特发性膜性肾病患者细胞外囊泡中循环的miRNAs与治疗反应相关gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

细胞外囊泡(EV)-microRNAs (miRNAs)是多种肾脏疾病的潜在生物标志物。本研究试图鉴定循环EV-miRNA签名，不仅用于鉴别特发性膜性肾病(IMN)与特发性肾病综合征(INS)，而且还用于预测IMN患者的治疗反应。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

我们前瞻性地招募了60名参与者，包括IMN (n = 19)和INS (n = 21)和健康志愿者(HVs;N = 20)。通过RNA测序，我们评估了所有参与者的血清EV-miRNA谱。为了确定IMN中预测治疗反应的EV-miRNAs，我们还分析了有和没有临床缓解的IMN患者中的EV-miRNAs。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

IMN患者、INS患者和HVs患者3种miRNAs的表达水平存在差异。此外，与HVs相比，RNA测序显示，在无缓解和缓解的IMN患者中，分别有77和44个ev - mirna表达差异。我们还发现，在无缓解的IMN中，23种miRNAs的表达水平存在统计学意义上的差异(|fold change≥2,p < 0.05)。对未缓解的IMN中miRNAs的生物学途径分析表明，它们可能参与多种途径，包括肾纤维化。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究确定了EV-miRNAs与IMN以及与治疗反应相关。因此，这些循环的EV-miRNAs可能被用作诊断和预测IMN患者治疗反应的潜在标志物。gydF4y2Ba

肾病综合征与重度蛋白尿和外周水肿有关[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．特发性膜性肾病(Idiopathic membrane nephropathy, IMN)是原发性肾病综合征最常见的病因之一，近年来发病率不断上升[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．大多数IMN或特发性肾病综合征(INS)患者表现为明显的蛋白尿和外周水肿[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．许多观察结果支持，某些形式的肾病综合征，包括IMN，可能是由某种循环因子引起的[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．虽然肾活检是鉴别肾小球肾炎和肾病综合征的金标准，但它是一种侵入性手术，有时对服用抗血小板药物或抗凝药物的患者是危险的。因此，在肾活检有相对禁忌症的情况下，以前的一项研究建议采用基于血清学的方法来诊断IMN [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．研究表明，血清抗磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体可以作为诊断、测量疾病活动性和预测IMN治疗反应的潜在生物标志物[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．较低的抗pla2r滴度与IMN的高自发缓解率相关，因此有利于保守治疗，而治疗后抗pla2r滴度水平的下降预测了利妥昔单抗治疗的临床反应[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，anti-PLA2R滴度检测IMN的敏感性较低(在52 - 78%之间)[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]， 20-30%的患者血清抗pla2r抗体检测呈阴性[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

细胞外囊泡(Extracellular vesles, EVs)含有多种来源于细胞的分子，包括蛋白质、脂质、DNA、mRNA、microRNA (miRNA)等，其中miRNA因能稳定存在于各种体液中并对基因表达起调控作用而备受关注[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．ev - mirna似乎比游离mirna更稳定，因为ev似乎可以保护和增加mirna的稳定性[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．最近，有报道称EV-miRNAs在检测急性肾损伤(AKI)方面比游离miRNAs更有用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．除AKI外，一些研究表明ev - mirna在肾小球肾炎(如狼疮性肾炎)中作为生物标志物的潜力[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．以往肾脏疾病的EV研究通常集中在泌尿系统EV [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，而最近的一些报道表明，循环ev - mirna在肾病综合征中具有独特的特征[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．这些结果表明，循环mirna可以作为肾病综合征的生物标志物gydF4y2Ba．gydF4y2Ba我们还发现糖尿病肾病患者和非糖尿病肾病患者的EV-miRNA谱不同[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．然而，有限的数据显示mirna作为IMN的诊断、预后和治疗生物标志物的潜在作用。gydF4y2Ba

在本研究中，为了识别肾活检时的IMN特异性mirna，我们使用RNA测序比较了IMN患者和其他队列(包括健康志愿者(HVs)和INS患者)的EV-miRNA谱。此外，我们试图通过比较治疗期间有和没有临床缓解的患者的EV-miRNA谱来确定IMN患者中预测治疗反应的循环EV-miRNA。gydF4y2Ba

参与者和数据收集gydF4y2Ba

我们纳入了40例年龄和性别匹配的IMN和INS患者和20例来自前瞻性肾小球疾病队列的HVs患者。在本研究中，INS包括局灶性节段性肾小球硬化和微小改变疾病，这些疾病是由肾病综合征的临床特征与电子显微镜下弥漫性足结节肾活检结果的相关性来定义的[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．2015年1月至2020年6月期间诊断为肾小球肾炎的患者从顺天乡大学医院和长老会医疗中心招募。有继发原因的MN患者，如狼疮或恶性肿瘤被排除在外。本研究由顺天乡大学机构审查委员会(IRB No. 2016-01-002-007)批准。获得所有参与者的书面知情同意。gydF4y2Ba

根据2012年肾脏疾病:改善全球结果指南定义缓解。在IMN患者中，完全缓解被定义为蛋白尿减少到0.3 g/天。部分缓解定义为蛋白尿减少至0.3 - 3.5 g/天(与基线相比至少减少50%)。复合缓解包括肾活检后1年内完全缓解或病理诊断后2年内蛋白尿少于2.5 g的部分缓解。难治性反应定义为随访期间无综合缓解。因此，共有19例IMN患者被分为两组:反应良好(IMN- w)和难治(IMN- r)组，基于复合缓解的成就。采用ELISA法(EUROIMMUN AG, Lubeck, Germany)检测抗pla2r抗体。gydF4y2Ba

在随访期间，纳入患者的治疗决定由治疗肾病学家做出。启动免疫抑制治疗的最常见原因是患者特征(蛋白尿、肾功能等)未得到适当控制，以及肾病医生的临床判断。gydF4y2Ba

血清EV RNA的分离与评价gydF4y2Ba

RNA测序如前所述[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．简单地说，根据制造商的指南，使用ExoQuick隔离剂(System Bioscience, Palo Alto, CA, USA)从血清(1000 μL)中分离出循环ev。离心(3000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba15 min)的血清样本与ExoQuick试剂混合，在4℃下孵育30 min。再以1500 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba吸气上清30 min，保留颗粒。颗粒在无菌磷酸盐缓冲盐水(200 μL)中重悬浮后，使用miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取RNA。所有涉及外泌体悬浮的过程都按照制造商的指导方针进行。提取RNA后，用无rnase水(20 μL)洗脱纯化的RNA。使用Agilent生物分析仪2100和RNA Pico芯片和小RNA芯片分析纯化的RNA，以检查EV RNA的大小分布(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)。gydF4y2Ba

用CD63聚类检测EVs的特征gydF4y2Ba

根据制造商的方案，使用体外酶联免疫吸附试验(ELISA)-ULTRA CD63试剂盒(System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)测量循环ev中的CD63水平。gydF4y2Ba

Western blot分析gydF4y2Ba

每个样品都在SDS-PAGE凝胶上电泳，并转移到硝化纤维膜上。用特异性抗体检测膜，如下所示;抗cd9 (Abcam, Cambridge, MA, USA)和抗gm -130 (Abcam)。膜用辣根过氧化物酶偶联二抗(Sigma)孵育。用TBS-T洗涤后，结合的抗体通过增强化学发光检测(Amersham, Buckinghamshire, UK)。gydF4y2Ba

透射电子显微镜(TEM)gydF4y2Ba

该协议由Thery等人和Rikkert等人描述。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在Para薄膜上放置一液滴外exosome溶液，并在液滴上漂浮formva -carbon- coating nickel grid(200目，TED PELLA, USA)以在室温下吸收样品。10分钟后，外泌体用2.5%戊二醛固定，1%乙酸铀酰染色。样品用蒸馏水清洗，并在黑暗中干燥。使用75 kV (H-7000B;日立，东京，日本)。gydF4y2Ba

外泌体的物理化学性质gydF4y2Ba

使用Nano-ZS Zetasizer (Malvern Inc.， UK)来估计颗粒大小。样品用蒸馏水稀释10倍，用一次性比色皿(DTS1070;Malvern Inc.，伍斯特郡，英国)，并使用Zetasizer软件(7.11版)进行分析。gydF4y2Ba

cDNA文库制备及小RNA测序gydF4y2Ba

处理样品以产生外泌体RNA (10 ng)作为每个文库的输入。根据制造商的指导方针，使用Illumina (Takara Bio，志贺，日本)的SMARTer smRNA-Seq Kit构建小RNA文库。通过聚腺苷酸化、cDNA合成和聚合酶链反应(PCR)扩增构建测序文库。gydF4y2Ba

使用安捷伦生物分析仪对文库进行凝胶纯化，并通过评估其大小、纯度和浓度进行验证。根据qPCR定量方案指南(KAPA文库定量试剂盒for Illumina®测序平台)，使用定量PCR (qPCR)对文库进行定量。我们使用TapeStation D1000 screenentape (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)评估了库的质量。在Illumina HiSeq 2500仪器(Illumina, San Diego, CA, USA)上对等量的文库进行汇总和测序，生成51个碱基reads。使用Illumina管道中的模块执行图像分解和质量值计算。下一代测序(NGS)分析的所有程序都在Macrogen(首尔，韩国)进行。gydF4y2Ba

RNA测序数据和miRNAs比例分析gydF4y2Ba

序列比对后，使用miRDeep2算法鉴定出已知和新的mirna。在序列对齐之前，我们检索了gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba来自UCSC基因组浏览器的参考基因组版本hg19，使用Bowtie(1.1.2)进行索引，这是一个对准实验和参考序列的程序。然后将reads与成熟蛋白和前体蛋白对齐gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba使用miRBase 21获取的mirna。使用miRBase 21和非编码RNA数据库Rfam 9.1将唯一聚类的reads顺序排列到参考基因组，分别识别已知的mirna和其他类型的RNA。gydF4y2Ba

miRNA表达水平分析gydF4y2Ba

使用DESeq2将原始数据(读取每个miRNA)归一化为相对日志表达式。在预处理过程中，超过50%的样本中缺失的mirna被排除，只留下成熟的mirna进行分析。为了方便记录日志，我们将过滤后的mirna的归一化读计数增加了1gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba变换并绘制相关图。对于每个miRNA，计算各组之间的基均值和对数倍变化。我们在DESeq2中使用负二项Wald检验进行了统计学假设检验来比较各组。两组间差异表达的miRNAs定义为|倍变化|≥2，虚假发现率(FDR)调整后p值< 0.05。我们还使用完全连锁和欧氏距离作为相似性度量进行了层次聚类分析，以显示满足|折叠变化|≥2和fdr调整p值< 0.05标准的差异表达mirna的表达模式。所有差异表达基因的数据分析和可视化均使用R 3.3.1 (gydF4y2Bawww.r-project.orggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

miRNA靶基因及其分子通路的鉴定gydF4y2Ba

我们将HVs和IMN-W、IMN-R患者中差异表达的miRNAs上传到常用的DIANA-miRPath、miRSystem等分析程序中进行进一步分析。DIANA-miRPath v.3.0数据库使用DIANA-microT-CDS和TargetScan 6.2分析mirna -基因相互作用。数据库模式包含了京都基因和基因组百科全书(KEGG)路径、基因本体论(GO)和GO细注释。基因和miRNA注释分别来自Ensembl和miRBase数据库。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

具有正态分布的连续变量用均数±标准差表示;没有正态分布的变量表示为具有四分位范围的中位数。的gydF4y2BatgydF4y2Ba-检验用于分析连续变量之间差异的统计学意义，类别变量采用卡方检验比较HVs与IMN患者的基线特征。将IMN组进一步分为两组，采用Kruskal-Wallis多重比较检验比较三个亚组(HVs vs. IMN- w vs. IMN- r)之间的连续变量。受试者工作特征(ROC)分析用于计算每个miRNA的曲线下面积(AUC)，用于IMN患者反应的诊断和预测治疗。P < 0.05为差异有统计学意义。采用SPSS (version 22.0;IBM公司，阿蒙克，纽约，美国)。gydF4y2Ba

基线临床特征gydF4y2Ba

参与者包括34名(56%)男性，平均年龄55岁(范围25-85岁)。参与者的基线特征见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．HVs无高血压、糖尿病或药物使用史。当我们比较IMN组和INS组的临床特征时，我们没有发现肾功能或蛋白尿的差异。同样，在IMN-W组和IMN-R组之间没有观察到基线特征的差异。IMN-R组的随访蛋白尿量大于IMN-W组(490 mg/d vs. 5458 mg/d, p = 0.007)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在随访期间，IMN-W组和IMN-R组分别给6例(67%)和5例(50%)患者开了包括类固醇和环孢素在内的免疫抑制剂。在免疫抑制药物中，环孢素联合类固醇是两组中最常见的方案。gydF4y2Ba

循环ev和小RNA组成变化的特征gydF4y2Ba

分离并鉴定了循环ev。动态光散射测量到的ev的中位直径为179±73.5 nm。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)和161.3±29.2 nm(图;gydF4y2Ba1gydF4y2BaB). Western blotting验证了广为人知的EV标记蛋白CD9的存在(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC).高尔基标记GM-130的缺失排除了具有细胞泡状结构成分的潜在污染(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC) (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．CD63(一种外泌体标记物)的水平在分离的EV样本中较高。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba直流)。用NGS生物分析仪分离EV RNA并分析RNA质量(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。为了检查EV小RNA的组成，我们进行了NGS，然后映射到每个小RNA参考数据库。利用NGS，我们鉴定了EV小rna，包括mirna、小核rna (snRNAs)、小核仁rna (snoRNAs)和转移rna。IMN-R组小rna为mirna的比例低于HVs和IMN-W组，而IMN-R组为snorna和snrna的比例高于HVs和IMN-W组(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2Ba

INS、IMN和HVs患者EV-miRNAs的比较gydF4y2Ba

RNA测序后，与HVs相比，我们在INS患者中鉴定出33个上调的miRNAs和11个下调的miRNAs(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba我们还发现，与INS患者相比，IMN患者中有3个miRNAs上调，8个miRNAs下调(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。与HVs相比，IMN患者中有31个mirna上调，27个mirna下调(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在这些mirna中，我们发现三种mirna (miRNA-1229-3p, miRNA-340-3p和miRNA-99b-5p)在IMN患者中与HVs和INS患者相比，其水平显著上调或下调(图3)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaD).显示每个miRNA的ROC下区域(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。此外，INS患者循环ev中两种mirna (miRNA-192-5p和miRNA-194-5p)的表达水平与HVs和IMN组相比有显著差异(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2Ba

IMN-W和IMN-R差异表达mirna的鉴定和分析gydF4y2Ba

此外，与HVs相比，我们发现IMN-W患者中有21个mirna上调，23个mirna下调(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5)。我们还发现，与HVs相比，IMN-R患者中有37个mirna上调，40个mirna下调(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6)。在两组IMN患者中，与IMN- w患者相比，IMN- r患者中有24个mirna上调，18个mirna下调(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．在差异表达的miRNAs中，我们发现了23个在IMN-R患者中表达的miRNAs(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．使用来自HV、IMN-W和IMN-R组的血清衍生ev进行主成分分析(PCA)的结果如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．我们使用miRSystem评估了与这些mirna相关的预测生物学途径。表中列出了与IMN-R相关的可能途径gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．参与肾纤维化的miRNAs列于表中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

EV-miRNAs与临床参数的相关性gydF4y2Ba

在IMN-R患者中差异表达的EV-miRNAs中，miRNA-1285-3p、miRNA-23a-5p、miRNA-483-5p和miRNA-6126的表达水平与肾活检的蛋白尿直接相关(表2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．同时，肾功能与miRNA-12136、miRNA-483-5p等mirna的表达呈负相关。仅miRNA-23a-5p与抗pla2r抗体有显著相关性。gydF4y2Ba

在本研究中，我们对IMN患者的循环EV-miRNA进行了测序，并将其与INS和HVs患者进行了比较。我们将imn特异性ev - mirna与HVs或INS受试者进行了比较。此外，我们发现ev - mirnas与IMN患者的治疗反应相关，这将有助于临床医生预测这些患者的预后。gydF4y2Ba

在各种肾小球疾病如IgA肾病和狼疮性肾炎患者中发现了差异表达的循环miRNAs [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．在HVs和IMN患者之间也观察到尿和循环外泌体mirna表达谱的显著差异[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．先前的一项研究表明，IMN中存在miRNA调控异常，与HVs相比，在IMN患者中观察到6种miRNA的表达差异(miR-152和-15上调，miR-82， -98， -89和-84下调)[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．这些mirna与本研究中鉴定的mirna没有重叠。这种差异可能是由于mirna的来源，因为之前研究的作者分析了外周血淋巴细胞的mirna。在本研究中，我们发现了三种IMN特异性ev - mirnas，这可能有助于区分IMN患者与INS患者或不伴有肾病综合征的患者。因此，本研究证明了EV-miRNAs作为IMN诊断的生物标志物的潜力。gydF4y2Ba

除了这些mirna，我们还发现了ev - mirna，有助于预测IMN患者的治疗反应。据我们所知，这是ev - mirna用于预测IMN患者治疗反应的首次研究。预测IMN患者的临床缓解对肾病学家来说很重要，因为完全或部分缓解与良好的肾脏生存相关[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．当一个难治性病例预计与常规治疗，临床医生可能能够提出替代治疗方案，以避免免疫抑制药物的不良反应。在我们的研究中，我们发现了23个在IMN-R患者中差异表达的mirna，这些mirna与IMN-W患者不同。有趣的是，这种途径似乎与癌症有关。虽然恶性肿瘤和肾小球间的因果关系尚未解决，但肾小球是最常见的恶性肿瘤相关肾小球病变类型。最近，von Haxthausen等人报道了IMN和恶性肿瘤相关MN之间抗原特异性IgG亚类的差异[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，提示特发性和恶性肿瘤相关MN的发病机制相似。因此，我们认为循环ev - mirnas可以作为非侵入性标志物，用于预测治疗期间IMN患者的临床缓解。gydF4y2Ba

在本研究中与IMN患者治疗反应相关的可能途径中，基于我们的数据，转化生长因子-β (TGF-β)信号通路似乎与预测治疗反应相关。肾纤维化通常是细胞外基质过度积累的最终结果，TGF-β通过上调基质蛋白合成、抑制基质降解在组织纤维化中发挥重要作用[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．先前的研究表明，在疾病活动性期间，尿TGF-β1水平升高，并与组织学特征和蛋白尿相关[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在MN患者中，初始尿TGF-β1水平较高与12个月时持续性肾病综合征和肾功能下降有关[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．在我们的研究中，与TGF-β通路相关的15个miRNAs中，let-7f和miR-23a的水平与肾活检的基线蛋白尿相关，这被认为是IMN的预测因子[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．此外，EV-miR-23a水平与抗pla2r抗体浓度直接相关。这些发现与之前的实验结果一致。据报道，miR-23a过表达通过抑制热休克蛋白抑制肾细胞活力和增殖70 [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．此外，上调糖尿病小鼠let-7f有助于缓解糖尿病肾病中足细胞损伤[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．有趣的是，蛋白聚糖是一个高度糖基化的蛋白质家族，主要参与组织组织，在本研究中似乎与IMN-R患者中差异表达的mirna有关。这一发现可能与抑制TGF-β信号通路有关[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除了TGF-β途径外，基于我们研究中鉴定的mirna，我们还分析了Hippo信号通路、Forkhead同型盒O (FoxO)和Rap1途径与IMN-R患者的肾纤维化相关。Hippo信号通路不仅参与与TGF-β、Wnt/β-catenin等信号通路的串音，而且在肾小管间质纤维化的发病机制中发挥作用[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．Rap1通路通过调控环腺苷3 '，5'-单磷酸信号通路影响肾纤维化[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．在本研究中，一些miRNAs，如let-7f和miR-23a，也被发现与FoxO和Hippo通路相关，类似于TGF-β通路。以前的研究也报道了其他疾病的这种关系[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．有趣的是，来自HVs和IMN的血清衍生ev的PCA，以及INS组显示出相对较差的界限。然而，PCA显示HVs的血清源性ev与IMN-W患者的血清源性ev之间存在一些重叠，IMN-R患者的血清源性ev具有完全不同的miRNA谱。虽然这些结果可能意味着IMN- r的纤维化改变是影响治疗反应的重要因素，但还需要进一步的研究来研究预测IMN患者临床反应的病理机制。我们的研究有一些局限性。首先，参与人数相对较少;因此，需要更大规模的前瞻性随机对照试验来证实我们的结果。接下来，使用商业试剂盒分离EV RNA;但是，使用其他方法进行隔离可能会产生不同的结果。到目前为止，还没有EV隔离的金标准方法。 Finally, we could not validate our findings in different cohorts, and this can be taken up in future studies.

我们的研究揭示了循环EV-miRNAs可以区分IMN患者、HVs患者和INS患者。此外，我们发现了与IMN患者临床缓解相关的循环EV-miRNAs，这可能被用作预测这些患者治疗期间临床缓解的替代标记物。然而，还需要进一步的研究来证实EV-miRNAs在诊断IMN和预测IMN患者的临床缓解方面的效用。gydF4y2Ba

由于该研究涉及人类参与者，由于伦理限制，数据不能在手稿中免费提供，也不能在公共存储库中提供。但是，符合机密数据访问标准的研究人员可以从顺天乡大学医院获得数据。感兴趣的研究人员可以向通讯作者(KY, Doh, SH. Kwon)发送数据访问请求。gydF4y2Ba

IMN:gydF4y2Ba

特发性膜性肾病gydF4y2Ba

IMN-R:gydF4y2Ba

有难治反应的IMNgydF4y2Ba

IMN-W:gydF4y2Ba

IMN反应良好gydF4y2Ba

INS:gydF4y2Ba

特发性肾病综合征gydF4y2Ba

PLA2R:gydF4y2Ba

抗磷脂酶A2受体gydF4y2Ba

电动汽车:gydF4y2Ba

细胞外囊泡gydF4y2Ba

microrna的:gydF4y2Ba

微gydF4y2Ba

阿基:gydF4y2Ba

急性肾损伤gydF4y2Ba

高压:gydF4y2Ba

健康的志愿者gydF4y2Ba

聚合酶链反应:gydF4y2Ba

聚合酶链反应gydF4y2Ba

qPCR:gydF4y2Ba

定量聚合酶链反应gydF4y2Ba

门店:gydF4y2Ba

新一代测序gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因百科全书gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

核内小rna:gydF4y2Ba

小核RNAgydF4y2Ba

snoRNA:gydF4y2Ba

小核仁RNAgydF4y2Ba

TGF -β:gydF4y2Ba

转化生长因子-βgydF4y2Ba

FoxO:gydF4y2Ba

叉头同形箱型O型gydF4y2Ba

一个也没有。gydF4y2Ba

本研究由韩国国家研究基金会(NRF)和顺天乡大学研究基金支持的工程研究中心计划(2018R1A5A1025511)和教育部(NRF- 2020r1i1a3a04037367)。本研究使用的生物标本和数据由韩国生物银行网络的成员soochun香大学首尔医院生物银行和首尔大学医院生物银行提供。(KBN4_A03)。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 在O. Sun和Yun-Ui Bae对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

2. Kyung-Oh Doh和Soon Hyo Kwon对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 大韩民国全州长老会医学中心内科肾脏科gydF4y2Ba

   在O. SungydF4y2Ba

2. 韩国大邱，启明大学医学院，启明大学东山医院内科gydF4y2Ba

   Yun-Ui BaegydF4y2Ba

3. 顺天乡大学首尔医院肾内科，首尔龙山区大关路59号，邮编04401gydF4y2Ba

   李海庆，金孝妮，全镇锡，卢贤珍，权顺孝gydF4y2Ba

4. 岭南大学医学院生理学系，大邱，42415，韩国gydF4y2Ba

   崔钟洙，dokyung - ohgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

IOS, YUB, KOD和SHK构思并设计了这项研究。YUB、JSC和KOD对数据进行了验证。IOS, HK, JSJ和HL研究数据。IOS、YUB、KOD进行统计分析。IOS, KOD和SHK撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaKyung-Oh哎gydF4y2Ba或gydF4y2Ba孙孝权gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

本研究的参与者自愿提供知情同意，并按照《赫尔辛基宣言》进行，研究方案由顺天乡大学首尔医院机构审查委员会批准(2016-01-002-007)。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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