扩大基因突变的表型谱LRP2:一种新的非综合征性家族性共同性斜视候选基因

背景

共同性斜视(CS)是一种异质性疾病，是单侧儿童期视力损害的主要因素。研究证实，遗传因素在CS的发展中起着重要作用。本研究的目的是确定非综合征性家族性CS的遗传原因。

方法

这项研究招募了14个不相关的CS家庭。从一个大的四代家族(CS08)中选择12个感染个体和2个未感染个体进行全基因组连锁分析。平行全外显子组测序(WES)在同一家庭(9例患者和1例未受影响的成员)和31例来自其他13个不相关家庭的CS病例中进行。使用Sanger测序来确定是否有任何剩余的变异与相应家族中的疾病表型共分离。

结果

经连锁分析，CS08家族的CS定位于2q22.3-2q32.1染色体上标记D2S151和D2S364之间34.17个centimorgan (cM)的新区域，在D2S142处最大log odds (LOD)评分为3.54 (theta = 0)。平行WES鉴定出一个杂合变异，LRP2c.335一个> G (p.Q112R)，位于与家族疾病完全共分离的连锁区间。此外，另一种新的杂合变体(c.7274A > G, p.D2425G)在LRP2WES在另外2名来自另一个不相关家庭的患者中检测到共隔离。polyphen2、SIFT和MutationTaster预测这两种变异都具有破坏性，在100个种族匹配的正常对照组中均不存在。

结论

LRP2是一种新的非综合征性家族性CS的候选遗传原因。

斜视在临床上被定义为眼睛协调不对准的一种情况，这是儿童的一种主要的眼部异常，通常伴随着对双眼视力、立体视觉和知觉深度的不利影响。流行病学数据表明，在某些人群中患病率约为1-4% [1，2］．视斜视根据不同注视方向上的视偏程度变化，可分为同向性斜视(CS;所有方向不变)和不同时性斜视(各种)。CS是最常见的斜视形式，也是导致儿童期单侧视力损害，特别是弱视的主要因素[2，3.］．此外，斜视即使在没有弱视的情况下也会影响正常的双眼视觉功能，除非治疗成功，否则会影响日常生理和心理表现[4，5］．

CS具有高度异质性，受遗传和环境因素影响，但发病机制尚不清楚[6，7］．基于遗传模式，许多研究采用不同的方法来研究CS的遗传原因。考虑到这种疾病的复杂影响背景和高患病率，最近开展了两项关于斜视的全基因组关联研究TSPAN10(rs6420484和rs397693108)和一个变体方面(rs2244352)可增加斜视的易感性[8，9］．然而，先前的家族、双胞胎和谱系研究已经证实，一些CS家族表现出常染色体显性(AD)或常染色体隐性(AR)的遗传模式[10，11，12］．连锁分析还涉及到几个相关位点，其中最显著的是染色体7p22.1 (STBMS1位点，OMIM: 185100)，在AR和AD模型中均有传播[13，14］．此外，最近在日本人群中发现了另外两个与候选基因相关的易感位点，4q28.3和7q31.2MGST2而且WNT2［15，16］．此外，的变体AHI1而且PAX3全外显子组测序(WES)已在中国家庭中检测到，有助于斜视[17，18］．无论如何，这些研究表明CS可能表现为一种罕见的单基因亚型。

在目前的研究中，我们招募了14个不相关的非综合征cs影响的中国家庭，包括一个大型的四代家庭，CS08。WES和全基因组连锁分析同步进行，以鉴定罕见的杂合变异c.335一个> G (p.Q112R)在LRP2该基因位于相应的连锁区间(2q22.3-2q32.1)，在CS08家族中与疾病共分离。WES还检测到另一个杂合型(c.7274A > G, p.D2425G)LRP2另外两名来自另一个不相关的CS家族的受影响个体(CS06)。

家庭及临床检查

来自14个不相关家庭的47名非综合征性cs患者和18名cs未受影响的兄弟姐妹(1名内斜视，13名外斜视;无花果。1一个和3.a、附加文件2a-l)，包括一个庞大的四代家庭(CS08)，在南京医科大学附属第一医院进行临床随访。根据《赫尔辛基宣言》原则，本研究经南京医科大学附属第一医院伦理委员会(2019-SR-134)批准，并获得参与者和每个孩子父母的书面知情同意，用于样本收集和遗传分析。

在接受任何治疗之前，对可用的参与者进行常规眼部检查，包括视力、裂隙灯生物显微镜检查和眼底检查评估。在距离(5米)和近(0.3米)处进行偏移角，采用盖/盖试验、交替棱镜和盖试验或Krimsky试验(在年轻或不合作的患者中)。使用自动折光计测量屈光不正。对CS08家族先证者进行眼、脑磁共振成像(MRI)检查。使用来自CS08和CS06家族的两个先验者的尿液和血液样本研究肾功能。斜视治疗史的数据，包括既往手术或贴片，均在检查前从参与者本人或通过电话交谈获得。

斜视的定义是在远处或近处出现任何斜视，戴眼镜或不戴眼镜，并根据斜视的主要方向(内斜视、外斜视、垂直斜视)进行分类。斜视可根据凝视不同方向上的偏差程度变化，分为CS(共视性斜视)和不共视性斜视(各种斜视)。如果近距离注视和远距离注视都是恒定的，斜视被认为是恒定的斜视;否则，被认为是间歇性斜视。为尽量减少环境和证候因素的影响，排除符合以下标准的病例[13]:(i)继发性斜视;(ii)任何不同时性斜视;(iii)已知CS危险因素，如早产(< 35周龄)、低出生体重(< 1.8 kg);(iv)剥夺或重症肌无力引起的斜视。

另外还招募了100名无血缘关系、种族匹配、无脑部和眼部疾病的正常对照组。使用TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN, Beijing, China)从外周静脉血(5ml)中分离基因组DNA。

全基因组连锁分析

对最大的家族CS08进行全基因组连锁筛选，包括12例患者(图8)。1一个;II:1, II:8, II:12, III:1, III:6, III:9, III:14, III:17, III:19, IV:1, IV:4和IV:5)和两个未受影响的构件(图。1一个;III:12和IV:3)。此外，利用Fam标记的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了横跨整个人类基因组的366个微卫星标记和3个单核苷酸多态性(SNPs)，间隔约为10 cM (Weber set 6.0)1)．PCR产物根据等位基因大小和标记进行适当的聚合，与GeneScanTM-500 Liz尺寸标准(Applied Biosystems, Foster City, CA)混合，变性，加载到6%标准变性聚丙烯酰胺凝胶上，并使用ABI 3730xl分析仪(Applied Biosystems)进行荧光检测。谱系显示雄性间传播(图。1一个;II:1和III:1)的疾病和几乎相同数量的受影响的男性和女性，表明一种AD遗传模式(图。1a).采用疾病等位基因频率分别为0.0001和0.01，外显率范围分别为80 ~ 100%的AD遗传模型计算多点LOD评分。使用Genemapper 4.1软件包(Applied Biosystems)收集和分析基因分型数据。采用MERLIN程序进行多点联动分析(http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/Merlin/index.html)．家族和单倍型数据使用西里尔文，版本2.1程序生成。

全外显子组测序和Sanger测序

采用9例患者的基因组DNA进行平行WES(图2)。1一个;与连锁筛选相比，不包括III:6、IV:1和IV:5)和1个未受影响的CS08家族成员(III:12)。对来自13个不相关家庭的31名额外患者(14名男性和17名女性，附加文件)的基因组DNA进行WES2)．WES使用SureSelect Human All Exon 50 Mb Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)进行，并在HiSeq 2000平台(Illumina, San Diego, CA)上进行测序。使用CASAVA v1.8.2将Illumina BCL文件转换为FASTQ文件。使用Trimmomatic 0.32版本过滤低质量的底座和适配器[19］．然后，通过Burrows-Wheeler Aligner (BWA-MEM v0.7.15-r1140)将序列读取数据映射到具有默认参数的人类参考序列(GRCh37) [20.］．使用GATK最佳实践管道调用单核苷酸变体(SNVs)和小插入和删除(INDELs) [21］．GATK套件3.5.0版本对基本质量评分重新校准和INDELs周围的局部校准进行了改进。我们使用snpEff (v4.3-3)以群体频率、系统发育保守评分、基因区域和外显子功能标注变异，然后将所有标注的变异加载到GEMINI (v0.19.1) [22］．Sanger测序和家族内共分离分析所有患者共有和未受影响成员不存在的变异。

在硅分析中

采用三种在线突变致病性评价软件进行致病性预测:SIFT (http://sift.jcvi.org/）;PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）;及变异品尝师(http://www.mutationtaster.org/)．利用Ensemble Genome Server数据库BLAST / BLAT Tools对突变残基的进化保守性进行分析，方法是将人类LRP2的蛋白序列与以下同源蛋白序列进行比对:黑猩猩(XP_515882.2),解剖(XP_001104179.2),牛(XP_002685354.2),亩骶(NP_001074557.1),鼠形(NP_110454.1),背带吊裤带(XP_004942820.1),鲐鱼类(NP_001181916.1)。利用SWISS-MODEL在线服务器构建了野生型和突变型LRP2的晶体结构模型。预测结构用PyMol软件(1.5版)显示。

四代家族CS08的特征

CS08家族的谱系如图所示。1a.所有受累个体均表现为斜视表型伴伴外斜视。该家族共招募了12名患者和2名未受影响的个体，包括6名男性和8名女性。先证者(III:19)为一名22岁女性，间歇性外斜视，发生于5岁左右。术前双眼最佳矫正视力(BCVA)为1.0时，斜视为30 PD(近)和25 PD(远)。1b和表1)．屈光不正状态为左眼轻微散光(-1.00 D)。通过裂隙灯生物显微镜和眼底评估，两只眼睛未发现异常(图。1c).眼、脑MRI均显示正常(图。1d-f)。先证者否认有肾脏症状，肾功能检查结果正常。除患者外，III:6右眼持续外斜视;其余11例患者表现为不同程度的间歇性外斜视。所有患者均为正常妊娠分娩。除先证者外，所有患者均无既往治疗史。此外，在任何个体中均未观察到其他综合征特征。该表汇总了该家族的眼部临床资料1．

2号染色体上初步定位致病基因的连锁分析

为了确定CS08家族非综合征性共同性外斜视的遗传原因，我们使用CS08家族(12名患者和2名未受影响的成员)的基因组DNA进行了全基因组连锁扫描。我们计算了CS08家族在0.0001和0.01疾病等位基因频率和外显率在80 - 100%范围内的多点LOD评分。利用优势模型在2q22.3-2q32.1染色体上鉴定出34.17个centimorgan (cM)候选区域与疾病共分离。临界区间两侧为标记物D2S151和D2S364，在疾病等位基因频率为0.01、外显率为100%的模型下，D2S142处LOD评分最大值为3.54 (theta = 0)(图。2a, b，附加文件3.)．单倍型结构如图所示。1一个。

WES和Sanger测序鉴定出一个候选基因

对CS08家族谱系中9个受影响成员和1个未受影响成员的基因组DNA进行平行WES检测。1a).最初共检测到112,804个变异;每个样本的平均深度为188 ×，在98.98%的参考基因组中至少有5 ×覆盖。如附加文件所示4，经生物信息学分析和筛选，仅有1个杂合错义变异LRP2c.335一个> G， (p.Q112R)仍然存在。预测工具(SIFT, polyphen2和MutationTaster)预测这种错义突变是致病的(表2)2)．根据Sanger测序，该变异位于2q22.3-2q32.1的连锁区间内，与该家族疾病完全共分离，对所有14名CS08成员进行了Sanger测序(图2)。1一个,2c).此外，对100个正常对照进行了同一位点的Sanger测序，未见阳性结果。因此，我们认为LRP2可能是该家族CS的致病基因。

检测LRP2另外13个CS家族的突变

以评估遗传贡献的可能性LRP2，我们进一步对其他13个不相关的CS家族的31名受影响成员进行了WES。一种额外的杂合变体(c.7274A > G, p.D2425G)LRP2在CS06家族先证者中检测到。3.a).对所有家族成员(II:4、II:5、II:7、II:8、III:1、III:5、III:8、III:10、III:12、IV:2、IV:3)进行Sanger测序，证实该变异与表型共分离。先证者III:8患有伴发性内斜视，发生在大约2岁时。近斜视量+ 25 PD，远斜视量+ 15 PD;两眼的BCVA均为1.0。3.b).屈光不正状态为左眼中度近视(-2.75 D)。她的儿子(IV:3)， 4岁，同时伴有内斜视，近斜视+ 50 PD(近斜视)，远斜视+ 45 PD(远斜视)。Sanger测序显示从他的母亲(III:8)传播的从头突变存在于他的祖父母(图。3.a、c)。

致病性分析

这两种杂合变异在公共数据库中都不存在或极其罕见，并被SIFT、polyphen2和MutationTaster预测为致病(表2)2)．此外，这两个错义变体(Q112R和D2425G)在不同物种中高度保守(图2)。2d,3.D)，支持的致病性LRP2导致CS的变异。

LRP2的结构组织如图所示。4一个;它由补体型重复序列(CRs)、表皮生长因子(EGF)样重复序列和β-螺旋桨组成。突变Q112R位于一个CR中，D2425G位于两个β-螺旋桨之间;这两种突变都位于细胞外区域。我们使用SWISS-MODEL对突变体LRP2进行晶体结构建模，以预测两种突变引起的致病效应(图2)。4b-g)，发现残基2425与Tyr2434、Tyr2426、Phe2473以及Asn2641之间的氢键随着野生型天冬氨酸向突变型甘氨酸的转变而消失。p.D2425G突变可能影响LRP2的折叠和相关生物学过程。

在本研究中，我们将一个四代人家族中的非综合征性CS映射到染色体2q22.3-2q32.1 (34.17 cM)的连锁区间，最大LOD评分为3.54。此外，一种罕见的杂合变异LRP2(c.335A > G, p.Q112R)位于与家族疾病完全共分离的相应连锁区间，经WES检测。这种误解的变体LRP2c.335A > G在gnomAD中表现出非常低的等位基因频率，为0.00002389，在其他公共数据库中不存在(1000G和TOPmed, Table2)，表明它不是这些数据库所代表的常见的良性多态性。WES还发现了另一种杂合型LRP2(c.7274A > G, p.D2425G)。这两种变体都是高度保守的，在公共数据库中不存在或极其罕见;根据桑格测序，在100个种族匹配的正常对照组中，它们都不存在。通过polyphen2、SIFT和Mutation Taster预测这些突变具有破坏性。这些数据表明LRP2是非综合征家族性CS的新遗传原因。

LRP2位于染色体2q31.1，编码一个巨大的多配体跨膜受体(600 kDa;低密度脂蛋白(LDL)受体基因家族中的一种[23，24］．LRP2/megalin的结构如图所示。4A，由一个大的细胞外结构域、一个单一的跨膜结构域和一个短的细胞质结构域组成。细胞外结构域含有4个富含半胱氨酸的补体型配体结合重复序列，它们由β-螺旋桨和egf样重复序列相互分离。单个跨膜结构域与胞内段相连，细胞质尾部富含多种功能元件。LRP2在哺乳动物的上皮细胞中高度表达，包括肾、脑、眼、肺和生殖组织。它结合了许多与不同信号通路相关的配体，包括Sonic Hedgehog (Shh)、骨形态发生蛋白(BMP)和类视黄醇转运等。23，24，25］．大多数LRP2迄今为止的突变与donnaio - barrow综合征(DBS)相关，也称为面部-眼-声-肾综合征，这是一种罕见的常染色体隐性和多系统疾病，涉及颅面特征、眼部异常、发育迟缓、胼胝体发育不全(ACC)、智力残疾、感音神经性听力损失和蛋白尿[23，26，27，28］．DBS的普遍眼部特征是远视和高度近视;其他如视网膜脱离、虹膜虹膜缺损、进行性视力丧失和视神经发育不全，已在几个病例中提到。此外，突变在LRP2可能导致Stickler综合征和常染色体隐性非综合征性智力障碍[29，30.］．有趣的是，很少有DBS、Stickler综合征和非综合征性智力残疾患者伴有斜视，包括外斜视和内斜视[28，29，30.］．然而，目前尚不清楚这些患者所表现出的斜视是否是由糖尿病引起的主要表型LRP2缺乏症由大脑和/或眼部器官的异常发育和功能引起的缺陷或继发性变化

在我们的研究中，CS08和CS06家族的患者均未出现CS以外的眼部症状或多系统特征。尽管家族内存在表型变异，但在这些DBS患者中经常观察到高度近视，范围从-12.5到-22.0 D，并伴有大眼睛。但先证者III:19屈光不正状态仅为左眼轻微散光(-1.00 D);其他CS08家族的患者也均无DBS的眼部特征。在另一个家庭CS06中，患者III:8及其儿子IV:3屈光状态正常，III:8左眼中度近视。两个家庭成员均无屈光参差。此外，两家系均无特征性颅面特征和大球眼症。常规肾功能检查结果显示两个先证者均无蛋白尿。综上所述，CS08和CS06患者不能被归为DBS。因此，我们假设LRP2可能是原发性斜视的遗传因素;这两个LRP2本研究中的突变与独立的家族性CS表型相关。

多个LRP2-缺陷动物模型表现出频繁的眼大和高度近视，与DBS患者的表型相当，包括纯合和复合杂合状态[31，32，33，34，35］．有趣的是，成年杂合变异鱼的眼睛大小正常，有轻微远视[31，32，33，34，35]，与杂合子携带者的情况相似[28，29，30.］．这些数据可以解释我们的患者没有眼睛肿大、高度近视和全身特征的可能原因。此外，两组患者均未观察到斜视LRP2-缺陷模型(小鼠和斑马鱼)。尽管基因突变导致了各种表型LRP2，上述研究中选择的模型动物(即斑马鱼和小鼠)也是双目视力缺乏或有限的另一种可能解释。在某些情况下，鱼的两只眼睛的放大程度不对称。然而，在我们的研究中，斜视患者中没有屈光参差和大球型眼。因此，不太可能在这些异常之后发生眼部错位。

总的来说，CS的发病机制尚不清楚，各种假说被提出。其中，在发育的早期关键时期，双眼视力可能受到干扰而导致的眼球错位是普遍的[36，37］．正常的双眼视觉依赖于半球间的连接，这种连接由胼胝体(CC)实现，胼胝体是哺乳动物大脑中的主要纤维束[37］．特别是视觉胼胝体连接视觉皮层的同源区域，并将视野的两半结合在一起[37］．对人和猫的大量观察和实验表明，斜视眼通过CC的半球间连接发生了改变[38，39］．值得注意的是，CC是大脑白质的主要前脑来源结构;突变LRP2导致人类ACC(变量)[23，26，27，28，29，30.］．报道的数据证实，在前脑发育过程中，LRP2是SHH信号通路的主要辅助受体，该蛋白的缺陷导致SHH/Patch1/LRP2复合物失效形成，从而影响下游信号通路的激活[24，25，40］．淘汰LRP2基因导致小鼠前脑非分裂畸形[27，31，35］．以上研究的证据强化了这一观点LPR2很可能是调节大脑和眼动网络的重要参与者。

我们的研究有一些局限性。首先，由于患者对功能性MRI和弥散张量的排斥，我们无法确认是否存在通过CC的半球间连接的改变;但先证者脑MRI显示CC结构正常。其次，除CS06和CS08家族外，在另外12个家族中均未检测到候选变异，证实了CS的复杂遗传特征。

综上所述，基于全基因组连锁分析、WES和致病分析，我们将非综合征性CS映射到染色体2q22.3-2q32.1上的一个新位点，并确定了罕见的杂合变异c.335A > G (p.Q112R)和新的杂合变异c.7274A > G， (p.D2425G)LRP2．据我们所知，我们的研究是第一份报告LRP2是非综合征性CS的遗传原因，扩大了LRP2突变。与其他已知的与CS相关的基因相似，LRP2变异只能解释一小部分CS。同时，致病性LRP2非综合征性CS的变异及其相关机制LRP2和CS需要进一步说明。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

CS:

Comitant斜视

韦斯:

Whole-exome测序

cM:

厘摩

LOD:

日志赔率

CS:

Comitant斜视

广告:

常染色体显性

基于“增大化现实”技术:

常染色体隐性

核磁共振成像:

磁共振成像

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

SNVs:

单核苷酸变体

INDELs:

插入和删除

BCVA:

最佳矫正视力

克雷格:

Complement-type重复

表皮生长因子:

表皮生长因子

低密度脂蛋白:

低密度脂蛋白

嘘:

声波刺猬

星展银行:

Donnai-Barrow综合症

ACC:

胼胝体发育不良

D:

测定器

我们非常感谢所有参与这项研究的患者及其家属。

国家自然科学基金(No. 81673198)资助;江苏省自然科学基金(批准号:;BK20161595);江苏省重点人才计划(批准号:;江苏省研究生科研实践创新计划项目(批准号:QNRC2016563);SJCX20_0477)。资助机构在本研究的设计和实施中没有任何作用。

作者指出

1. 王玥、陈雪娟和江涛对本文也有同样的贡献

作者及隶属关系

1. 南京医科大学第一附属医院眼科，中国南京市广州路300号，210029

   王玥，陈雪娟，赵安迪，李锐，王紫金，刘虎

2. 南京医科大学公共卫生学院全球卫生中心流行病学教研室，南京

   王玥，陈雪娟，姜涛，顾亚云，袁文文，胡志斌

3. 南京医科大学生殖医学国家重点实验室，南京龙绵路101号，南京211166

   王玥，陈雪娟，姜涛，顾亚云，胡志斌

4. 无锡市儿童医院眼科，中国无锡

   Xiaohan张

贡献

HL, ZH和XC设计了这项研究。XC、YW、XZ、AZ、RL、ZW收集患者资料并进行临床评估。TJ, YG和WY分析了数据。YW, XZ和AZ进行实验。XC, YW和TJ撰写了手稿。HL和ZH负责研究督导。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Zhibin胡或胡刘．

伦理批准并同意参与

本研究由南京医科大学附属第一医院伦理委员会(2019-SR-134)根据《赫尔辛基宣言》原则批准。在入组前，从所有参与者或其法定监护人处获得书面知情内容。

发表同意书

是的。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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