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6个剪接位点变异，其中3个是新的，在ABO基因中发生在9个ABO亚型个体中

转化医学杂志体积19，文章号:470（2021）引用本文

摘要

背景

核苷酸突变土著居民的基因可降低糖基转移酶活性，导致红细胞中A或B抗原表达水平降低。根据红细胞免疫遗传学数据库和国际输血学会的血型术语，已经确定了6个已知的剪接位点。在这里，我们描述了ABO亚型个体中6种不同的剪接位点变体。

方法

采用常规血清学方法检测ABO表型。采用基于聚合酶链反应序列的分型方法对其整个编码序列进行了检测土著居民的基因。的土著居民的利用等位基因特异性引物扩增或克隆技术研究基因单倍型。在硅分析工具被用来评估功能的影响剪接地点的变化。

结果

六种不同的变体土著居民的在9个ABO亚型个体中鉴定出基因剪接位点，包括C .28 + 1_2delGT、C .28 + 5G > A、C .28 + 5G > C、C .155 + 5G > A、C .204- 1g > A和C .374 + 5G > A。c.28 + 1_2delGT在AwB中检出C .28 + 5G > A、C .28 + 5G > C、C .204- 1g > A埃尔个人。c.155 + 5G > A检测到一个B3.和两个AB3.而c.374 + 5G > A在两个A中被鉴定出来埃尔个人。三种新的剪接位点变体(C .28 + 1_2delGT, C .28 + 5G > A和C .28 + 5G > C)土著居民的发现基因，均导致抗原低表达。硅晶分析显示，所有的变体都有可能改变剪接转录本。

结论

三种新颖的剪接位点变异土著居民的基因在中国个体中被发现，导致A或B抗原表达降低，形成ABO亚型。

背景

Karl Landsteiner于1900年发现ABO血型系统，在输血和器官移植方面具有重要的临床意义[1];此外，它对研究许多人类疾病的发展也很重要[2，3.，4］．ABO血型不合可导致输血时严重的溶血反应和新生儿溶血病[5，6］．

的土著居民的基因位于9号染色体上;其全长序列约24.9 kb，编码区由7个外显子组成，分别具有28、70、57、48、36、135和691个核苷酸碱基对[7，8］．五个土著居民的血型等位基因，包括Abo * a1.01, Abo * a1.02, Abo * b。01、ABO血型* O.01.01而且ABO血型* O.01.02,在中国汉族人口中很常见[9］．的土著居民的基因编码糖基转移酶A (GTA)或糖基转移酶B (GTB)，它们分别催化红细胞上A或B抗原的形成[8］．然而，只有7个核苷酸之间的变化ABO血型* A1.01而且ABO血型* B.01编码序列(CDS)区域的等位基因，导致GTA和GTB之间的四个氨基酸改变[8，10］．

虽然ABO血型系统由A、B、O和AB四种表型组成，但ABO表型的分布在不同人群和地区有所不同[9］．此外，已在人群中鉴定出一些ABO表型亚型，由于抗原和/或抗体表达减少，这些亚型在正向和反向ABO分型中经常表现出差异[9，11，12］．的变化土著居民的基因可能影响糖基转移酶的活性和/或特异性，导致ABO亚型的形成。根据国际输血学会(ISBT)红细胞免疫遗传学和血型术语的ABO血型等位基因名称数据库(v1.1)，在世界各地人群中发现了5个Aweak或Ael的剪接位点和1个B3的剪接位点。在这项研究中，我们描述了六种不同的剪接位点变体ABO基因在ABO亚型个体中的表达。

材料与方法

研究标本

ABO亚型的个体要么是献血者，要么是患者。所有标本均在患者知情同意后获得。本研究获得中国浙江省血液中心伦理委员会的批准。这些标本的差异是在常规ABO血型分型过程中发现的。标本置于含EDTA抗凝剂或不含EDTA抗凝剂的试管中，送浙江省血液中心免疫血液学参考实验室进行进一步分析。

血清学测试

采用常规血清学方法检测A、B、H抗原以及抗A、抗B抗体[13，14］．从,从1使用抗b、抗ab、抗h抗体试剂(上海血液生物技术有限公司，中国上海)。A组、B组和O组的红细胞是在实验室中随机使用三名同类型献血者的新鲜血液制备的。

土著居民的基因全外显子测序分析

根据我们之前的报道，我们使用聚合酶链反应序列分型(PCR-SBT)技术分析了该病毒的整个CDS土著居民的基因(9，13，14］．三组引物被用来扩增的所有外显子土著居民的基因。扩增子被纯化，随后使用ABI 3730测序仪进行测序和分析(应用生物系统公司，福斯特城，CA，美国)。使用SeqScape v2.5软件(Applied Biosystems)对测序数据进行评估。的土著居民的从GenBank中获得基因参考序列(ID号NG_006669.2)土著居民的根据核苷酸多态性确定基因型。的土著居民的等位基因是根据ISBT红细胞免疫遗传学和血型术语指南提名的[15］．

土著居民的用NGS进行基因序列分析

的开始密码子到停止密码子的序列土著居民的基因分析采用下一代测序(NGS)。首先,土著居民的用两对引物扩增基因序列。在第一对引物中，正向引物序列为5'GCGCCGTCCCTTCCTAGCAG 3 '和5'AGCCACCAACTTCCCCTAGT3 '。第二对引物序列为5'TACTCACCTATTATTGGCCTTTGGTT3 '和5'TAGGCTTCAGTTACTCACAACAGGAC3 '。扩增子的预期长度分别约为12763 bp和7250 bp。每个PCR扩增反应总体积为25 μL，包括5 × GLX PCR缓冲液5 μL(中国大连Takara生物公司)，dNTP浓度200 μmol/L，引物浓度0.2 μmol/L, GLX Taq酶0.625 U (Takara生物公司)，DNA样品2.5 μL。扩增在ABI PCR 9700仪器(Applied Biosystems)上进行。PCR扩增条件为94℃预变性1 min, 98℃变性10 s, 68℃退火10 min，循环30次，68℃扩增10 min。扩增物用Tn5转位酶酶切，添加指标，使用Illumina公司(transngs, Beijing, China)的Tn5 DNA文库准备试剂盒构建文库。所有程序都严格按照制造商的说明进行。文库质量合格后，使用Illumina MiSeq测序试剂盒(V2, 300个循环，Illumina公司，San Diego, CA, USA)在Illumina MiSeq测序仪上检测序列。测序数据分析使用土著居民的参考序列(GenBank ID号NG_006669.2用于基因组，NM_020469.2用于转录本)和CLC主工作台12.0软件(Qiagen公司，Hilden, Germany)，记录并分析所有多态性核苷酸。

分析土著居民的基因单体型

利用等位基因特异性引物扩增测序或克隆技术对其进行单倍型土著居民的基因(9，13］．对于等位基因特异性引物扩增(标本ID号4至9)，特异性引物为A、B而且O等位基因被用来扩增相应的等位基因，然后扩增子进行测序和分析，如先前报道的那样[9，13］．克隆技术(标本ID为1 - 3)，PCR-SBT扩增子与pcr - 4连接@TOPO质粒载体按照厂家说明书，转染到活性细胞中生长。如前所述，质粒DNA被提取作为测序分析的模板[9，13］．

在硅拼接转录本分析中

Alamut®软件v2.10与四种剪接位点预测工具(SpliceSite Finder-like, MaxEntScan, NNSPLICE和GeneSplicer)一起使用，预测这些剪接位点变化的影响(www.interactive-biosoftware.com/doc/alamut-visual/2.6/splicing.html) [16，17，18］．伯克利果蝇基因组计划搜索剪接位点预测软件和NetGene2-2.42软件也被用于预测潜在的剪接转录物[19，20.］．使用剪接位点评分计算器来评估本构和隐性受体剪接位点的强度。在至少两种算法中拼接点信号的变化≥10%被认为对拼接有影响[21］．

结果

ABO亚型的表型

研究了9名ABO血型分型不一致的中国个体。其中4人是献血者，其余是患者。表格1显示这些个体的红细胞与抗a，抗a的凝集反应状态1，抗B，抗ab，抗h，以及含有已知A, B, O组rbc的血清。所有红细胞均表现出3 +或4 +强度的抗- h凝集。在吸收和洗脱试验中，B抗原在ID号2、3和7的标本中表达，而A抗原在ID号8和9的标本中表达。ID为4、5和6的个体具有混合场凝集。这些个体根据血清学特征被分类为ABO亚型(表1)，其中3人属亚类型A, 6人属亚类型B。

表1 ABO亚型样本的血清学和基因型结果
全尺寸表

分析土著居民的基因CDS区

全外显子的所有核苷酸土著居民的9个个体的基因测序结果显示，CDS区未见变异。表格1显示了土著居民的基于所有外显子序列的个体基因型。对9个个体的外显子和内含子剪接受体/供体位点的进一步序列分析显示，在c.28 + 1_2、c.28 + 5、c.155 + 5、c.204-1和c.374 + 5位点有6个不同的杂合子1:图S1)。

土著居民的用NGS进行基因序列分析

额外的文件2表S1列出了这些ABO亚型(ID编号3到8)的166个多态核苷酸土著居民的GenBank数据库中的基因序列(NG_006669.2为基因组，NM_020469.2为转录本)(序列中起始密码子和终止密码子之间的序列)土著居民的基因)。ID号为1、2和9的标本未使用NGS方法进行分析。除了与PCR-SBT一致的剪接受体/供体位点外，NGS方法未观察到任何变化。

的土著居民的基因单体型

单倍型分析显示ABO亚型中有6个不同的剪接位点变异，包括C .28 + 1_2delGT, C .28 + 5G > A, C .28 + 5G > C, C .155 + 5G > A, C .204- 1g > A和C .374 + 5G > A(附加文件1:图S2)。3个ABO亚型个体鉴定出C .155 + 5G > A, 2个ABO亚型个体鉴定出C .374 + 5G > A, 1个ABO亚型个体鉴定出C .28 + 1_2delGT, C .28 + 5G b> A, C .28 + 5G > C, C .204- 1g > A变体。所有变体的序列提交到GenBank数据库，表中列出了核苷酸序列和登录号2．

表2不同工具硅分析中不同类型的拼接概率
全尺寸表

在gnomAD v2.1.1和dbSNP数据库中搜索这些子类型中的变体，发现c.155 + 5G > A (NC_000009.11:g。136136716C > T, GRCh37), c.204-1G > A (NC_000009.11:g.136133523C > A) and c.374 + 5G > A (NC_000009.11:g.136132791C > T) existed in these databases with frequencies of 0.0009%, 0.0008%, and 0.0004%, respectively. However, c.28 + 1_2delGT (NC_000009.11: g.136150576_77delCA), c.28 + 5G > A (NC_000009.11: g.136150573C > T), and c.28 + 5G > C (NC_000009.11: g.136150573C > G) were identified for the first time in the ABO subtypes (Table2）.

在硅预测中评估剪接位点变异的功能含义

表格2显示了使用SpliceSite Finder-like, MaxEntScan, NNSPLICE和GeneSplicer工具的变体的剪接位点信号的变化。所有变体都有影响剪接转录本的概率(概率大于0.99)。伯克利果蝇基因组计划搜索剪接位点预测软件在C .28 + 1_2delGT、C .28 + 5G > C和C .28 + 5G > A变体中确定了40多个新的供体位点。该程序确定了距离外显子1最近的两个供体位点c.28 + 168 (cgggcagGTGggctc)和c.28 + 267 (ggtcctgGTGagagc)，得分分别为0.40和0.93。NetGene2-2.42软件预测c.28 + 267 (ggtcctgGTGagagc)作为捐赠站点，而不是c.28 + 168。

在使用伯克利果蝇基因组计划搜索剪接位点预测软件的硅内分析中，在c.155 + 5G > A、c.204-1G > A和c.374 + 5G > A变体中预测了几个新的剪接位点。一些新的供体位点预测为c.155 + 507 (acataagGTAggagg)，得分为0.95,c.374 + 840 (ctccttaGTAagagg)，得分为0.51。预测其中一个新的受体位点位于c.204-224位点(ctcttgccAG)Tttgtaag)，得分为0.84。然而，由于剪接位点的变化，一些额外的剪接体可能由于先验体的rbc而产生部分功能转移酶。

讨论

常见的ABO亚型为A型3.,一个x,一个埃尔B3.BxB埃尔B米， B(A)， cisAB等。Seltsam A等报道了BW表型是由ccaat结合因子/NF-Y增强子区域的变异引起的土著居民的基因(22］．萨诺R首次证明，删除土著居民的基因的红系细胞特异性调控元件可下调转录B(米)等位基因(23］．众多土著居民的迄今为止，在ABO亚型的个体中已经发现了变异[24，25，26，27，28，29］．这些变体土著居民的基因位于CDS区、内含子1红系特异性调控元件区、剪接位点、启动子、顺式或反式调控元件等。Kronstein-Wiedemann R等人发现miR-331-3p和miR-1908-5p直接靶向GTA和GTB的mRNA，这些mirna在造血干细胞中过表达可能导致a抗原的表达显著降低[30.］．的剪接位点的一些变化土著居民的基因与一些ABO亚型相关。Chen DP等报道了B3个体中c.155 + 5G > A (IVS3 + 5G > A)和Ael个体中c.374 + 5G > A (IVS6 + 5G > A)31，32．从理论上讲，变化土著居民的基因剪接位点导致新的RNA剪接位点的形成，因此ABO mRNA的新版本。

中国人群ABO亚型患病率较高[13，14］．在我们的研究中，我们经常分析土著居民的利用PCR-SBT技术检测ABO亚型红系细胞特异性调控元件区序列。我们从ABO亚型中发现了50多个新的等位基因[9，13，33］．在这项研究中，六种不同的剪接位点变异土著居民的基因在9个ABO亚型个体中被鉴定出来。2015年至2019年，我们实验室使用血清学和分子方法相结合的方法筛查并获得了369例疑似ABO亚型的标本。

RT-PCR在正常ABO表型中检测到多种ABO mRNA形式，其中大多数缺乏外显子6 [34，35］．然而，在一些ABO亚型的个体中，RNA剪接的土著居民的检测基因[31，32，36，37］．在第5外显子中缺失4 bp的ABO* a1样等位基因(c.236-239delCGTG)和内含子5中下游缺失20 bp的ABO* a1样等位基因影响了供体剪接位点[36］．外显子1中的c.28G > A通过其对弱B亚型的影响而与弱B亚型相关土著居民的基因RNA剪接[37］．此前，在B3个体中发现了c.155 + 5G > A [31］．在B3个体中至少鉴定出7种不同类型的剪接转录本[31］．虽然可以生成不匹配外显子3片段的mRNA，但102个mRNA克隆中只有一个包含外显子3缺失剪接变体，这表明发生了进一步的可变剪接[31］．c.374 + 5G >最初在ABO血型* A1.01等位基因在Ael个体，目前被称为ABO血型* AEL.04等位基因，预测在没有外显子6或外显子5到6的情况下产生转录本32．至少有10种不同的剪接转录本类型被鉴定ABO血型* AEL.04个人(31］．然而，这项研究发现了c.374 + 5G > a变异ABO血型* A1.02等位基因。

Hwang DY等人发现，IVS1 + 2 T > C存在于该基因的内含子1中CYP17A1基因可能导致隐式剪接，剪接转录本包含在外显子1中[38］．在本研究中，C .28 + 1_2delGT, C .28 + 5G > A和C .28 + 5G > C的变异土著居民的该基因位于外显子/内含子1边界。我们假设这些变异会损害相邻的内含子剪接，并诱导外显子1内一些隐剪接供体位点的交替激活，导致异常的mRNA剪接。最接近外显子1的一个预测剪接位点可以产生额外89个氨基酸的蛋白质。此外，Kominato Y等人在黄斑牛的上游基因组序列中发现了替代外显子1a土著居民的基因(34］．因此，在C .28 + 1_2delGT、C .28 + 5G > a和C .28 + 5G > C变异个体中，可选择的剪接转录本可能从外显子1a开始。这种可能性需要在后续研究中进一步证实。

替代的3 '或5 '剪接位点已被证明能够跳过转录本中的外显子[39］．在计算机预测中，c.155 + 5G > A、c.204-1G > A和c.374 + 5G > A变体应分别产生跳过外显子3、5和6的新转录本。由于缺乏相应的外显子序列或形成新的剪接体，糖基转移酶的氨基酸序列发生变化，影响催化活性。缺失外显子3或5的剪接转录本预计会在n端产生19个或12个氨基酸的功能性糖基转移酶，而缺失外显子6的剪接转录本则会导致过早终止密码子，形成一个只有79个氨基酸残基的新的过早糖基转移酶。根据先证物的血清学结果，某些替代剪接体会产生功能性转移酶，作为先证物红细胞中a或B抗原表达的结果。

在本研究中，我们预测了硅片中剪接位点变化的剪接转录本;然而，使用不同的方法发现了不同的剪接转录本预测结果。c.155 + 5G > A变异在NNSPLICE工具中得分为0.97 ~ 0.19，在GeneSplicer工具中得分为9.02 ~ 2.59，变化率不同。因此，应该同时使用多种工具来预测功能变化。在正常表型中，是多重的土著居民的可在外周血白细胞中检测到mRNA形式[35］．然而，由于缺少新鲜血液样本，土著居民的我们没有分析这些变异个体的mrna，在我们的研究中也没有检测它们的体外功能。未来需要进一步的研究来确定的实际状况土著居民的存在剪接位点变异的mRNA转录。

结论

在这项研究中，我们确定了六种不同的土著居民的ABO亚型个体的基因剪接位点变异，包括三种新变异，C. 28 + 1_2delGT, C. 28 + 5G > A和C. 28 + 5G > C。此外，在硅分析被用来估计剪接位点变异的潜在剪接转录本。我们发现剪接位点的变异土著居民的基因影响剪接转录，导致A或B抗原表达降低和ABO亚型的形成。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。

缩写

侠盗猎车手:

糖基转移酶的

GTB:

糖基转移酶B

PCR-SBT:

聚合酶链反应序列分型

红细胞表面:

红细胞

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下载参考

确认

为了将官方的ISBT等位基因编号分配给新等位基因，我们于2021年9月24日联系了Martin L. Olsson。奥尔森博士建议我们获取等位基因的GenBank号码，这样当ISBT的新数据库启动并运行时，它们就可以注册。

资金

国家自然科学基金项目(82070195、81902137)、浙江省卫生厅科研基金项目(WKJ-ZJ-1920、2018RC029)、浙江省高层次创新型卫生人才培养计划项目资助。

作者信息

作者及隶属关系

  1. 中华人民共和国浙江省杭州市建业路789号浙江省血液中心，邮编30052

    洪晓珍，应燕玲，张晶晶，陈舒，许先国，何吉，朱发明

  2. 浙江省血液安全研究重点实验室，浙江杭州310052

    洪晓珍，应燕玲，张晶晶，陈舒，许先国，何吉，朱发明

作者
  1. Xiaozhen香港
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  2. 陵应
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  3. 晶晶张
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  4. 陈蜀
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  5. Xianguo徐
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  6. 记他
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  7. 法明朱
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贡献

构思和设计研究:XH, JH, FZ。收集数据并进行研究:XH, YY, SC, JZ。分析数据:YY, XX。对结果进行解释并起草论文:XH, FZ。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到法明朱．

道德声明

伦理认可和同意参与

该研究得到了浙江省血液中心伦理委员会的批准。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

额外的信息

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

补充信息

附加文件1:图S1

．ABO亚型个体中剪接位点的杂合序列。箭头表示ABO基因的杂合变异。图S2．ABO基因单倍体分析后剪接位点的变异序列。箭头表示变化位置。

附加文件1:表S1

．NGS法测定ID号为3 ~ 8的标本ABO基因多态性。

权利和权限

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

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引用本文

洪X，颖Y，张J。et al。6个剪接位点变异，其中3个是新的，在ABO基因中发生在9个ABO亚型个体中。翻译医学杂志19， 470(2021)。https://doi.org/10.1186/s12967-021-03141-5

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关键字

  • ABO血型亚型
  • 拼接的网站
  • 变异
  • 聚合酶链反应序列分型

转化医学杂志

ISSN: 1479 - 5876

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