细胞对移植细胞的反应及其机制。gydF4y2Ba

我们之前已经证明，CPCs分泌生长分化因子15 (GDF15) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，一种线粒体应激反应产生的细胞因子，被认为有助于应对组织损伤的适应性稳态变化[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．GDF15还具有外周抗炎/免疫调节和心脏保护作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．我们假设移植的异基因cpc具有免疫调节作用，并发挥与自体cpc观察到的相似的心脏保护作用。因此，我们在没有免疫抑制治疗的情况下，研究了免疫分化物种对同基因、异基因和异种CPCs的免疫反应。此外，我们还研究了CPCs促进受伤心脏恢复的基本机制。我们发现，移植到缺血后心脏的CPCs将GDF15分泌到心肌，通过先前识别的GDF15受体CD48促进T-reg和巨噬细胞极化[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]在T细胞上。GDF15分泌使心肌局部T-regs中的NF-κB失活，促进向心脏保护抗炎M2表型极化。gydF4y2Ba

大鼠c-kit阳性心肌细胞gydF4y2Ba

如前所述，从雄性Wistar-Kyoto (WKY)大鼠(6-8周龄)中分离出大鼠c-kit阳性心脏细胞(rcpc) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．简单地说，将大鼠心脏分离出来，用磷酸缓冲盐水(PBS)经主动脉根部灌注，然后用胶原酶(128单位/ml)和透明质酸酶(300单位/ml)溶液灌注10分钟。将灌注后的心脏切成约1 - 2毫米的薄片，300倍离心分离心肌细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba．收集上清液中的小细胞部分，并将其膨胀至70%合流。细胞分离，c-kitgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba按照制造商说明书，使用Miltenyi Biotech大鼠抗小鼠IgG微珠(#130-048-402)，在抗cd117抗体(SC-5535)孵育后分离rCPCs。gydF4y2Ba

单向混合淋巴细胞反应gydF4y2Ba

通过与大鼠脾细胞共培养，评价rCPCs的免疫原性。脾细胞取自WKY大鼠和Brown Norway (BN)大鼠脾脏。简单地说，无菌取出脾脏，放入含有5ml培养基的组织培养皿中，用手术刀切碎。机械分离分离脾细胞，细胞悬液经100 μm细胞过滤器过滤。将细胞悬液与红细胞裂解液在室温下孵育3min，使红细胞裂解。为了评估对异基因和同基因rcpc的免疫反应，有丝分裂灭活的WKY大鼠CPCs与cfse标记的WKY或BN淋巴细胞按1:5的比例培养。hCPCs与BN大鼠淋巴细胞共培养，观察异种反应。共培养5天后，分离T细胞，并在CD3门控后通过测量CFSE强度来评估增殖gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。将个体异源性和异种性淋巴细胞增殖的倍数变化与同基因淋巴细胞增殖的平均值进行比较，计算人、大鼠淋巴细胞增殖的刺激指标。gydF4y2Ba

心肌梗死与细胞移植gydF4y2Ba

为了评估异基因cpc的体内免疫原性和心脏修复潜力，如前所述，将cpc移植到心脏缺血区域[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．简单地说，免疫分化大鼠(6-8周龄)在异氟醚(2%)麻醉下行左开胸手术，用6-0缝线永久结扎左前降支冠状动脉诱导心肌梗死(MI)。通过目视检查确认缺血后，将100万个大鼠或人CPCs(500万个细胞/kg，相当于100万个细胞，平均200克大鼠)悬浮在基础培养基(IMDM)中，4次等量注射于梗死周围区域。单独注射IMDM作为载体控制。为了确定rCPC的植入程度，在一些实验中使用了过表达GFP的rCPC。共采用6个实验组来实现所需的组合:为了进行异体基因评估，BN雌性大鼠接受:(I) IMDM，或(II) WKY rcpc;对于同基因评价，接受WKY雌性大鼠，(III) IMDM，或(IV) WKY rcpc;对于异种评价，BN雌性大鼠接受(V) IMDM，或(VI) hcpc。gydF4y2Ba

无细胞培养基的制备及定量gydF4y2Ba

在反应结束时，收集上清液并通过1000离心预先清除细胞碎片和颗粒物质gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟，然后2万gydF4y2BaggydF4y2Ba蛋白质含量采用双辛酸测定法(BCA)定量(Thermofisher, Waltham, MA)。为使蛋白质含量归一化，我们采用(浓度因子)×(培养基总体积)/(上清培养基总蛋白质含量)公式。ELISA在马里兰大学医学院的核心设施中使用ELISA试剂盒(Millipore和R&D systems Inc.)进行。根据制造商的协议。gydF4y2Ba

超声心动图gydF4y2Ba

在异氟醚(2%)麻醉下，使用VisualSonics Vevo 2100超声设备(VisualSonics, Toronto, Canada)进行二维和m型超声心动图。第1天获得基线超声心动图，由盲心科医生测量左室(LV)射血分数(EF)和分数缩短(FS)，以确认预期的心功能降低。为了保持心肌梗死后功能障碍严重程度的一致性，在术后第1天EF为45±2%的动物被纳入研究。在基线和心肌梗死后24 h进行超声心动图，验证各组心肌梗死后功能障碍的相似性。结扎左前降支(LAD)后，在缺血区左室心肌注射100万个细胞。使用高分辨率M型超声心动图在胸骨旁短轴视图中获得左心室乳头肌水平的M型图像。根据普遍接受的公式计算5个心动周期的数据[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在第7天和28天重复超声心动图评估心功能的进行性改善。gydF4y2Ba

体液免疫反应gydF4y2Ba

通过流式细胞术检测经rcpc处理的大鼠血清对异源性和异源性抗供体抗体的反应性，评估对异源性、同源性和异源性CPCs的体液免疫反应。用50 μl受体或naïve血清在4℃下孵育大鼠和人CPCs 30 min。洗净后，细胞进一步与大鼠抗igm和抗igg孵育30分钟，然后用流式细胞仪定量分析。gydF4y2Ba

流式细胞术分析gydF4y2Ba

心肌梗死后第5天采集处理过的动物的心脏组织，切碎，然后用胶原酶D (Roche)在37°C的摇摆平台上消化50分钟(180-200 rpm)。酶解后，细胞悬液通过70µm细胞过滤器(Fisher Scientific #22363548)过滤，并在500×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba为了溶解红细胞，细胞颗粒在室温下在氯化铵-钾溶解缓冲液(Gibco # A10492-01)中孵育3-5分钟，然后用冰冻的荧光激活细胞分选器洗涤缓冲液(2.5%胎牛血清在PBS中不含钙和镁)清洗。细胞重悬在洗涤缓冲液中，样品用Fc-Block(抗大鼠CD16/CD32，每100万个细胞0.5 μg)孵育，然后根据制造商的说明用同型对照或一抗孵育。然后用洗涤缓冲液清洗细胞。大约2 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba事件(细胞)通过流式细胞仪(BD-LSRFortessa)进行分析，并通过FlowJo软件进行分析。表中描述了抗体gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(数据补充)。T细胞和treg细胞首先作为淋巴细胞被门控(FSC-A vs SSC-A)。对于总T细胞，对CD3细胞进行门控，并进一步分析CD4和CD8。对于treg, CD4细胞被门控，从这个门控开始，CD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和Fox-P3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba双阳性细胞测定。对于巨噬细胞，CD45细胞被门控。从cd45阳性细胞中，对CD68(总巨噬细胞)进行门控，并进一步分析M2巨噬细胞的CD163 [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．为了观察T细胞上CD48受体对GDF15分泌的rcpc的摄取情况，将异基因rcpc与有或没有gdf15kd的脾细胞共培养5天。第5天取脾细胞，流式检测CD4、CD48、GDF15。gydF4y2Ba

组织学gydF4y2Ba

组织处理如前所述[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］gydF4y2Ba^．gydF4y2Ba简单地说，采集超声心动图数据后，在麻醉下切除大鼠心脏，并灌注10%福尔马林溶液(Sigma Aldrich #HT501128)。使用30%蔗糖(1× PBS制备)冷冻保存组织，并嵌入最佳切割温度的化合物(Fisher Scientific, TissueTek #NC1029572)。使用商用低温恒温器切割7 μm切片，根据制造商的说明对不同的抗体进行染色。组织切片用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色(Sigma #F6057)以及Foxp3和pP65等所需染色剂进行反染色。所有图像均由EVOS显微镜获得，并使用Image J软件进行量化。gydF4y2Ba

慢病毒的产生和转导gydF4y2Ba

通过慢病毒转导对基因表达进行调控。所有慢病毒都是在HEK293T中产生的。HEK293T细胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)在添加10%胎牛血清(赛默飞世尔科学#A38402-02)的DMEM培养基(CellGro)中培养。来自Origin的慢病毒表达系统(目录#TL710232)有4个独特的shRNA 29-mers用于敲除GDF15。每种慢病毒制剂的滴度是根据产生50% GFP所需的病毒量来计算的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转导100,000个rcpc后的细胞。我们根据公司(Origene, Inc)的制造协议计算了MOI。简单来说，我们用以下公式计算MOI:gydF4y2Ba

我们期望的MOI是2。细胞在12孔培养皿中转导，培养皿中慢病毒含量增加，培养皿中添加8 μg/ml聚苯乙烯(Sigma Aldrich #TR-1003)。转导3天后，采用LSR Fortessa流式细胞仪检测各孔中GFP+细胞的百分比。western blot检测gdf15kd。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用Mann-Whitney校正的非参数非配对检验对两组进行比较。对于两组以上的比较，采用Tukey事后检验进行单因素方差分析。分组超声心动图数据采用Bonferroni校正的2-Way ANOVA分析。连续数据绘制为盒须图。中间的水平线代表中间值。上下胡须表示非异常值的最大值和最小值。受试者数量在每个方框和晶须栏下以数字表示。额外的点表示异常值。数据分析采用GraphPad Prism 9软件。P值在0.01 ~ 0.05、0.01 ~ 0.001、0.001 ~ 0.0001或< 0.0001分别表示显著*、极显著**、极显著***/****。gydF4y2Ba

rCPCs的表型特征和免疫调节作用gydF4y2Ba

与我们发表的人类CPCs的结果一致，流式细胞术也表明，rCPCs和rMSCs都表达高水平的间充质标志物(CD105)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, CD90gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，但内皮细胞标志物(CD45 .gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba、CD31gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．关于免疫抗原，两种细胞类型均表达主要组织相容性复合体I类(MHC I)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和共刺激免疫标记物(CD80gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，而不是MHC II或CD86(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA).此外，rcpc表达高水平的c-kitgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与rMSCs相比。这些结果表明，CPCs显示低免疫原性基线轮廓，表明它们有可能在体内逃避免疫识别。为了证实异基因rcpc良好的基线免疫原谱的生物学相关性，我们与大鼠CD4进行了单向混合淋巴细胞反应gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞分离自两株不同品系的雄性大鼠WKY和BN。老鼠CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与WKY大鼠rcpc共培养。WKY CD4的组合gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与WKY rCPCs是同基因的，而BN与CD4的结合gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和WKY rcpc是异基因的。我们还评估了异种组合:CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞来自BN雌性大鼠与人类成年CPCs。同基因或异基因的rCPCs引起的T细胞增殖微不足道(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).尽管同基因的CPCs没有引起T细胞的增殖，异基因的CPCs显示低(统计上不显著)T细胞增殖。与这种低T细胞增殖反应相一致的是，细胞因子如转化生长因子β (TGF-β)的水平在同基因的无细胞培养基中显著增加(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)和白细胞介素2 (IL-2) [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]， TGF-β在异体细胞中的表达(图;gydF4y2Ba1gydF4y2BaD，组合;gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]经多重ELISA鉴定。相反，在异种共培养条件下，t细胞显著增殖，TGF-β、IL-2和IL-10水平下降(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaE.表达CD4+ T细胞(Treg细胞)的叉头盒蛋白3 (Forkhead box protein 3, FOXP3)在心肌梗死后的损伤心肌中积累，在恢复心脏功能中起重要作用[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．为了进一步探索rCPCs的免疫调节特性，我们将rCPCs与CD4进行了体外共培养研究gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞分离自WKY(同基因)和BN(异基因)大鼠。共培养5天后，同基因(图;gydF4y2Ba1gydF4y2BaF, G)和异基因(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH, I)组合显著提高了CD25的比例gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和具体gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTreg细胞与对照组相比。因此，Syngenic或Allogenic CPCs不诱导免疫原性反应，但通过增加CD4+细胞亚群(T-regs)具有免疫调节特性。这些结果表明，与它们的低免疫原性基线特征一致，rcpc不是免疫原性的，在体外发挥免疫调节作用gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

rCPCs对大鼠急性心肌梗死模型的免疫调节作用gydF4y2Ba

为了确定rCPCs在体内的免疫调节作用，在心肌梗死后BN大鼠心肌内注射了100万个异基因rCPCs, 5天后，通过流式细胞术分析确定来自心脏的单细胞悬液中T-regs的存在。同种异体rcpc移植后CD4细胞显著升高gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ FoxP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba亚(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA, B)损伤心肌。由于T-regs刺激单核/巨噬细胞的M2极化[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，我们还评估了M2巨噬细胞(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC, D，在相同的生物复制。辅助t细胞(CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和杀伤t细胞(CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)细胞(图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaE-H)或b细胞(CD45R)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和总t细胞(CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(图)细胞。gydF4y2Ba2gydF4y2BaI-L)保持不变。总的来说，这些数据表明，rCPCs的基线免疫调节特征与体外和体内的免疫调节生物学效应相关。gydF4y2Ba

同种异体rCPC移植可改善心肌梗死后的心功能gydF4y2Ba

为了确定CPCs对心肌梗死后LV功能障碍的影响，在心肌梗死后移植异基因、同基因或异种的CPCs，并在28天后评估LV功能。与对照组(IMDM)相比，100万异基因或同基因rCPCs移植4周后显著改善左室功能，通过增加LVEF来衡量(IMDM vs异基因:42±2 vs 49±1%，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05, n = 9-12;IMDM vs同基因:41±2 vs 55±3%gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05, n = 4-6)(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)和LV FS (IMDM vs异体:21±1 vs 26±1%，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05, n = 9 - 12和IMDM vs同源的:21±1 vs 30±2%,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05, n = 4-6)(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB).异种cpc未观察到LV的显著功能改善(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA, B)。与异种治疗组相比，同基因和异基因rcpc与IMDM相比，左室收缩末期容积显著降低，并与同基因和异基因rcpc后心排血量显著增加相关(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC, D)。gydF4y2Ba

4周后心肌梗死的纤维化程度通过测量不同组心脏切片Masson三色染色后的纤维化面积(蓝色)相对于总心肌面积(粉色和蓝色)来确定。与异种组相比，同基因或异基因CPCs组的心脏组织纤维化面积明显小于安慰剂组(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE, F)。这些结果表明，与它们的表型和体外和体内免疫调节作用一致，同基因和异基因的cpc，但不异种的cpc，减少了大鼠心肌梗死后的瘢痕大小。gydF4y2Ba

我们评估移植后第28天新生血管、小动脉形成和心肌细胞增殖。移植的异基因和同基因rcpc显著增加了新血管和小动脉密度;分离蛋白B4 (IB4)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的联合染色证实了这一点，而异种rcpc与安慰剂相比，没有显示出任何新血管和小动脉密度的增加(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba胃肠道)。同样，移植的异基因和同基因rcpc，而非异种rcpc，显著增加了梗死区边界区的心肌细胞增殖，这可以通过有丝分裂标记物磷酸组蛋白H3 (pHH3)和α -肌动蛋白的共染色来确定(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaJ, K)。通过苏木精和伊红染色切片的炎症细胞评估瘢痕、边缘区和远端心肌免疫排斥反应的时空发展。异基因和同基因治疗组表现出非常轻微的细胞介导排斥反应，与异种治疗组相比，异种治疗组的特征是梗死区和梗死周围显著的单核浸润，包括间质和血管周围分布(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaL, M)。这个解释是由一个盲的心脏病理学家进行的。应用的免疫评分系统是一种改进的描述性评分系统，该评分系统是基于国际心肺移植学会针对心脏移植排斥反应制定的评分系统[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．为了评估体液反应，移植后第28天收集受体大鼠血清，用收集的血清培养rcpc，检测循环抗供体抗体。异基因组和同基因组与对照组相比没有显著差异，而异种组的IgG和IgM抗体滴度在第28天显著增加(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaN)。gydF4y2Ba

GDF15在rCPCs对左室功能恢复影响中的作用gydF4y2Ba

此前对人类CPCs进行液相色谱-质谱联用(LC-MS /MS)的研究发现，GDF15是其分泌组中的高表达蛋白之一，在调节靶细胞的细胞生存途径中发挥着重要作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．rcpc的分泌组的免疫印迹分析证实，这些细胞产生大量的GDF15(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA, B).为了探索GDF15在心肌功能恢复中的直接作用，我们下调了rcpc (rcpc)中GDF15的表达gydF4y2Ba^{GDF15KD)gydF4y2Ba}并将这些细胞移植到大鼠心肌梗死模型中。我们的结果显示，接受rcpc的大鼠LVEF和LVFS显著降低gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}与对照rcpc相比(图;gydF4y2Ba4gydF4y2BaC, D，用rcpc治疗的心脏gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}与rcpc治疗组相比，rcpc治疗组的疤痕明显更大，与安慰剂治疗组相比，rcpc治疗组的疤痕尺寸显著减小(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaE, F)。此外，循环抗炎细胞因子IL-2, IL-10水平在rCPC中显著降低gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}rCPC中炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-a)除外gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}与rCPC组比较(图;gydF4y2Ba4gydF4y2BaG)。与TGF-B无显著差异。为了描述GDF15的作用机制，我们注入了100万个rcpc或rcpcgydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}为了评估T-regs和M2巨噬细胞，在心肌梗死后5天，从新鲜获得的整个心脏的富含白细胞的部分中提取单细胞悬液，并进行流式细胞术。数据显示CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-regs和CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD68gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2BarCPCs中M2巨噬细胞明显减少gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}移植组与rcpc的比较(图;gydF4y2Ba4gydF4y2BaH-K)。与rcpc相比，移植rcpc观察到GDF15分泌增加gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)，第5天免疫组化证实。这些数据表明，rcpc表达GDF15在其体内免疫调节和心脏保护作用中起着关键作用。用流式细胞术观察处理后心脏单细胞混合物中Treg细胞NF-κB的活化情况(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaL)和量化(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaM) Treg细胞NF-κB活化(CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ pP65gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)．FOXP3共染免疫组化进一步证实了上述结果gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和pP65对treg细胞NF-κB活化的影响(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba与安慰剂或rCPC相比，rCPC组NF-κB活性降低gydF4y2Ba^{GDF15KDgydF4y2Ba}T-reg细胞的治疗心肌细胞中没有pP65的表达。gydF4y2Ba4gydF4y2BaP)。这些数据表明rCPC分泌组中含有GDF15，它可以调节FOXP3阳性T-reg细胞中NF-kB的活性，调节心肌中M2的水平，从而改善心肌梗死模型大鼠的心肌恢复。为了探索参与GDF15介导的NF-kB抑制的受体活性和下游信号通路，我们对有或没有GDF15的脾细胞和rcpc进行了体外共培养实验。由于胶质细胞源性神经营养因子家族受体α样(GFRAL)的表达高度局限于后脑的神经元细胞，而在所有外周组织中几乎不存在[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．最近，CD48是第一个在免疫系统中发现的GDF15受体，并且只在免疫细胞上表达[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在共培养实验中，我们研究了CD48受体通过流动在t细胞上摄取GDF15衍生的rCPCs。数据显示，所有CD4细胞都有CD48受体，与对照组和rCPC-GDF15KD细胞相比，rcpc组t细胞对GDF15的摄取显著增加gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。这一数据表明，rCPC分泌组含有GDF15，它通过t细胞上的CD48受体调节FOXP3阳性T-reg细胞中的NF-kB活性。gydF4y2Ba

T-regs和巨噬细胞在心肌梗死后心肌功能恢复中的相互作用gydF4y2Ba

为了探讨Tregs在心肌梗死后左室功能恢复中的可能作用，我们使用了T细胞缺陷的裸鼠。我们注射了100万个细胞[rcpc, TreggydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞(CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD25gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba), TreggydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，以及带有treg的rcpcgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLAD结扎后心肌内的细胞]。4周后的超声心动图显示左室射血分数显著增加(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA)和分数缩短(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)与单独使用rcpc或安慰剂治疗的大鼠相比，接受联合细胞(rcpc + Tregs)治疗的大鼠。我们的数据显示，单独使用rcpc无法恢复心肌，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA和B，但当我们同时注射rcpc和Treg时，与安慰剂、rcpc和Treg相比，这显著改善了射血分数和分数缩短gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞和TreggydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。这一数据表明rcpc衍生了GDF15和TreggydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞协同工作。我们还通过流式细胞术分析了经rcpc或联合细胞疗法(rcpc + Treg)处理的全心单细胞悬液中的M2巨噬细胞。为了评估M2巨噬细胞，我们使用磁性微珠分离CD11b/c细胞，CD11b/c细胞被CD163联合染色(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一部)。CD11b / cgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与单独的rCPCs治疗相比，联合细胞治疗显著升高(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaF).这些结果表明Tregs增强M2巨噬细胞极化，对缺血心脏提供心脏保护作用[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．ARG1的基因表达进一步支持了这一概念(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG)，这是M2巨噬细胞的标志，以及抗炎细胞因子IL10的基因表达(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaH)在接受联合细胞治疗(rcpc + Treg)的心脏中。由于先前的研究表明，在左室压力过载期间，GDF15水平升高可通过抗肥厚反应功能保护心肌，因此在RV心肌中测定了GDF15及其已知下游效应物SMAD 2/3的蛋白水平[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．在心肌梗死后第5天，我们从对照组、rCPCs组和rCPCs + Treg组的裸大鼠中分离出GDF15蛋白，并通过western blot检测GDF15的表达。数据显示，相对于安慰剂和rCPCs, rCPCs + Treg治疗组GDF15蛋白表达增加(FgydF4y2Ba我gydF4y2Bag。gydF4y2Ba5gydF4y2BaI和J)。该数据表明，T细胞缺陷大鼠中单独的rcpc不分泌GDF15，但与Treg细胞结合时，异基因rcpc分泌的GDF15显著升高，这与我们的体内数据相关。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA和B。gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现异基因的CPCs具有低免疫原性和免疫调节性。我们的体外实验结果表明，rcpc具有与rmsc类似的异基因抗原表型，并且它们不诱导T细胞增殖。这得到了体内研究的进一步支持，与异种hcpc相比，异基因rcpc不会诱导T细胞增殖、局部炎症或细胞或体液免疫反应。此外，rCPCs似乎具有免疫调节作用，通过减少T细胞增殖，增加treg和促进M2巨噬细胞极化。最后，异基因rcpc诱导心肌梗死大鼠心功能的显著恢复和瘢痕尺寸的减小。总的来说，这些结果为心肌梗死后异基因CPC治疗的免疫耐受性、安全性和有效性提供了第一个证据。gydF4y2Ba

我们发现间充质(CD90和CD105)、MHC (I和II)和共刺激分子(CD80和CD86)在rCPCs和rmsc中的表达相似。MHC II类表达的缺乏阻止了细胞毒性自然杀伤细胞的识别，而低水平的共刺激分子表达支持从异源反应性CD4逃逸gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT淋巴细胞。gydF4y2Ba

T-reg是CD4+ t细胞的一个子集，是心脏修复所必需的，据报道，T-reg敲除的小鼠在遭受多种疾病的同时无法存活超过4周[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．T-regs的免疫调节和抗炎特性对心脏修复至关重要[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．T-regs通过其旁分泌也促进新生儿心肌细胞增殖[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．体外共培养异体或同基因组合的rCPCs均未诱导明显的CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与对照组相比，T细胞增殖显著增加Tregs (FOX-P3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)．这些体外结果通过流式细胞仪在体内进一步证实。异基因rCPCs显著增加treg和M2细胞的数量，但没有增加CD8细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba大鼠心肌细胞。这些观察结果为CPCs的低免疫原表型提供了结构基础;混合淋巴细胞反应试验证实了功能后果。gydF4y2Ba

异基因cdc和间充质干细胞已被证明在改善心功能恢复方面有效[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．事实上，最近的一项临床研究(POSEIDON-DCM)表明，在扩张型心肌病患者中，异基因间充质干细胞甚至比自体间充质干细胞更有效[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．我们在大鼠心肌梗死模型中评估异基因、同基因和异种CPC移植后的心功能恢复和瘢痕大小。异基因rcpc改善了心功能，通过左室射血分数和分数缩短来衡量。与移植后第1天相比，同种异体和同基因rcpc均能改善移植后第28天的心功能。然而，异种hcpc未能改善心功能。组织学分析表明，同种异体和同基因细胞的有益作用与左室壁厚度的保存和瘢痕大小的减小有关。相反，异种细胞不会产生这种效应。gydF4y2Ba

内源性CPCs最初被认为在心脏发育过程中分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，甚至在成人心脏[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．然而，在包括我们在内的许多研究中，还没有观察到外源性CPCs或hCPCs向心肌细胞的显著分化。［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在本研究中，只有不到3%的外源性CPCs分化为内皮细胞、平滑肌细胞或心肌细胞(数据未显示)。对于cdc和MSCs也有类似的发现[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．因此，通过分化CPCs替代受损细胞并不能解释所观察到的有益作用。cpc衍生的分泌产物(旁分泌因子)可能是心脏功能改善的原因[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．与这一观点一致，我们最近报道了CPC分泌产物促进血管生成和内源性心肌细胞增殖[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．我们在使用异基因rcpc的本研究中观察到类似的效果，尽管没有明确的证据表明心肌细胞增殖。gydF4y2Ba

免疫细胞在缺血诱导的心脏不良重塑中起关键作用。这一过程可分为3个不同的阶段:(1)炎症阶段，心肌细胞坏死触发先天免疫反应，促进中性粒细胞和单核细胞浸润梗死区域;(2)增殖阶段，以M2巨噬细胞的出现为特征，通过诱导血管生成等过程参与初步组织稳定;(3)最后阶段，特征为梗死区纤维化，心肌细胞凋亡，炎症反应减弱[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．组织重塑过程中免疫反应的调节被认为是心肌梗死中增强组织愈合和修复的治疗靶点。gydF4y2Ba

这项研究使用功能读数进行，包括体外免疫细胞和完全免疫的大鼠进行体内研究。我们观察到，即使在完全具有免疫功能的条件下，rCPCs在混合淋巴细胞反应试验中也没有诱导明显的免疫反应，并且在体内细胞移植后28天诱导免疫细胞很少或没有组织浸润。我们的研究结果表明，rCPCs通过抑制T细胞增殖、促进Treg增殖和促进单核细胞向M2巨噬细胞分化来发挥免疫调节作用，这些都与免疫耐受有关。这些免疫调节作用是相似的异体和同基因细胞。我们的发现与最近的报道一致，这些报道表明treg在梗死心肌的心脏修复中具有有益的作用[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．treg抑制CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞增殖和抑制干扰素分泌[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．此外，Tregs在巨噬细胞向M2表型的极化中发挥重要作用[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，进而在梗死后组织修复中发挥重要作用[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．我们的观察结果支持这样的观点:rcpc通过调节T-reg细胞和促进M2巨噬细胞依赖过程，减弱缺血诱导的不良心脏重塑，保留心脏功能。然而，还需要进一步的研究来确定是否有其他机制使CPCs对受损心肌发挥有益作用。总的来说，我们的研究结果清楚地表明，CPCs具有低免疫原性和免疫调节性。gydF4y2Ba

在我们的研究中，最重要的问题是CPCs如何诱导心脏保护、低免疫原性和免疫调节反应。我们之前的研究表明分泌旁分泌因子影响心脏修复/重塑[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．GDF15又称巨噬细胞抑制细胞因子1，在CPCs及其分泌组中大量存在[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．此前已有研究表明，GDF15通过增加Treg中IL-10的激活来增强Treg介导的t细胞激活抑制[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．本研究中，注射TreggydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)细胞在裸鼠心肌(T细胞缺陷)中不能促进功能恢复，而联合注射rCPCs + TreggydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞促进了显著的恢复，这与损伤心肌中保护心脏的M2细胞的增加有关。rCPCs-GDF-15KD的体内实验显示，免疫能力强的大鼠心脏各项参数均显著降低，且rCPCs-GDF-15KD无法激活Treg和M2细胞。此外，我们的数据表明，CPCs分泌的GDF15可以抑制缺血心肌Treg细胞的NF-κB信号通路，从而减少M2细胞的凋亡，增加M2细胞的极化。综上所述，这些观察结果支持了这样一个概念，即移植的异基因CPCs中的NF-κB/GDF15调节轴通过减弱不良心脏重塑和极化心脏保护M2细胞来改善心肌梗死后的心功能。心脏功能的改善也与血管生成和心肌细胞增殖增加的组织学证据相关。由于先前的研究已经证明了自体cpc在慢性心力衰竭患者中的安全性[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，我们的研究结果支持进一步建立临床级、现成、“现成”的异基因cpc库，以及评估这种基于细胞的方法对心肌梗死后心脏重塑过程有利的安全性和有效性的临床试验[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

异基因CPCs通过特异性增加t调节细胞和M2极化来诱导最小的炎症反应和刺激免疫调节反应，同时保持其心脏恢复潜力和安全性。我们的观察结果强烈支持异体CPC疗法在更广泛的患者应用中的发展。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

确定特别关注国:gydF4y2Ba

心脏祖细胞gydF4y2Ba

hCPCs):gydF4y2Ba

人类心脏祖细胞gydF4y2Ba

rCPCs:gydF4y2Ba

大鼠心脏祖细胞gydF4y2Ba

hMSCs:gydF4y2Ba

人类间充质干细胞gydF4y2Ba

rMSCs:gydF4y2Ba

大鼠间充质干细胞gydF4y2Ba

小姐:gydF4y2Ba

心肌梗死gydF4y2Ba

PBMCs:gydF4y2Ba

外周血单个核细胞gydF4y2Ba

CFSE:gydF4y2Ba

5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚酯gydF4y2Ba

IMDM:gydF4y2Ba

Iscove改良了Dulbecco的介质gydF4y2Ba

矿渣MTC:gydF4y2Ba

马森三色的gydF4y2Ba

t - reg:gydF4y2Ba

t调节细胞gydF4y2Ba

GDF15:gydF4y2Ba

生长差异因子15gydF4y2Ba

作者要感谢美国国立卫生研究院、马里兰Stem研究基金和美国心脏协会提供的资金。gydF4y2Ba

这项工作得到了美国国家卫生研究所对S.K. (HL141922, HL139060, HL145644, HL118491-06A1)的资助。M.G. (2018-MSCRFF-4326和2020-MSCRFD-5338)和R.M. (2018-MSCRFD-4329)得到了马里兰州干细胞研究基金会的支持。S.S. (18CDA34110282)获美国心脏协会职业发展奖资助。S.K.是Neoprogen的创始人。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Rachana Mishra和Progyaparamita Saha对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 美国伊利诺斯州芝加哥西北大学范伯格医学院心血管胸外科gydF4y2Ba

   Rachana Mishra, Progyaparamita Saha, Pranav Mellacheruvu, Muthukumar Gunasekaran, Sameer Ahmad Guru，徐斌，陈玲，Sudhish Sharma和Sunjay KaushalgydF4y2Ba

2. 美国伊利诺斯州芝加哥市安和罗伯特H. Lurie儿童医院儿科gydF4y2Ba

   Rachana Mishra, Progyaparamita Saha, Muthukumar Gunasekaran, Sameer Ahmad Guru，徐斌，陈玲，Sudhish Sharma和Sunjay KaushalgydF4y2Ba

3. 美国马里兰州巴尔的摩大学医学院外科gydF4y2Ba

   Srinivasa Raju DatlagydF4y2Ba

4. 美国路易斯维尔大学心血管医学部和分子心脏病学研究所gydF4y2Ba

   罗伯特·波利gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SK, SS, RM和PS构思了这项研究。RM, PS, SRD和LC进行了实验，并生成了手稿中所示的所有数据。RB、SS和SK对项目进行了理论评估，并对实验设计提出了建议。SK, RM, PS, PM, MG, XF, SAG, RB, SS，对数据进行解读，撰写和审稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaSudhish沙玛gydF4y2Ba或gydF4y2BaSunjay KaushalgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

所有程序均遵守《动物福利法》、《实验动物护理和使用指南》以及其他与动物使用有关的联邦法律法规的规定。该动物设施得到了国际实验动物护理评估和认可协会(AAALAC)的全面认可。机构动物护理和使用委员会(IACUC)已经批准了所有的动物协议。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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