成人健康人鼻液和血浆中激肽谱变化的质谱研究gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

kallikrein-kinin系统被认为在健康和疾病中具有多功能作用，但由于目前公布的血浆kinin水平数据存在分歧，从低皮摩尔到高纳摩尔范围，甚至在健康志愿者中，其在人体内的作用仍不清楚。此外，现有的数据往往局限于报告单个激肽的水平，从而忽略了活性激肽对缓激肽(BK)受体的不同影响，考虑到不同的代谢途径。一个具有良好特征和全面评估的健康队列是必要的，以便更好地了解麒麟蛋白谱的生物学变异性，从而能够可靠地区分疾病特异性麒麟蛋白谱。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

为了全面研究激肽谱的生物学水平和变异性，招募了28名健康成年志愿者。采用标准化方案，在定制的蛋白酶抑制剂预掺加管中对鼻灌洗液和血浆进行采样，证明可以显著限制日间和个体间的差异。使用有效的LC-MS /MS平台定量评估了9种激肽:kallidin (KD)， HypgydF4y2Ba^4gydF4y2BaKD, KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}， BK, HypgydF4y2Ba^3.gydF4y2BaBK,汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba},汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba},汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}，和BKgydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}．采用尿素相关法测定鼻上皮衬液中激肽的浓度。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

循环血浆激肽水平被证实在非常低的皮摩尔范围内，BK的水平低于4.2 pM，其他激肽的水平甚至更低。鼻上皮粘膜液中的内源性激酶水平显著升高，KD的中位水平为80.0 pM, BK的中位水平为139.1 pMgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba-BK/BK = 1.6)，但羟化KD水平明显低于KD (HypgydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-kd / kd = 0.37)。内源性激肽水平无性别特异性差异。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这一具有良好特征的健康队列能够研究kinins作为生物标志物的潜力，并为研究kinins在血管性水肿、败血症、中风、阿尔茨海默病和COVID-19等疾病中的变化提供有效的对照组。gydF4y2Ba

激肽-激肽系统(KKS)是一个复杂的级联蛋白，蛋白酶，活性和非活性的激肽。KKS参与生理和病理生理过程，并与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)完全交织在一起;两种系统都起反调节作用以维持生理性止血[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．激肽是炎症介质，与炎症主要体征的病理发展有关[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．它们通过激活g蛋白偶联缓激肽(BK)受体1型和2型发挥作用，其中1型在炎症期间特别上调(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．尽管KKS被提议参与许多疾病，如败血症、COVID-19、中风、阿尔茨海默病和过敏反应，但遗传性血管性水肿目前仍然是靶向该系统的唯一治疗应用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

由于缺乏确定激肽作为生物标志物的数据，限制了其临床应用。尽管在过去的几十年里，科学方法取得了类似的进步，但关于强有力的激肽量化的科学进展却落后于RAAS等可比系统[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．免疫反应性激肽的测定并不能区分BK 2型受体激动剂BK和kallidin (KD)，它们通过不同的途径释放(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外，特别是在血浆中，已发表的BK水平变化了几个数量级(低pM到高nM)，阻碍了健康与疾病的区分以及相互研究的比较[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．这种可变性是由于在分析前和分析阶段，激肽水平结果对样品处理的高度敏感性;肽的短半衰期和通过接触活化因子XII在血浆中人工生成的肽BK使得标本处理技术至关重要(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，现有的数据往往局限于单一的kinin水平的报道，从而忽视了多种活性kinin对两种BK受体类型和不同代谢途径的不同影响(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

最近，可靠和稳健的肌肽测定已广泛研究使用现代生物分析技术。质谱分析灵敏度的提高建立了有效的液相色谱-串联质谱(LC-MS /MS)平台，用于全面测定人血浆和呼吸道灌洗液中的活性和非活性激肽[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．该技术促进了对分析前变量的调查和随后的标准化，有助于大幅降低血浆激肽水平的日内和个体间变异性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．然而，在健康个体之间存在生物变异，这可能会被人为的激肽变化所混淆。因此，更好地了解健康个体的kinin谱对于探索和区分疾病特异性kinin谱是至关重要的，因为RAAS已经可以实现这一点[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在BK增加的COVID-19大流行期间，了解疾病特异性的kinin谱已成为关注的主题gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)结合后血管紧张素转换酶2活性下降有关[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．考虑到呼吸道灌洗液的激肽水平数据的缺乏和血浆水平的差异，确定健康个体的内源性谱对于识别COVID-19和其他疾病中激肽水平的改变是必不可少的。gydF4y2Ba

因此，本研究旨在全面研究激肽谱(KD, HypgydF4y2Ba^4gydF4y2BaKD, KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}， BK, HypgydF4y2Ba^3.gydF4y2BaBK,汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba},汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba},汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}，和BKgydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba})使用上述LC-MS /MS平台在健康志愿者人群的鼻液和血浆中进行检测。gydF4y2Ba

研究设计gydF4y2Ba

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》所表达的原则进行的，并得到海因里希·海涅大学医学院伦理委员会的批准(研究编号:6112)。所有参与者在入组前均提供书面知情同意书。生物分析遵循良好临床实验室规范进行。招募年龄在18岁以上、无任何呼吸道感染或急性过敏症状的健康志愿者。服用干扰KKS药物的志愿者被排除在外。在生物液采样之前，对参与者进行了COVID-19检测(Panbio™COVID-19 Ag Rapid, Abbott Laboratories, IL, USA)，以排除无症状的SARS-CoV-2感染。收集志愿者静脉血、鼻灌洗液(NLF)和人口统计学数据。gydF4y2Ba

血液采样gydF4y2Ba

采用标准化方案采集静脉血，经证明可显著限制血浆中激肽水平的日内和个体间变异[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．血液采集于直立姿势，吸入2.7 mL K3乙二胺四乙酸S-Monovettes®(Sarstedt, Nümbrecht，德国)，预加定制的蛋白酶抑制剂[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．通过评估BK的管间变异性，对三个连续的管进行采样，以确认足够的血液采样，其目标是< 2pm。此外，在缺乏抑制剂的情况下抽取第四管，以监测缺乏抑制剂和不适当的采样对人工生成血浆激肽水平的影响。因此，在静脉穿刺后15min，第四管加入蛋白酶抑制剂。gydF4y2Ba

此外，研究人员还调查了激肽水平是否受昼夜节律的影响。在以下时间点从一名男性和一名女性受试者身上抽取血液:上午6点、9点、12点、3点和6点。gydF4y2Ba

使用21g Safety Multifly®针和200mm导管(Sarstedt, Nümbrecht，德国)从左或右肘中静脉、头静脉或基底静脉取血，针顺行插入。血液样本立即以2000倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba室温10分钟。血浆储存在- 80°C直到分析。gydF4y2Ba

鼻灌洗液取样gydF4y2Ba

用10ml 0.9%生理盐水(B. Braun, Melsungen，德国)进行鼻腔灌洗，每个鼻孔使用5ml预充注射器和Schnozzle®鼻腔冲洗适配器(Splash Medical Devices, LLC, GA, USA)。志愿者被要求头向后仰，屏住呼吸，不要吞咽。将得到的液体直接收集到蛋白酶抑制剂中，并在完成采样后进行涡流处理。根据美国胸科学会支气管肺泡灌洗指南，在灌洗过程中必须至少回收30%的灌注容积[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．样品在4°C, 500 ×离心15 mingydF4y2BaggydF4y2Ba去除细胞，粘液和碎片。NLF样品保存在−80°C直到分析。gydF4y2Ba

估计鼻上皮粘膜液中的激肽水平gydF4y2Ba

NLF中的激肽水平被灌洗液稀释，因此不代表内源性激肽水平。为了估算内源性鼻上皮衬液(NELF)中的激肽水平，测定了与血浆相比NLF中尿素的稀释度。因此，采用酶免疫测定法(EIABUN, Invitrogen™，Carlsbad, CA, USA)测定健康志愿者NLF(未稀释)和血浆(1:20稀释)中的尿素氮。尿素氮测定性能与样品的平均R值呈线性关系gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 1 [n = 4])，精确(在三个质量控制级别[低，中，高]的-和-之间的精度在- 1.9到2.2%之间)和精确(在三个质量控制级别[低，中，高]的运行内和运行间精度< 3.6%)，应用定制的蛋白酶抑制剂。gydF4y2Ba

然后用公式计算稀释因子。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba根据Kaulbach等人。[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]：gydF4y2Ba

鼻腔灌洗稀释因子的计算。gydF4y2Ba

使用确定的个体依赖性稀释因子，通过鼻灌洗对奎宁水平进行稀释，如下所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba):gydF4y2Ba

NELF中激肽浓度的计算。gydF4y2Ba

此外，还计算了灌洗后NELF样本的体积[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]：gydF4y2Ba

计算鼻上皮衬里液的采样量。gydF4y2Ba

质谱法定量激肽gydF4y2Ba

定量评价了以下激肽:卡利丁(三氟乙酸(TFA)盐，96.9%，高效液相色谱(HPLC);Tocris, Bristol，英国)，BK(醋酸盐，99.0%，HPLC;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)及其代谢产物BKgydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}(醋酸盐，98.7%，HPLC;圣克鲁斯生物技术，达拉斯，德克萨斯州，美国)，BKgydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}(TFA盐，≥95.0%，HPLC;GenScript，皮斯卡塔韦镇，新泽西州，美国)，BKgydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}(TFA盐，≥95.0%，HPLC;GenScript),汉堡王gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}(TFA盐，≥95.0%，HPLC;GenScript)和KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}(TFA盐，95.9%，HPLC)。此外，还测定了羟基化BK和KD: HypgydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-KD(≥99%，HPLC, Peptanova, Sandhausen, Germany)gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba-BK(≥99%，HPLC, Peptanova)。[Phe8Ψ(CH-NH)-Arg9]-BK (TFA盐，97.5%，HPLC, Tocris)作为内标。LC-MS /MS平台已根据美国食品及药物管理局的生物分析指引，在血浆及呼吸道灌洗液中成功验证[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]关于精密度、准确度、灵敏度、线性度、基质效应、回收率和稳定性。这两个平台的特点是定量下限(LLOQ)可降至1.9 pM(取决于kinin)。关于测定特性的详细信息已在其他地方发表[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．所有所述的肽浓度均根据盐含量和肽纯度进行校正，参考所进行的氨基酸分析。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

LC-MS /MS数据采集使用Analyst®1.6.2软件(AB Sciex，达姆施塔特，德国)，原始数据评估使用Multiquant™3.0.2 (AB Sciex，达姆施塔特，德国)。使用OriginPro 2021(9.8.0.200)进行统计分析和图形生成。描述性统计(均数±标准差(SD)或中位数[四分位差(IQR)])和盒须图用于描述激肽水平数据。结果采用Mann-Whitney u检验或双侧t检验进行分析。gydF4y2Ba

研究人群gydF4y2Ba

总共有28名志愿者被纳入研究。这些是白色的，中位数为26.5 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)年。其中11名女性，17名男性。成功地从24名受试者中采集了血浆，并从24名受试者中收集了回收率超过30%的NLF样本。所有志愿者的COVID-19抗原检测均为阴性。详细的人口统计数据见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

血浆内源性激肽水平gydF4y2Ba

24名受试者的内源性激肽水平处于极低pM范围，管间变化低于1.7 pM(中位数为0.0[−0.2至0.3]pM)。中位BK水平为0.0[0.0至1.3]pM，最高水平为4.2 pM。LC-MS /MS平台验证的定量下限(LLOQ)以下检测到的kinin水平设为0。其他的激肽水平仍然较低，在很大程度上低于限量;因此，半定量地记录检出限与LLOQ之间的值。对于des-Arg(10)-kallidin，我们从0.2 pM (gydF4y2Ba最低gydF4y2Ba)至下午二时(gydF4y2Ba最大gydF4y2Ba；n = 10)，表示BKgydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}下午四时正(gydF4y2Ba最低gydF4y2Ba)至下午四时三分(gydF4y2Ba最大gydF4y2Ba；n = 5)，对于KD 0.2 pM (gydF4y2Ba最低gydF4y2Ba)至下午7时7分(gydF4y2Ba最大gydF4y2Ba；n = 9)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．没有观察到与性别相关的激肽浓度差异。gydF4y2Ba

此外，在一名男性和一名女性受试者中，这些低内源性水平在全天(上午6点至下午6点)都得到了证实。昼夜节律和激肽水平之间没有发现联系。gydF4y2Ba

应用不适当的采样条件监测血浆中的激肽谱gydF4y2Ba

与内源性BK(中位值322.2 [171.2-425.8]pM)及其代谢产物BK相比，15分钟后延迟添加抑制剂人工改变的样品中Kinin水平显著升高gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}(中位数160.8 [100.7-298.1]pM)， BKgydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}(中位数70.4 [48.9-147.0]pM)， BKgydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}(中位数25.7 [0.0-46.5]pM)和BKgydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}(中位数26.0 [0-44.6]pM)。KD和KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}结果低于他们的限量。人工生成对BK影响最大gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}15分钟后，主要检测到代谢物，代谢物百分比/BK比为47.6%(中位数)gydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}(中位数17.6%)，BKgydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}(中位数5.7%)和BKgydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}(平均3.8%)。虽然男性和女性之间在BK代谢物的相对形成方面没有显著差异，但某些绝对kinin水平存在显著差异。在女性个体中发现了更明显的BK形成(女性:410.9 [317.5-570.1]pM，男性:223 [152.2-401.3]pM，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.038)。而BK的水平gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}和汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}没有因性别而异，但在BK代谢产物的生成中检测到显著的性别特异性差异gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}(女:221.4 [125.2-470.3]pM，男:111.1 [66.5-171.5]pM，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.033)和BKgydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}(女:65.6(37.5 - -292.6),男:36.3(11.6 - -67.7)点,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.035)。gydF4y2Ba

健康志愿者鼻灌洗液中的激肽gydF4y2Ba

10 mL生理盐水鼻腔灌洗的平均回灌量百分率为73.1±11.5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．KD (12.0 [0.0-23.4] pM)和BK (17.7 [3.9-25.3] pM)归一化后回归量NLF中的Kinin水平较低。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．对于BK，羟基化形式近似于非羟基化形式，平均比值为1.6±1.0(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)。羟化KD水平低于非羟化kallidin水平，平均比值为0.37±0.33(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB). kallidin代谢物des-Arg(10)-kallidin的低水平仅在7名志愿者中检测到，导致中位水平为0.0 [0.0 - 6.8]pM。BK浓度较高gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}(82.1 [51.7-173.4] pM)， BKgydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}(50.8 [22.1-153.9] pM)和BKgydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}(220.4 [123.1-422.2] pM)。BK水平gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}低于检测限度。BK的代谢物/BK百分比为604.6%(中位数)gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}， BK为568.1%gydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}， BK为1,396.3%gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}BK为0%gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}．在NLF中评估的任何激肽均未发现显著的性别特异性差异。gydF4y2Ba

估计鼻上皮粘膜液中内源性激肽水平gydF4y2Ba

通过血浆与NLF尿素的相关性分析，估计NLF的样本量。NLF的中位数稀释因子计算为中位数12.3[10.0-19.0]，确定的中位数NELF样本体积为中位数883.6[555.6-1,112.0]µL(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．KD估计内源性激肽水平为80.0 [0.0 - 177.8]pM, Hyp为0.0 [0.0 - 0.0]pMgydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-KD, BK为139.1 [0.0-240.3]pM, Hyp为241.5 [0.0-773.5]pMgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba-BK, 378.1 [230.0-1,024.9] pM为BKgydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}， 729.6 [433.1 - 1812.3] pM为BKgydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}， BK为1,905.4 [1,123.3-5,138.5]pMgydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}．KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}在5名健康志愿者中可量化(80.1 [75.5-109.0]pM, n = 5)，但在大多数受试者中低于LLOQ，导致中位数水平为0.0 [0.0 - 0.0]pM。KD水平更高gydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}在这五个人中，与较高水平的其他激肽无关。NELF水平的BKgydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}没有估计，因为这些低于NLF的检测极限。BK的代谢物/BK百分比中位数为581.2%gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}， BK占731.2%gydF4y2Ba_{1 - 7gydF4y2Ba}， BK为1533.4%gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}BK为0%gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}．没有发现显著的性别差异。gydF4y2Ba

比较血浆和鼻灌洗液中的激肽谱gydF4y2Ba

内源性血浆中kinins水平明显低于内源性NELF水平(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在大多数志愿者的血浆中，只有BK水平可检测到，而其他代谢物则低于定量限制。在NLF和NELF中，BK水平比血浆高13.6 (NLF)和107.0 (NELF)。另外，KD和KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}在NLF和NELF中是可量化的，而在血浆中，这些在样本中很少被检测到。与血浆相比，NLF和NELF中可检测到内源性BK代谢物，与BK一起gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}代表着最丰富的激肽。gydF4y2Ba

在这项研究中，对健康成年志愿者的鼻液和血浆中的kinin谱进行了评估，这一人群通常被用作探索生物标志物的研究的对照组。该研究首次全面测定了9种激肽，并在24个健康成人个体中编译了激肽谱。内源性血浆水平在极低的皮摩尔范围内，内源性NELF水平在高皮摩尔到低纳摩尔范围内。我们发现血浆、NLF或NELF中内源性激肽水平没有显著的性别特异性差异。gydF4y2Ba

到目前为止，已经发表了血浆激肽水平在几个数量级上的分歧。例如，Nussberger等人测量的BK水平为2.2 pM (n = 22)， van den Broek等人发现的BK水平为100.7 nM (n = 6)，健康志愿者的差异约为50,000倍[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．这些相互矛盾的数据妨碍了本研究收集的数据与先前发表的关于激肽的数据进行比较。对内源性激肽水平的可靠研究需要使用合适的抑制剂稳定短寿命激肽，并在样本收集和处理过程中控制由因子xii介导的接触激活人为产生BK [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．本研究采用标准化方案来测量可靠的激肽水平，从而通过评估管间变异性(< 1.7 pM)来确认血液采样和处理过程。在健康志愿者中收集的BK水平数据证实血浆中循环BK水平较低[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．此外，还评估了血浆中六种BK相关肽的综合数据，并增强了血浆中BK代谢物的可用数据[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

迄今为止，只有两项研究发表了NLF中激肽水平的数据。这些研究检测到免疫反应性BK水平在< 18.9-141.5 pM之间[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]和中位数64.2 pM [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]在8名志愿者中。免疫反应性BK的评估不能将BK与KD或其羟基化形式区分开来。相反，在本研究中，对24名志愿者的激肽进行了选择性测量，收集到的BK和KD水平及其羟基化形式的总和与先前测定的免疫反应性BK相匹配[中位数总和:54.1 pM]。然而，NLF浓度并不代表内源性NELF水平。调整血浆和NLF尿素的差异后，首次估计了内源性人NLF的kinin水平，并发现这些水平在10 mL灌洗量下比NLF高12.3个中位因子。总的来说，鼻液中的kinin水平高于血浆，这反映了KKS主要是一个基于组织的系统[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然在血浆或NELF的内源性激肽水平中没有发现显著的性别差异，但在人工改变的血浆样本中发现了显著的差异。这里，在女性体内检测到更明显的BK, BKgydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}和汉堡王gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}．这可能反映了雌激素对KKS的影响:(1)雌激素可增加激肽素和激肽原的形成[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，(2)提高血浆中因子XII的浓度[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba(3)降低ACE活性[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．虽然(1)和(2)可能解释了BK形成的增加，(3)可能是BK退化为BK的增加的原因gydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}和汉堡王gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}作为逸出途径(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外，与男性相比，女性的氨基肽酶P活性更高，这可能是BK体外形成增加的原因gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba}在女性中[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外，本研究不局限于仅测定免疫反应性激肽部分，而是对9种激肽进行了差异评估。这是有利的，有几个原因。首先，体内有许多途径影响激肽的形成和降解，疾病和药物可能对这些途径产生不同的影响。现在可以利用收集到的健康队列中的激肽谱来全面研究这种影响。二是除BK外，其他活性激肽，如KD、BKgydF4y2Ba_{1 - 8gydF4y2Ba}， KDgydF4y2Ba_{1 - 9gydF4y2Ba}它们作用于不同的受体，而这些受体又以疾病特异性的方式受到调控。病理改变与生理性激肽谱的比较可能有助于确定新的治疗靶点。第三，激肽以羟基化和非羟基化两种形式存在[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．激肽BK和KD及其各自的羟基化形式表现出相似的生物活性，但可能以特定疾病的方式被改变[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在临床研究中，健康志愿者经常作为对照组，收集他们的激肽谱有助于研究激肽谱中与疾病相关的改变。例如，研究发现，缺氧通过增加脯氨酸-4-羟基化酶-α1的活性来增加BK的羟基化[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，而COVID-19等疾病可能会诱导激肽的羟基化。现在，通过评估健康个体的参考激肽谱，可以对这一假说和类似假说进行临床研究。gydF4y2Ba

随着科学方法的不断进步，激肽可能在未来发展成为有前途的生物标志物。首次尝试将此方法应用于遗传性血管性水肿患者的血浆水平[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在遗传性血管性水肿伴C1酯酶抑制剂缺乏症缓解时，BK显著增加gydF4y2Ba_{2 - 9gydF4y2Ba},汉堡王gydF4y2Ba_{1 - 5gydF4y2Ba}与健康的群体相比，发现了11种激肽的总和。未来的工作计划进一步阐明在标准化环境中内源性或外源性激肽的代谢和生成，以提高对KKS在遗传性血管性水肿、过敏、脓毒症、癫痫、中风和阿尔茨海默病等疾病发展中的理解[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．以生理谱作为基线对这些病理过程中的激肽谱进行评价，可以更好地了解病理生理，为新的治疗靶点提供证据，并改善对疾病病程的监测。gydF4y2Ba

在本研究中，我们收集了健康成年志愿者的鼻液和血浆中内源性肌肽谱的综合谱，这些内源性肌肽谱可作为临床研究的对照组，探讨肌肽作为生物标志物的价值。虽然我们的受试者循环血浆激肽水平低于4.2 pM，但NELF水平在高皮摩尔到低纳摩尔范围内，这取决于激肽。我们在研究的液体中没有发现性别差异。健康志愿者中全面的kinin谱的知识现在形成了评估血管性水肿、败血症、COVID-19、癫痫和阿尔茨海默病等疾病中kinin谱改变的疾病特异性诊断或预后信息的基础。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

王牌:gydF4y2Ba

血管紧张素转换酶gydF4y2Ba

ACE 2:gydF4y2Ba

血管紧张素转换酶2gydF4y2Ba

应用:gydF4y2Ba

氨肽酶PgydF4y2Ba

B1/2:gydF4y2Ba

缓激肽受体1/2型gydF4y2Ba

汉堡王:gydF4y2Ba

缓激肽gydF4y2Ba

CP:gydF4y2Ba

羧肽酶gydF4y2Ba

民进党四:gydF4y2Ba

Dipeptidylpeptidase四世gydF4y2Ba

ECE:gydF4y2Ba

Endothelin-converting酶gydF4y2Ba

高分子量:gydF4y2Ba

高分子量gydF4y2Ba

高效液相色谱法:gydF4y2Ba

高效液相色谱法gydF4y2Ba

差:gydF4y2Ba

四分位范围gydF4y2Ba

KD:gydF4y2Ba

胰激肽gydF4y2Ba

克鲁舍:gydF4y2Ba

Kallikrein-kinin系统gydF4y2Ba

质/女士:gydF4y2Ba

液相色谱结合串联质谱gydF4y2Ba

LLOQ:gydF4y2Ba

量化的下限gydF4y2Ba

流明瓦:gydF4y2Ba

低分子量gydF4y2Ba

NELF:gydF4y2Ba

鼻上皮内液gydF4y2Ba

棉结:gydF4y2Ba

NeprilysingydF4y2Ba

国家:gydF4y2Ba

鼻灌洗液gydF4y2Ba

遥控配电盘:gydF4y2Ba

Prolyl羧肽酶gydF4y2Ba

老城:gydF4y2Ba

肾素血管紧张素醛固酮系统gydF4y2Ba

RNA:gydF4y2Ba

核糖核酸gydF4y2Ba

SARS-CoV-2:gydF4y2Ba

严重急性呼吸综合征冠状病毒2gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

标准偏差gydF4y2Ba

组织:gydF4y2Ba

三氟乙酸gydF4y2Ba

作者感谢joseph Schultz通过提供Schnozzle®鼻腔冲洗适配器(Splash Medical Devices, LLC, GA, USA)来支持这项研究。gydF4y2Ba

由Projekt DEAL启动和组织的开放获取资金。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 海因里希·海涅大学临床药学与药物治疗研究所Düsseldorf, Universitätsstr。1 40225, Düsseldorf，德国gydF4y2Ba

   Tanja Gangnus, Anke Bartel和Bjoern B. BurckhardtgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

TG和BB设计了研究的概念。TG, BB和AB进行实验。TG对数据进行分析，并撰写了论文的初稿。BB对数据分析提出建议，并对手稿草稿进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaBjoern B. BurckhardtgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》所表达的原则进行的，并得到了海因里希·海涅大学医学院伦理委员会的批准(研究编号:6112)。所有参与者在入组前均给予书面知情同意。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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