CDK4/6抑制剂通过增强免疫表面分子的表达使γ疱疹病毒感染的肿瘤细胞对t细胞杀伤敏感gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

两种致癌人类γ疱疹病毒，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)都下调了免疫表面分子，如MHC-I, ICAM-1和B7-2，使它们能够逃避t细胞和自然杀伤细胞免疫。两者都编码人细胞周期蛋白同源物或促进细胞周期蛋白活性，这已被证明对γ疱疹病毒诱导的肿瘤的增殖和存活很重要。CDK4/6抑制剂被批准用于某些乳腺癌，已被证明可以增强乳腺癌细胞系和小鼠模型中MHC-I的表达，这归因于内源性逆转录病毒元件激活干扰素。然而，目前尚不清楚这是否会发生在γ疱疹病毒诱导的干扰素已经激活的肿瘤中。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

用CDK4/6抑制剂治疗多个KSHV/ ebv感染细胞系。活细胞的生长和表面标记物的表达被评估。用T细胞活化生物测定法测定处理细胞刺激的T细胞活化。RT-qPCR检测病毒和宿主基因表达。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

三种CDK4/6抑制剂，abemaciclib, palbociclib和ribociclib，抑制kshv诱导的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)和EBV阳性的伯基特淋巴瘤(BL)细胞系以及kshv感染的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞生长。此外，CDK4/6抑制剂增加了三种细胞中MHC-I的mRNA和表面表达，并阻止了kshv感染细胞中MHC-I表面表达的下调。CDK4/6抑制剂也不同程度地增加了ICAM-1和B7-2的mRNA和表面表达。Abemaciclib还显著增强了经处理的PEL和BL细胞诱导的t细胞活化。在大多数PEL和BL系中，某些γ疱疹病毒基因和内源性逆转录病毒(ERV) 3-1基因被CDK4/6抑制剂增强，这种增强与γ干扰素诱导的基因(包括MHC-I)的表达有关。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些观察结果证明CDK4/6抑制剂可以诱导γ疱疹病毒感染细胞系中表面免疫标记物MHC-I、B7-2和ICAM-1的表达，并诱导病毒特异性免疫。因此，它们可以阻止病毒诱导的免疫逃避。这些作用，以及它们对KSHV或ebv诱导的肿瘤的直接作用，为这些药物在这些肿瘤中的临床试验提供了一个合理的依据。gydF4y2Ba

两种致癌的γ疱疹病毒，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)和eb病毒(EBV)，是几种类型的肿瘤和增生性疾病的罪魁祸首。KSHV是卡波西肉瘤(KS)、原发性积液淋巴瘤(PEL)、多中心Castleman病(MCD)以及KSHV炎症细胞因子综合征(KICS)的病因[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．EBV在病因学上与各种人类肿瘤相关，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、移植后淋巴增性疾病(PT-LPD)、未分化鼻咽癌(NPC)和胃癌的一个独特亚群(GaCa) [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．虽然其中一些肿瘤可以治疗，但迫切需要新的治疗方式。gydF4y2Ba

这两种病毒都利用多种策略来逃避人体免疫系统。一种策略是抑制免疫表面分子的表达，如主要组织相容性抗原I类(MHC-I)，细胞内粘附分子1 (ICAM-1)和B7-2，也称为CD86。两个KSHV基因K3和K5作为E3泛素连接酶，促进多种细胞免疫表面分子的降解，包括MHC-I、ICAM-1和B7-2 [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．此外，kshv编码的延迟相关核抗原(LANA)可以抑制MHC-I的表达[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．多种EBV基因包括gydF4y2BaBNLF2a, BGLF5, BILF1, BCRF1gydF4y2Ba，通过直接干扰HLA-I抗原提呈途径下调MHC-I的表达[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．EBV编码的病毒白介素-10 (vIL-10)不仅能抑制MHC-I，还能抑制单核细胞上ICAM-1和B7的表达[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．这些KSHV和ebv编码基因下调MHC-I会损害CD8+ T细胞的抗原呈递。此外，ICAM-1和B7-2表达的降低能够逃避T细胞和自然杀伤细胞免疫。这种下调发生在KSHV或EBV引起的肿瘤中，使肿瘤对免疫系统相对不可见。这些发现表明，恢复这些表面免疫标记物可能会增强免疫识别和消除病毒感染的肿瘤细胞。gydF4y2Ba

细胞周期失调是γ疱疹病毒介导的肿瘤发生的一个标志，细胞周期蛋白对γ疱疹病毒诱导的肿瘤的生存很重要[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．Cyclin D2已被证明对kshv感染的PELs的生存至关重要[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．KSHV LANA与vCyclin-CDK6激酶复合物合作促进潜伏期和增强细胞增殖[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．Cyclin D1过表达是EBV稳定感染鼻咽上皮细胞所必需的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．EBV潜伏膜蛋白-1 (LMP-1)诱导的细胞周期蛋白D2表达有助于B细胞转化和不受控制的细胞增殖[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．所有这些观察都强调了cyclin D-CDK4/6作为γ疱疹病毒介导的肿瘤发生的关键调节因子的作用，并进一步表明cyclin D-CDK4/6可能作为KSHV或ebv相关肿瘤的免疫调节靶点。gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂被开发用于阻断周期蛋白D-CDK4/6复合物的形成，阻止Rb1磷酸化并导致细胞周期从G1期到S期阻滞[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．目前，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种用于治疗乳腺癌的抑制剂:abemaciclib (Abe)、palbociclib (Pal)和ribociclib (Rib) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．最近的一项研究表明，PEL细胞系需要cyclin D2的表达，并对体外Pal处理高度敏感[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多项研究表明，CDK4/6抑制剂除了可以阻断肿瘤细胞周期外，还可以上调结肠癌细胞中MHC-I的表达[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．有证据表明，这种效应是通过ERV3-1表达增强介导的，导致干扰素III型反应，包括MHC-I上调。如果CDK4/6抑制剂可以上调表面免疫标志物，这可能会促进它们对抗KSHV或ebv诱导的肿瘤的活性。然而，我们担心这种影响可能不会被观察到，因为这些肿瘤是慢性感染γ疱疹病毒的。gydF4y2Ba

为了探索CDK4/6抑制剂在γ疱疹病毒诱导的肿瘤中的潜在用途，我们研究了3种已批准的CDK4/6抑制剂Abe、Pal和Rib对PEL细胞、kshv感染的人脐内皮细胞(HUVEC)和ebv感染的BL细胞增殖的影响。此外，我们还研究了它们逆转肿瘤细胞中MHC-I、ICAM-1和B7-2下调的潜力，以及药物诱导的γ疱疹病毒和ERV3-1表达变化对这些影响的潜在作用。gydF4y2Ba

细胞和细胞培养gydF4y2Ba

BJAB细胞、PEL细胞系JSC-1、bbll -1、BC-1、BC-2;和EBV细胞系Akata、Raji和Daudi，如前所述获得并维持[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．JSC-1、BC-1和BC-2是EBV合并感染，而bcl -1不是。kshv感染的iSLK细胞株(BAC16株)由佛罗里达大学的Rolf Renne提供，在DMEM (Gibco)中添加10%胎牛血清(HyClone)、1.0 μg/mL嘌呤霉素、1.2 mg/mL湿霉素和250 μg/mL G418。HUVECs从龙沙购买，并在EGM-2 Bulletkit(龙沙)中维护，最多可进行5个通道，其中第3至5个通道用于实验。所有细胞保持在37℃和5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在Falcon细胞培养瓶。对于用抑制剂处理的细胞，漂浮细胞以2 × 10播种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba用CDK4/6抑制剂在指定浓度下处理长达3天，而贴壁细胞处理长达7天。gydF4y2Ba

测试化合物gydF4y2Ba

Abemaciclib (LY2835219)和palbociclib (PD-0332991)购自Selleck Chemicals，分别溶于乙醇和水，原液浓度为10 mM/mL。Ribociclib (LEE011, 10 mM/mL in DMSO)购自MedChemExpress。所有库存均在−20°C下存储。gydF4y2Ba

KSHV原液制备及新生感染gydF4y2Ba

为了制备潜伏表达绿色荧光蛋白(GFP)的KSHV-BAC16病毒原液，用强力霉素(1µg/mL;赛默飞世尔科学公司)和丁酸钠(1mm;Sigma Aldrich) 3 d诱导裂解复制。收集上清液，500×离心清除碎屑gydF4y2BaggydF4y2Ba过滤5分钟(Rapid-Flow 0.45-µm过滤器;赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)用超离心(2.5 h, 4°C, 50,000×)制粒gydF4y2BaggydF4y2Ba用SW 32 Ti;贝克曼库尔特)。然后用Dulbecco的改良Eagle介质(DMEM)(赛默飞世尔科学公司)重新悬浮颗粒。对于HUVEC的新生感染，用稀释后的病毒感染细胞，感染倍数(MOI)为15，以LANA拷贝数为标准，使用8 μg/ml聚brene。8小时后洗去病毒上清，用新鲜的内皮生长介质-2 (EGM2，龙沙目录号:CC-3162)替换。HUVEC每2天进行一次改良，直至收获。用ZOE荧光显微镜(BioRad)观察细胞，用ImageJ软件评估感染细胞的百分比为GFP+细胞的百分比。gydF4y2Ba

活细胞测定gydF4y2Ba

使用CellTiter-Glo®发光细胞活力检测试剂盒(Promega)分析活细胞的相对数量。简言之，在96孔板中，50 μL细胞中加入50 μL试剂。内容物在轨道激振器上混合2分钟，然后在室温下孵育10分钟。使用平板阅读器VICTOR™X3 (PerkinElmer)记录发光情况。用台盼蓝染色评估活细胞与死亡细胞的百分比。gydF4y2Ba

流式细胞仪分析及抗体gydF4y2Ba

细胞表面标记物表达分析如前所述[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．简单地说，对照细胞和处理细胞用1:50稀释的PerCP/ cyanine5.5标记的同型抗体或抗HLA I类(A, B和C)抗体孵育(Cat。#:311420)， ICAM-1(猫。#:353120)， B7-2(猫。#:374216)，或PD-L1(猫。#:329738)， 40分钟，然后用FACS缓冲液(2% FBS, 1 mM EDTA, Ca/Mg)洗涤三次gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}游离磷酸盐缓冲盐水[PBS])，悬浮在FACS缓冲液中，然后用流式细胞仪(BD生物科学公司)分析。使用FlowJo软件(flowjo.com)对数据进行分析和可视化。gydF4y2Ba

t细胞活化试验gydF4y2Ba

如前所述，使用t细胞激活生物测定法IL-2启动子试剂盒(Promega, cat# J1651)进行t细胞激活试验[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．简单地说，用指定浓度的CDK4/6抑制剂处理PEL细胞3天，之后用PBS清洗细胞，并以2:1的比例将BCBL-1和Jurkat与T细胞受体(TCR)/CD3效应细胞(在IL-2启动子下表达荧光素酶报告基因的Jurkat T细胞)混合，1:用不同浓度的抗人CD3单克隆抗体(OKT3) (ThermoFisher Scientific公司(cat# 16-0037-81))在37°C培养箱中刺激6 h。混合和培养在96个孔板中进行，每孔包含25 μL靶细胞、25 μL Jurkat细胞和25 μL抗CD3抗体。然后加入Bio-Glo试剂室温孵育10分钟。使用Victor X3多标签平板阅读器(PerkinElmer)捕获信号。含有细胞但不含Bio-Glo试剂的孔作为背景发光控制。使用GraphPad Prism软件绘制发光数据为4PL回归图。用没有靶细胞共刺激的Jurkat细胞信号减去靶细胞共刺激的Jurkat细胞信号，计算激活的倍数变化。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

采用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取mRNA。cDNA合成使用随机引物，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)在T100 Thermal Cycler (Bio-Rad)上进行。评价宿主基因mRNA水平，包括gydF4y2BaMhc-i, icam-1, b7-2, pd-l1, actbgydF4y2Ba，gydF4y2BaDDX58gydF4y2Ba，gydF4y2BaDNMT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaERV3-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIFIT1gydF4y2Ba， IFN -λ2 (gydF4y2BaIFNL2)gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfn -α， Ifn -β， Ifn -γ， nlrc5gydF4y2Ba，gydF4y2BaOAS2gydF4y2Ba,gydF4y2BaSTAT1gydF4y2Ba，以及病毒基因，包括kshv编码的开放阅读框(gydF4y2BaORF) 73gydF4y2Ba(拉娜),gydF4y2BaORF50gydF4y2Ba(转录激活因子调控因子[RTA])，gydF4y2BaK2gydF4y2Ba(病毒白细胞介素-6 [vIL6)]，gydF4y2BaORF45gydF4y2Ba,gydF4y2BaORF57gydF4y2Ba， ebv编码gydF4y2BaEBER2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBMRF1gydF4y2Ba， SYBR绿色qPCR检测使用Applied Biosystems®SYBR®green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific)在ABI StepOnePlus实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)上进行。使用的引物在附加文件中列出gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．以β-actin编码基因为内参基因，采用ΔΔCt法分析相对mRNA表达量。gydF4y2Ba

人IL-29/IL-28B DuoSet ELISA试剂盒gydF4y2Ba

细胞培养基收集到1.5 mL Eppendorf管中，15,000离心纯化gydF4y2BaggydF4y2Ba按照制造商的说明，使用人IL-29/IL-28B DuoSet ELISA试剂盒(研发，Cat # DY1598B-05)收集上清，通过ELISA分析IL28B和IL29的产生。简单来说，每孔加入100 μL的样品或标准品，孵育2 h。洗3次后，每孔加入100 μL的Streptavidin-HRP，孵育2 h。洗3次后，每孔加入100 μL的Streptavidin-HRP，室温避光孵育20 min。再洗3次，加入100 μL/孔底物溶液，室温下避光孵育20 min。最后加入50 μL/孔的停止液，用设置为450 nm的酶标仪测量光密度。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用双尾学生t检验(配对或未配对)对3个或3个以上生物重复的实验进行统计分析。p值小于或等于0.05被认为有统计学意义。星号表明p值:* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂抑制KSHV和ebv感染细胞的生长gydF4y2Ba

我们首先研究了CDK4/6抑制剂对各种kshv感染细胞(包括PEL细胞株JSC-1)生长的影响。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)， BCBL-1(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)， BC-1(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)和BC-2(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)，包括Akata在内的ebv感染BL系(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)， Raji(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)，和Daudi(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)，以及包括BJAB在内的两条ebv阴性BL(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)和CA46(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).所有三种CDK4/6抑制剂在第3天(72小时)对所有测试细胞系的细胞生长表现出剂量依赖性抑制作用，在最高测试剂量(1µM Abe和Pal，或5µM Rib)下观察到约30%至70%的抑制作用。我们还测试了Abe对未感染HUVEC和kshv感染HUVEC细胞生长的影响。为了产生KSHV感染的HUVEC，将细胞暴露于浓缩的KSHV病毒储存中。BAC16使用每个细胞15个病毒DNA拷贝数在24小时内达到85%左右的gfp阳性率(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．GFP在KSHV中构成表达。bac16感染细胞和GFP表达可用于感染细胞的鉴定。在0.02 μ M或更高浓度时，Abe从第4天开始抑制kshv感染的HUVEC细胞的生长;到第7天，在最高剂量(0.5µM)下，细胞生长被抑制约50%。此外，Abe同样抑制了未感染的HUVEC的生长。CDK4/6抑制剂培养后活细胞数量的减少是由增殖的减少而不是细胞死亡的增加引起的。用Abe以减少细胞数量的剂量培养3天(B细胞)或4天(未感染或感染的HUVEC细胞)后，通过台锥蓝排除评估，活细胞的百分比没有下降(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂增加KSHV和ebv感染细胞中的MHC-I表面表达gydF4y2Ba

接下来，我们探索了CDK4/6抑制剂对KSHV和ebv感染细胞上MHC-I表面表达的影响。几种kshv编码的裂解基因包括K3和K5可以泛素化MHC-I并降低其表面表达。与此一致的是，JSC-1的MHC-I表达下降到对照的37.5%。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa和g)和31%的BCBL-1(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB和g)经丁酸盐裂解诱导后。然而，用1 μM Abe预处理这些细胞基本上阻止了丁酸盐对MHC-I的下调(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba即使没有裂解诱导，用1µM Abe处理JSC-1和BCBL-1 PEL细胞系也能增加表面MHC-I的表达(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b).用1µM Abe处理另外两种PEL细胞系BC-1和BC-2，在细胞表面表现出类似的MHC-I上调(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba模拟)。Abe还增加了ebv感染的Akata和Raji细胞系中MHC-I的表面表达(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac, d).图gydF4y2Ba2gydF4y2Bag为MHC-I在JSC-1和BCBL-1 PEL系以及Akata和Raji ebv感染BL系上3次实验表达的均值和标准差。我们进一步测试了Pal和Rib以及Abe对JSC-1和BCBL-1 PEL系以及Akata和Raji ebv感染BL系MHC-I表达的影响。从图中可以看出。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag，所有三种CDK4/6抑制剂都增加了诱导裂解复制的PEL系以及未诱导系上MHC-I的表达。此外，这三种药物均能增强Akata和Raji BL系MHC-I的表达。ebv未感染的BJAB a伯基特淋巴瘤B细胞系，在用1µM Abe处理时也表现出MHC-I的增加，尽管它低于病毒感染的细胞系(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Bae、f)。gydF4y2Ba

我们还测试了Abe对kshv感染和未感染HUVEC中MHC-I表达的影响。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae, f, h)。细胞感染KSHV。BAC16获得约85%表达GFP的细胞。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Bah，虽然0.1和0.5µM Abe均诱导kshv感染HUVEC的MHC-I显著和剂量依赖性增加，但仅0.5µM Abe在未感染HUVEC中诱导MHC-I小幅增加。gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂增加KSHV和ebv感染细胞中ICAM-1、B7-2和PD-L1表面表达gydF4y2Ba

KSHV和EBV也下调了ICAM-1和B7-2的表面表达[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，它们对t细胞和nk细胞的激活和效应功能非常重要。我们评估了CDK4/6抑制剂对ICAM-1和B7-2表面表达的影响，以及PD-L1对病毒未感染的BJAB细胞和同一组病毒感染的PEL和BL细胞系的影响(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．BJAB细胞、PEL细胞和ebv感染的BL细胞分别用1 μM Abe、1 μM Pal和5 μM Rib处理3天，未感染和kshv感染的HUVEC分别用0.5 μM Abe、0.5 μM Pal和2.5 μM Rib处理4天。然后用流式细胞仪对细胞进行分析。所有测试的细胞系对所有3种CDK4/6抑制剂均表现出ICAM-1和B7-2表面表达的显著增加，尽管病毒感染系与病毒阴性BJAB系相比表现出更大的增加。KSHV和ebv感染细胞中ICAM-1的平均增加倍数为2.5 - 4.5倍(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)， B7-2为3.2 ~ 6.0倍(图7-2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).此外，所有3种CDK4/6抑制剂使PD-L1的表达从4.2倍增加到8.3倍(图4)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)被病毒感染的细胞系。暴露于药物的未受病毒感染的BJAB细胞表面标志物的增加幅度要小得多。我们还测试了药物对未感染和感染HUVEC细胞的影响。虽然在未感染的HUVEC中有相对较小的增加(ICAM-1为1.5,B7-2和PD-L1为2.0)，但在kshv感染的HUVEC中，所有3种标记物的表达均有较大幅度的增加(ICAM-1为2.7至4.2,B7-2为25.4至5.8,PD-L1为5.2至7.2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad-f，附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂可增加KSHV和ebv感染细胞中MHC-I、ICAM-1、B7-2和PD-L1 mRNA的表达gydF4y2Ba

我们进一步评估了CDK4/6抑制剂对JSC-1中这些表面标志物mRNA表达的影响。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)， BCBL-1(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)， Akata(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bac)和Raji(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)细胞。用1 μM Abe或溶剂对照(培养基中稀释乙醇)培养细胞24 h或48 h，提取总RNA进行qPCR分析。结果显示，在治疗后的两个时间点，这4个基因的mRNA表达量均显著增加，24 h时MHC-I、ICAM-1、B7-2的mRNA表达量平均增加1.6 ~ 1.8倍，ICAM-1、B7-2分别增加1.4 ~ 1.5、2.8 ~ 3.4倍，48 h时MHC-I、ICAM-1、B7-2分别增加2.0 ~ 2.4倍、1.9 ~ 2.2倍、2.8 ~ 3.3倍。PD-L1的mRNA表达量在24 h时显著增加1.5 ~ 1.8倍。48小时时，除bbll -1细胞外，所有细胞均增加2.4至3倍。这些结果证明Abe增加的表面标记物表达至少部分来自基因转录的增加。gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂治疗PEL和ebv感染的BL细胞可增强这些细胞系的t细胞活化gydF4y2Ba

接下来，我们试图评估这些CDK4/6抑制剂处理的细胞是否会通过增加共刺激分子的表达来增强t细胞的激活。与之前的实验一样，Abe处理BCBL-1 PEL细胞和Akata BL细胞3天后，ICAM-1和B7-2的表面表达上调(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).用表达IL-2启动子控制下的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞作为效应细胞，在同一细胞培养的等份中评估Abe诱导的t细胞激活，并使用抗cd3抗体激活这些细胞。在没有CDK4/6抑制剂的情况下培养的BCBL-1和Akata细胞都使Jurkat t细胞的活化水平高于基线(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, e)。然而，与对照组未处理的细胞相比，abe处理的BCBL-1和Akata细胞以剂量依赖的方式进一步刺激Jurkat t细胞的激活(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, e).当用0.6 μg/mL抗cd3抗体共同刺激时(图中红色箭头所示)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, d)， 0.3 μM abe处理的BCBL-1细胞和1 μM abe处理的Akata细胞诱导t细胞活化的平均增加分别是对照处理的2.6倍和5倍。gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂诱导KSHV和EBV基因以及ERV-3表达增加gydF4y2Ba

Abe已被证明可以抑制DNA甲基转移酶的表达，从而导致内源性逆转录病毒ERV3-1的表达增加，有人认为这可能是MHC-I表达增加的一种机制[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．特别是，有人认为ERV3-1刺激干扰素III型，从而导致干扰素诱导基因包括MHC-I的表达增加。我们感兴趣的是，这种机制是否适用于本文研究的细胞系，这些细胞系被外源病毒感染，因此可能具有高水平的干扰素表达，而不会被ERV3-1增加。我们也有兴趣探索abe诱导的KSHV和/或EBV基因表达可能有助于这种效应的可能性[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为此，我们评估了选择的潜伏性和溶性γ疱疹病毒基因的mRNA表达水平，DNA甲基转移酶1 (gydF4y2BaDNMT1),gydF4y2Ba内源性逆转录病毒ERV3-1gydF4y2Ba干扰素-α干扰素β,gydF4y2Ba干扰素-γ,gydF4y2Ba干扰素-λ2gydF4y2Ba用1µM Abe处理KSHV和ebv感染肿瘤细胞系24小时后，选择干扰素诱导的基因。Abe处理后，bbll -1和JSC-1 PEL细胞系中KSHV溶解基因ORF45和ORF57显著增加(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).此外，bbll -1细胞中的溶解基因K2 (ville -6)、ORF50(编码(RTA))和ORF73(编码延迟相关核抗原(LANA))上调，而JSC-1细胞中没有上调。1µM Abe处理24 h后，表达上调gydF4y2BaEBER2gydF4y2Ba， EBV潜伏转录本最丰富gydF4y2BaBMRF1gydF4y2Ba在Akata细胞和JSC-1细胞中表达，而在Raji细胞中不表达(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).因此，Abe处理可变地增加了这些细胞系中γ疱疹病毒潜伏基因和溶解基因的表达。gydF4y2Ba

DNMT1,gydF4y2Ba抑制内源性逆转录病毒的表达，并已报道抑制某些γ疱疹病毒基因[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，在JSC-1和BCBL-1 PEL细胞和Raji ebv感染的BL细胞中，1µM Abe处理后均显著下调;Akata细胞也有减少的趋势，尽管变化不显著(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).内源性逆转录病毒基因的表达gydF4y2BaERV3-1gydF4y2Ba，它被gydF4y2BaDNMT1gydF4y2Ba，在除Raji外的所有被测品系中均显著上调(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).此外，dsRNA传感器gydF4y2BaDDX58gydF4y2Ba它能感知内源性逆转录病毒并刺激IFN信号，在所有四种细胞系中也被上调(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).接下来我们专门研究了干扰素的表达。我们发现gydF4y2BaIFNL2,干扰素-αgydF4y2Ba,gydF4y2Ba干扰素-βgydF4y2Ba，但IFN-γ mRNA的表达在测试的三个系(JSC-1, bbll -1和Akata)中增加，但在Raji细胞中没有增加(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).此外，使用ELISA试剂盒测量IL28B和IL29，干扰素家族的另外两个成员，我们发现1 μM Abe处理3天后JSC-1和BCBL-1细胞的上清液增加(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了评估干扰素活性增强的下游影响，我们测量了ifn敏感转录因子gydF4y2BaSTAT1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNLRC5gydF4y2Ba，以及两个ifn刺激基因，gydF4y2BaIFIT1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOAS2gydF4y2Ba在这些细胞里。Abe作用后，这4个基因在JSC-1、bbll -1和Akata细胞中的表达均显著增强(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).然而，在这一点上，拉吉又是一个异类gydF4y2BaIFIT1gydF4y2Ba没有明显的变化和gydF4y2BaNLRC5gydF4y2Ba减少(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

一些研究表明，除了对癌细胞有直接作用外，CDK4/6抑制剂还可以增强某些肿瘤表面MHC-I的表达，从而使免疫系统更容易看到细胞[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．在本报告中，我们通过显示CDK4/6的药理学抑制可以增强两种致癌疱疹病毒(KSHV和/或EBV)感染的细胞中MHC-I的表达，扩展了这些发现。此外，我们发现这些抑制剂还上调了感染肿瘤细胞中ICAM-1和B7-2的表达，从而使NK杀伤和增强t细胞对肿瘤细胞的敏化。我们进一步发现Abe诱导的表面表达增加至少部分是由于这些基因mRNA表达的增加。最后，我们证明Abe增强了PEL细胞系诱导的T细胞激活。图中概述了CDK4/6抑制剂在EBV和/或kshv感染细胞中上调表面免疫标记物以及随后激活T细胞和NK细胞的拟议机制。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

研究表明，KSHV vCyclin/CDK6复合物在KSHV感染细胞中被组成性激活[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．此外，PEL细胞高度依赖于细胞周期蛋白D2，与CDK4或CDK6的复合物在细胞周期G1/S转变中需要细胞周期蛋白D2 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．就EBV而言，病毒编码蛋白LMP-1在EBV阳性的伯基特淋巴瘤细胞系中诱导细胞周期蛋白D2的表达，以促进细胞不受控制的增殖[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．这些数据表明CDK4/6抑制剂可能抑制KSHV和/或ebv诱导的肿瘤的生长，Manzano等人已经证明CDK4/6抑制剂Pal可以导致BCBL-1和BC-3 PEL细胞明显的G1阻滞[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．我们的研究结果扩展了这一观察结果，并表明Pal和其他两种CDK4/6抑制剂也可以抑制ebv感染的肿瘤细胞以及kshv感染的HUVEC细胞的生长。有趣的是，在ebv感染的Burkitt细胞和对照ebv未感染的Burkitt B细胞之间观察到的生长抑制程度没有显著差异(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和图S1)，表明CDK4/6抑制剂的这种生长抑制作用不需要病毒成分。gydF4y2Ba

病毒诱导的肿瘤可能非常容易受到免疫控制，因为它们表达病毒编码的外源蛋白。然而，致癌病毒已经进化出抑制表面免疫标记物表达的有效机制，从而使感染细胞和病毒诱导的肿瘤逃避免疫系统的检测[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．因此，逆转这种下调的方法可能是控制这些肿瘤的重要手段。近年来，多项研究表明，CDK4/6抑制剂除了抑制细胞增殖外，还可能上调乳腺或结肠肿瘤中编码MHC-I和抗原递呈途径的基因[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，或通过抑制调节性T细胞增殖来改变肿瘤微环境[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，或增强肿瘤浸润T细胞的激活[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．这些研究也提供了证据，证明CDK4/6抑制剂上调MHC-I是DNMT1降解的结果，导致内源性逆转录病毒(erv)激活，然后激活干扰素和干扰素诱导的基因[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．由于KSHV和ebv诱导的肿瘤的慢性γ疱疹病毒感染可能已经提供了干扰素的刺激，我们想知道CDK4/6抑制剂是否会出现类似的MHC-I上调。事实上，我们在所有KSHV和ebv相关肿瘤以及KSHV感染的HUVEC细胞中发现了MHC-I的强烈上调。此外，我们发现这些药物显著上调了ICAM-1和B7-2。gydF4y2Ba

CDK4/6抑制剂上调ICAM-1和B7-2的效果值得注意。ICAM-1和B7-2是T细胞和NK细胞杀伤的重要辅助因子[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．MHC-I的表达对T细胞的杀伤很重要，而MHC-I的下调一般会在ICAM-1和B7-2表达时激活NK细胞的杀伤。然而，在γ疱疹病毒感染的细胞中，这三种表面蛋白的下调可能会使T细胞和NK细胞逃脱杀伤。通过上调ICAM-1和B7-2以及MHC-I, CDK4/6抑制剂使肿瘤细胞对T细胞杀伤和某些类型的NK细胞杀伤都敏感。这一结论得到了CDK4/6治疗增强T细胞活性的观察结果的支持。gydF4y2Ba

值得注意的是，我们的研究结果还表明，CDK4/6抑制剂可以增强PD-L1的表达，这可能会抑制其他免疫表面标记物表达诱导的免疫反应。针对PD-1或PD-L1的抗体最近被证明可以逆转由PD-1/PD-L1介导的免疫抑制，并对表达新表位的某些肿瘤具有强大的活性[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．观察到Abe诱导的γ疱疹病毒诱导细胞中PD-L1的增加，这表明CDK4/6抑制剂在抗pd -1或抗PD-L1治疗时可能是最有效的免疫治疗。在这方面，最近的小鼠肿瘤研究表明，这种治疗可以增强cdk4 /6诱导的肿瘤控制[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

先前关于CDK4/6抑制剂对MHC-I影响的研究提供了证据，表明上调可能是DNMT1降解的结果，导致内源性逆转录病毒的激活，随后是干扰素和干扰素诱导的基因激活[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．我们想知道类似的机制是否适用于感染γ疱疹病毒的细胞。我们发现Abe确实抑制DNMT-1，而且这种抑制与内源性逆转录病毒ERV3-1、dsRNA传感器RIG-I、IFN-α、IFN-β、III型干扰素IFN-λ2 (IL28A)、IFN敏感转录因子包括STAT1和NLRC5，以及干扰素刺激基因如IFIT1和OAS2的激活有关。STAT1可通过IFNα诱导NLRC5转录激活[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．由于NLRC5可使MHC-I转活性增强[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]， stat1和NLRC5表达升高导致MHC-I过表达。STAT1也上调了ICAM-1和PD-L1 [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．尽管研究表明IFN I型会上调B7-2 [gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]， B7-2的上调是否通过同样的机制仍然是一个未解之谜。有趣的是，我们还观察到潜伏性和溶出性KSHV和EBV病毒基因mRNA表达的增加，尽管观察到的升高(从1.3倍到3.4倍不等)在细胞系之间有所不同，而且相对较小。目前尚不清楚ERV激活、γ疱疹病毒基因激活或两者都可能导致KSHV或ebv感染细胞中表面标志物的上调，还需要进一步的研究来进一步阐明这些影响的机制。gydF4y2Ba

我们实验室先前的研究表明，免疫调节药物pomalidomide (Pom)在一系列KSHV感染的PEL和ebv感染的BL细胞中也上调了包括MHC-I、ICAM-1和B7-2在内的免疫表面分子[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．Pom已被证明在临床上对KS有效，事实上现在已被批准用于这一适应症[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，但尚不清楚Pom是否上调了内皮细胞中的这些分子。此外，Pom + pembrolizumab(一种抗pd -1抗体)的组合已被证明对一些难治性EBV +淋巴瘤患者有效。如图所示，CDK4/6抑制剂不仅在KSHV +或EBV +淋巴细胞中上调了这些分子，而且在KSHV感染的内皮细胞中也上调了这些分子。这表明CDK4/6抑制剂可能值得测试抗KS的活性。为了探索这种可能性，我们的团队已经启动了一项临床试验，在KS患者(NCT04941274)中测试Abe。此外，最近有证据表明，病毒诱导的肿瘤可能对抗pd1或抗PD-L1治疗敏感，这可能是因为它们表达外源(病毒编码)蛋白，并且因为病毒经常上调PD-L1 [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．考虑到CDK4/6抑制剂也上调PD-L1，未来将这些药物与抗pd -1/PD-L1治疗用于病毒诱导的肿瘤可能是值得探索的，尽管任何益处都必须与潜在的增强毒性进行权衡。gydF4y2Ba

总之，CDK4/6抑制剂可以抑制PEL、kshv感染的内皮细胞和EBV+伯基特淋巴瘤细胞的增殖，也可以逆转病毒诱导的MHC-I、ICAM-1和B7-2对这些细胞的抑制。经处理的细胞对t细胞杀伤致敏可能是由于这些表面标志物包括ICAM-1和B7-2的表达增强。γ疱疹病毒已经进化出多种机制来下调这些表面标记物的表达，从而使KSHV和ebv感染的肿瘤对免疫系统相对不可见。通过逆转这一作用，CDK4/6抑制剂除了直接影响肿瘤细胞增殖外，还可能促进γ疱疹病毒诱导的肿瘤的免疫控制。gydF4y2Ba

本研究所使用的材料和数据均可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

安倍:gydF4y2Ba

AbemaciclibgydF4y2Ba

提单:gydF4y2Ba

伯基特淋巴瘤gydF4y2Ba

DNMT1:gydF4y2Ba

DNA甲基转移酶1gydF4y2Ba

EBV:gydF4y2Ba

巴尔病毒gydF4y2Ba

ERV:gydF4y2Ba

内源性逆转录病毒gydF4y2Ba

食品药品监督管理局:gydF4y2Ba

食品和药物管理局gydF4y2Ba

GaCa:gydF4y2Ba

胃肠癌gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

霍奇金淋巴瘤:gydF4y2Ba

何杰金氏淋巴瘤gydF4y2Ba

HUVEC:gydF4y2Ba

人脐静脉内皮细胞gydF4y2Ba

ICAM-1:gydF4y2Ba

细胞内粘附分子gydF4y2Ba

断裂韧性:gydF4y2Ba

KSHV炎性细胞因子综合征gydF4y2Ba

KS:gydF4y2Ba

卡波西肉瘤gydF4y2Ba

KSHV:gydF4y2Ba

卡波西肉瘤相关疱疹病毒gydF4y2Ba

拉娜:gydF4y2Ba

延迟相关核抗原gydF4y2Ba

LMP-1:gydF4y2Ba

潜伏膜蛋白-1gydF4y2Ba

背景:gydF4y2Ba

多中心Castleman病gydF4y2Ba

mhc i:gydF4y2Ba

主要组织相容性抗原I类gydF4y2Ba

NK:gydF4y2Ba

自然杀伤细胞gydF4y2Ba

全国人大:gydF4y2Ba

未分化鼻咽癌gydF4y2Ba

朋友:gydF4y2Ba

PalbociclibgydF4y2Ba

图像的基本单位:gydF4y2Ba

原发性积液淋巴瘤gydF4y2Ba

PT-LPD:gydF4y2Ba

移植后淋巴增生性疾病gydF4y2Ba

肋骨:gydF4y2Ba

RibociclibgydF4y2Ba

vIL-10:gydF4y2Ba

病毒白细胞介素- 10”gydF4y2Ba

vIL-6:gydF4y2Ba

病毒的白细胞介素- 6gydF4y2Ba

我们感谢大卫·a·戴维斯的帮助。gydF4y2Ba

由美国国立卫生研究院(NIH)提供的开放获取资金。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心的校内研究计划的支持。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 美国马里兰州贝塞斯达中心路10号MSC 1868号10号楼6N106室，国家癌症研究所癌症研究中心HIV和艾滋病恶性肿瘤科，邮编20892-1868gydF4y2Ba

   吴义泉，Prabha Shrestha, Natalie M. Heape和Robert YarchoangydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YW和RY构思并设计了该研究。YW、PS和NMH进行了实验。YW, PS和RY对数据进行了分析。YW和RY撰写了手稿。RY提供了资金。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba罗伯特YarchoangydF4y2Ba．gydF4y2Ba

这项研究部分作为摘要和海报在第23届卡波西肉瘤疱疹病毒及相关制剂国际研讨会虚拟会议(2021年)和第17届艾滋病毒/艾滋病恶性肿瘤国际会议上发表，NIH, Bethesda, MD(2019年)。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

R. Yarchoan报告说，通过与NCI的CRADAs，获得了Celgene(现为Bristol Myers Squibb)的研究支持。Yarchoan博士还报告了从Merck, EMD-Serano, Eli Lilly和CTI BioPharma通过与NCI的CRADAs接受临床试验的药物，他还从Janssen Pharmaceuticals接受了实验室研究的药物供应。R. Yarchoan是美国专利10,001,483的联合发明人，该专利名为“使用免疫调节化合物和生物标志物治疗卡波西肉瘤或kshv诱导淋巴瘤的方法”。R. Yarchoan还是艾滋病毒肽疫苗和用il - 12治疗卡波西肉瘤专利的共同发明人，R. Yarchoan的直系亲属是目标受体内化、KSHV病毒IL-6以及使用钙网蛋白和钙网蛋白片段抑制血管生成相关专利的共同发明人。这些专利的所有权利、所有权和利益已经或应该根据法律分配给美国卫生与公众服务部;根据1986年《联邦技术转让法案》(P.L. 99-502)，政府将其收到的部分专利费转让给其雇员发明人。其他作者没有披露潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

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