CAR-T细胞治疗HER2的上下文重编程gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba癌症gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

嵌合抗原受体(CAR)工程T细胞过继移植联合检查点抑制可能预防T细胞衰竭并改善临床结果。然而，这种方法受到累积成本和毒性的限制。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

为了克服这一缺陷，我们创建了一种CAR-T (RB-340-1)，它将两种模式结合在一个产品中:CRISPR干扰(CRISPRi)电路防止抗原相遇时程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)的表达。rb - 440 -1被设计用于表达一种抗人表皮生长因子受体2 (HER2) CAR单链可变片段(scFv)，其中CD28和CD3ζ共刺激域与烟草刻蚀病毒(TEV)蛋白酶相连，以及一种靶向PD-1转录起始位点(TSS)的单一引导RNA (sgRNA)。第二种结构包括通过tev可切割序列(TCS)融合到核酸酶失活的spCas9 (dCas9)- kruppel相关盒(KRAB)的T细胞激活连接子(LAT)。抗原相遇时，LAT-dCas9-KRAB (LdCK)复合体被TEV切割，允许dCas9-KRAB靶向PD-1基因TSS。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现RB-340-1始终表现出较高的稳态细胞因子产量，增强CAR-T细胞的体外扩增，延长体内持久性和更有效地抑制HER2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba发都口咽癌的生长与各自的常规CAR-T细胞产物相比。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

作为CRISPRi在临床相关产品上的首次应用，具有条件性、非基因编辑和可逆抑制的RB-340-1促进了CAR-T细胞对检查点抑制的恢复力，以及它们对her2表达癌异种移植的持久性和有效性。gydF4y2Ba

过继细胞治疗(ACT)的成功取决于T细胞的持久性和移植物[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．活化T细胞表达共抑制受体，包括程序性细胞死亡蛋白-1 (PD-1)，这限制了它们在体内的持久性，并产生较低的临床效益[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．将PD-1阻断剂和ACT与嵌合抗原受体(CAR)工程T细胞联合使用可延长持久性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．然而，这种策略受到累积成本和系统性毒性的限制。新的方法着眼于单一的ACT产品，具有多种功能，包括CAR-T细胞的细胞因子或促炎因子的组成性分泌[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]， CAR-T细胞靶向递送抗pd -1单链可变片段(scFv) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]或通过聚簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)技术永久敲除PD-1基因[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．最近，Lynn等人。[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]提出过表达c-Jun可抑制PD-1等检查点，从而增强T细胞持久性，提高抗肿瘤疗效。然而，这些构成性方法导致DNA结构的永久性改变，并增加了由条件系统预防的肿瘤转化的风险，在条件系统中，基因表达以上下文依赖的方式调节，而不会导致DNA结构的永久性改变。gydF4y2Ba

我们之前描述了一种基于核酸酶失活的crispr相关(dCas9)蛋白的非编辑基因表达调控策略，它为rna引导的DNA靶向提供了一个平台[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．dCas9与效应域的融合使哺乳动物细胞的转录受到有效的抑制或激活，传递位点由共表达的单一引导RNA (sgRNA)决定。将dCas9偶联到一个转录抑制因子，Kruppel-associated box domain (KRAB)可以抑制多个内源性基因的表达。RNA-seq分析表明，CRISPR干扰(CRISPRi)介导的转录抑制具有高度特异性[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．随后，我们描述了一种策略，通过g蛋白偶联受体/配体传感将CRISPR-dCas9基因组调控与自然或合成的细胞外信号耦合，以响应一系列合成化合物、趋化因子、有丝分裂原、脂肪酸和激素[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在这里，我们提出了b -340-1，作为一种多功能T细胞产品，将抗人表皮生长因子受体2 (HER2) CAR信号与crispr介导的PD-1基因抑制结合，以延长CAR-T细胞的持久性并提高治疗效果。RB-340-1始终表现出更高的稳态细胞因子产量，增强CAR-T细胞的体外扩增，延长体内持久性和更有效地抑制HER2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba发都口咽癌的生长与各自的常规CAR-T细胞产物相比。gydF4y2Ba

RB-340-1暴露于HER2后有条件地阻止PD-1的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba并显示出比传统CAR-T细胞更好的体外扩增gydF4y2Ba

RB-340-1包括两种慢病毒结构(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．第一种(HER2-TEV)编码抗her2 (4D5克隆)[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba] scFv结合CD28和CD3ζ共刺激结构域，烟草刻蚀病毒(TEV)蛋白酶和一个靶向内源性PD-1基因(PD-1sg)转录起始位点(TSS)的sgRNA。第二种结构(LdCK)编码T细胞激活的连接子(LAT)，通过tev可切割序列(TCS)与dCas9-KRAB融合。CAR的激活使TEV进一步接近LdCK，通过核定位序列(NLS)释放dCas9-KRAB进行核易位，并有条件地抢先表达PD-1(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB, C). RB-340-1还包含用于评估转导效率和分类各自细胞群的细胞外标记:截断的神经生长因子受体(tNGFR)与HER2-TEV相连，Q8是CD34的一个16残基序列，与CD8柄相连，是LdCK的一部分[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．tNGFR的表达与抗曲妥珠单抗(抗4D5表位独特型)抗体FAB95471R-100G的HER2 CAR表达平行(研发系统，附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1A)。Q8的表达是LdCK表达的代表，因为它遵循类似的动力学(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1B)。这种间接评估是不可避免的，因为据我们所知，没有可靠的细胞内染色方法可用。在早期评估该方法可行性的先导实验中，也使用了绿色荧光蛋白(GFP)和mCherry (mChr) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．制造工作流程显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1C。gydF4y2Ba

RB-340-1有条件表达LdCK。选择伸长因子1α (EF1α)是因为初步实验表明，在原代人T细胞中，该启动子在CAR刺激后产生了LdCK表达的最大倍数增加。值得注意的是，尽管EF1α在细胞代谢的稳定状态下起着组成性启动子的作用，但其效率取决于转录机制的激活状态，而当T细胞从休眠状态转变为抗原诱导的激活状态时，转录机制又会发生剧烈变化。gydF4y2Ba

在同一启动子下，HER2-TEV (tNGFRgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞)表现为构成性表达，LdCK (Q8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞)表达依赖于HER2-TEV刺激(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1B;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).这种差异是由于较短的HER2-TEV结构的转录效率更高，在T细胞激活的基线条件下饱和表达。诱导率呈时间依赖性，在刺激后第3天达到峰值，之后逐渐下降。此外，当用涂有HER2蛋白外膜的珠粒刺激RB-340-1时，我们观察到LdCK的密度依赖性诱导。这是由于通过CAR/抗原接合更强的刺激，也可以通过记录CD69和PD-1在不同密度的HER2 CAR- t细胞中的诱导看到gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2A)。重要的是，珠子与HER2 CAR-T细胞的比例决定了两种激活标记的表达，强调了总体抗原暴露和密度调节激活的原则。gydF4y2Ba

将RB-340-1与传统的HER2 CAR- t细胞(HER2 CAR)进行比较，该细胞含有RB-340-1 HER2- tev衍生物和对照cRB-340-1(与RB-340-1相同，除了PD-1sg)。CAR-T细胞在体外和体内测试抗HER2gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFaDu口咽癌细胞被设计成组成性表达程序性细胞死亡配体-1 (PD-L1)，以稳定PD-1/PD-L1相互作用(以下简称FaDu)。在gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究中，HER2 CAR和cRB-340-1 CAR- t细胞也与atezolizumab联合使用(5 mg/kg静脉注射，每周两次)。gydF4y2Ba

与对照组相比，当暴露于FaDu细胞时，rbc -340-1显著地抢占了PD-1的上调，并显著地增强了白细胞介素(IL)-2的分泌和CAR-T细胞的扩增(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)后者在刺激后6天变得明显(图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaC).这与PD-1主要调节增殖/存活和防止衰竭的概念一致[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．与常规HER2 CAR相比，对照cRB-340-1在1:20效应靶比(E:T)下显示出更高的IL-2产量(p值= 0.001)和增强的T细胞扩增(p值< 0.01)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。这可能是由于LdCK结构特有的LAT的过表达，已知LAT本身可以增强T细胞的活化和持久性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，与RB-340-1相比，这些差异较小。细胞毒活性在RB-340-1与对照组之间没有显著差异，IFN-γ释放仅优于cRB-340-1，而RB-340-1与常规HER2 CAR和cRB-340-1相比，肿瘤坏死因子(TNF)-α释放增强(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。gydF4y2Ba

RB-340-1包括CD4的混合物gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在选择和OKT3/CD28刺激后集体转导(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2B)。在转导后10天的体内给药时，最终产物始终包含较大比例的CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(大多数情况下为60-70%)。为了研究两个种群的功能属性，我们在体外比较了在不同CD4时混合的每种成分的细胞毒活性和存活率gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba并暴露于FaDu细胞3天(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2B)。两个亚群表现出相同的细胞毒活性。然而,CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba所有CAR-T细胞产物中的T细胞均表现出较高的持久性。gydF4y2Ba

如其他系统所述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]， CRISPRi基因靶向是特异性的，可以多路复用。PD-1sg或t细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域-3 sgRNA (TIM-3sg)的CAR-TEV构建物分别特异性地阻止了FaDu细胞刺激后PD-1和TIM-3的上调。只有将两者组合在一个CAR-TEV中才能抑制两个检查点(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2C)。动力学实验证明RB-340-1抑制PD-1是持久和特异性的(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2D)。gydF4y2Ba

在衰竭试验中，RB-340-1部分抑制检查点的表达，增强增殖和白细胞介素-2的产生gydF4y2Ba

RB-340-1和cRB-340-1细胞每4天暴露于FaDu细胞4轮(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)，并比较PD-1、TIM-3和LAG-3在基线或刺激条件下的表达(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB, C)。在反复暴露于FaDu刺激下，RB-340-1中所有三个检查点的表达都被显著阻止(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S2)表明PD-1抑制对T细胞的功能影响超出了其特异性调控。的确，T细胞增殖和IL-2分泌在实验的早期阶段也得到了增强，但在反复刺激后，这种效果消退(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE)表明未来可以寻求进一步改善针对T细胞分化/成熟调控因子的T细胞适应度[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

瘤内或全身给药后，RB-340-1在体内比传统CAR-T细胞表现更好gydF4y2Ba

在nod - sic - il2r γ皮下植入FaDu异种移植物后，对RB-340-1和相应对照进行体内检测gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba(NSG)老鼠。最初，每只小鼠瘤内注射了30万个(M) CAR-T细胞，以避免与系统捕获和低效运输相关的扰动[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与对照组相比，RB-340-1表现出更强的肿瘤生长抑制作用，并延长了小鼠的生存期(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA、B;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3为研究设计和附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S3)。在随后的实验中，两种CAR-T细胞剂量被测试为单一给药:每只小鼠0.1或0.25 M CAR-T细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:研究设计图S4)。RB-340-1比HER2 CAR或cRB-340-1更有效地抑制肿瘤生长。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC, D)。与0.25 M的HER2 CAR和cRB-340-1相比，肿瘤生长的减少导致生存期显著延长(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaE)和0.1 M剂量(图;gydF4y2Ba4gydF4y2BaF). RB-340-1对肿瘤生长和动物生存的影响与系统给药atezolizumab联合cRB-340-1在0.25 M和0.1 M剂量下相似。与治疗无关，尸检时肿瘤中残留的CAR-T细胞仅为CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaG)在这个免疫缺陷模型中CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞得益于一种内在的生存优势。重要的是，在具有0.25 M和0.1 M CAR-T细胞的动物中，RB-340-1组和cRB-340-1 + atezolizumab组中CAR-T细胞对肿瘤的定植更大。gydF4y2Ba4gydF4y2BaH)。gydF4y2Ba

初步滴定表明，静脉注射CAR-T细胞的数量要比瘤内注射高10倍才能获得与瘤内注射相当的结果。因此，每只小鼠给予1或3 M CAR-T细胞(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5A, B为研究设计)。在1 M剂量下，RB-340-1的表现明显优于其他所有处理(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA, B)。在ACT治疗后29天，对照组的大量小鼠开始死亡，而与所有其他组相比，RB-340-1组的存活时间显著延长(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC, D;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S4)。在3m剂量下(图;gydF4y2Ba5gydF4y2BaE)， RB-340-1的结果保持一致，而其他实验组在1 M剂量下的表现优于各自的表现。这在HER2 CAR和cRB-340-1联合atezolizumab时尤其明显，其在该剂量下的表现与RB-340-1相似，但在1m剂量下表现更差(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaF).正如瘤内给药所注意到的，系统治疗的RB-340-1小鼠更有效地定植肿瘤(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG)并维持PD-1表达降低(图;gydF4y2Ba5gydF4y2BaH)。gydF4y2Ba

LdCK是CRISPRi的活性成分，对其有效性至关重要gydF4y2Ba

为了解决靶产品分析的监管原理，我们比较了仅通过tNGFR (HER2-TEV标记物)选择富集的RB-340-1(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5A, C): RB-340-1单选(RB-340-1ss)到RB-340-1，这是由于tNGFR的双重选择gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/处置gydF4y2Ba^+gydF4y2Bacell(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。这样做是为了比较CRISPRi组分在同一动物体内抗肿瘤活性的比例贡献，并评估两种分类技术是否会导致可比较的结果。以与RB-340-1相同的剂量(RB-340-1ss_1M)或双倍剂量(RB-340-1ss_2M)给予RB-340-1ss，以补偿含有两种活性元件的双阳性T细胞数量较少。的确，tNGFR的比例gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/处置gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba给药小鼠的最终产品中的细胞从RB-340-1中的23.2%减少了大约一半，到RB-340-1ss中的10.4%(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA)。这一比例是由HER2珠激活3天诱导LdCK表达推断出来的，如前所述(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).通过液滴数字PCR (ddPCR)也确认转导率为载体拷贝数(VCN)/每个细胞(如图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)使用特定于两种结构共同的LV主干的引物(灰色条)，或特定于HER2-TEV(蓝色条)或LdCK(橙色条)的结构标记。虽然在RB-340-1产品中HER2-TEV标记保持一致，但与cRB-340-1和RB-340-1相比，RB-340-1ss中ldck特异性VCN标记较低。在所有病例中，累积VCN均远低于fda推荐的≤5水平。gydF4y2Ba

在限制肿瘤生长方面，RB-340-1明显优于传统的HER2 CAR和cRB-340-1。gydF4y2Ba6gydF4y2BaC)延长动物的生存时间(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaD;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S5, RB-340-1与常规HER2 CAR、cRB-340-1或RB-340-1ss_1M之间的p值< 0.001)。RB-340-1ss_2M的结果与RB-340-1相当(RB-340-1ss_2M与常规HER2 CAR、cRB-340-1或RB-340-1ss_1M之间的p值< 0.01)，而RB-340-1ss_1M与HER2 CAR和cRB-340-1相似。因此，只要给药的双阳性CAR-T细胞数量相当，两种分选策略就产生了相似的结果，这表明CRISPRi的活性成分对体内有效性至关重要。gydF4y2Ba

在采用RB-340-1、RB-340-1ss (2m剂量)和cRB-340-1联合atezolizumab治疗的小鼠中，CAR-T细胞对异种移植物的定植显著增加(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S6)。证实了之前的观察结果，PD-1在RB-340-1中的表达显著降低(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB).在atezolizumab治疗的动物中，由于PD-L1的阻断，PD-L1的占用在肿瘤中是不均匀的，尽管给药剂量据称是饱和的(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC)，并与尸检时残留的cRB-340-1 CAR-T细胞数量相关(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaD)。这强调了PD-1/PD-L1阻断在该模型中发挥的关键作用，无论是外部获得(cRB-340-1 + atezolizumab)还是内在获得(RB-340-1)。在用HER2珠体外刺激(IVS)从肿瘤中恢复的混合细胞群3天后，只有RB-340-1和RB-340-1ss_2M扩增，而来自crb -340-1处理动物的CAR-T细胞没有扩增(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaE)。这可能是由于癌细胞在体外恢复了PD-L1的表达，而在体外培养中没有添加atezolizumab(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaF).有趣的是，我们无法在任何rb -340-1治疗组中识别tNGFRgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/处置gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞离体。然而，这代表了上下文负性，因为在使用HER2珠的IVS三天之后，可以恢复高比例的双阳性细胞(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaG, H)提示在肿瘤快速生长的尸检时，CAR-T细胞的刺激不足以维持LdCK的表达。事实上，通过分析RB-340-1、RB-340-1ss_2M或cRB-340-1联合atezolizumab治疗的动物肿瘤中癌细胞的HER2表达，可以明显减少HER2的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba癌细胞(FgydF4y2Ba我gydF4y2Bag。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba这并不是由于单个癌细胞HER2的表达减少，而是由于CAR-T细胞的高定植和小鼠CD45的优势，这些组中HER2的表达频率与其他对照组相比被稀释gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaJ).由于CAR-T细胞与表达HER2的癌细胞相互作用的随机几率降低，这种分散间接地允许肿瘤细胞在体内逃逸。这反过来又限制了它们的活化，如珠滴实验所示，不仅是单个珠中抗原的密度，而且珠与效应细胞的比例也调节T细胞的活化(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2A)。gydF4y2Ba

所有含有RB-340-1的细胞在体内都保持功能，因为当HER2珠在体外进行最佳刺激时，它们可以恢复LdCK的表达(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaG, H)。值得注意的是，cRB-340-1 CAR-T细胞联合atezolizumab与RB-340-1单药治疗效果相似，优于常规HER2 CAR-T细胞联合检查点抑制。这可能是多种因素综合作用的结果，因为cRB-340-1在atezolizumab组合保护下也具有选择性优势，这表明在LdCK结构中加入LAT有利于T细胞持久性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，但只有当其他抑制因素，如PD-1/PD-L1相互作用减轻。gydF4y2Ba

与常规HER2 CAR、cRB-340-1或RB-340-1ss_1M相比，RB-340-1ss_2M的性能更好，同时观察到前者在尸检时肿瘤中PD-1水平较低(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB)表明RB-340-1的活性成分LdCK在数量上对增强的抗肿瘤有效性负责，而不仅仅是更高数量的转导细胞。gydF4y2Ba

CRISPRi产品RB-340-1在暴露于HER2后有条件地抑制PD-1的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba癌细胞在体外能更好地增殖，体内抗肿瘤活性提高。此外，在低剂量给药时，RB-340-1的表现与HER2 CAR细胞+ atezolizumab的组合相似，甚至更好。这是值得注意的，因为本研究采用的atezolizumab给药时间表(每周两次)远远超过临床批准的三周间隔[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．此外，与atezolizumab相反，RB-340-1中PD-1功能的抑制仅限于交付的ACT产品，预计不会引起任何全身效应。考虑到长期给药检查点抑制剂的毒性，这是对目前联合用药的重大改进[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．此外，通过在一个产品中包含这两种机制的方法，检查点封锁和ACT组合的累积成本得到了缓解。这种好处可以通过应用CRISPRi来同时调节多个生物相互依赖的基因，如PD-1和TIM-3的抑制来增强gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2C)或IL-12、p30/p45以及IL-15和IL-15Ra上调。此外，对T细胞激活和分化的主调控因子(如原癌基因c-Jun)的条件控制可以通过可能导致致癌转化的转基因克服与其组成性激活相关的担忧[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．此外，Stadtmaurer等人[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]通过CRISPR基因编辑T细胞中的三个基因依次删除，以观察频繁的基因组重排，包括染色体易位，这在CRISPRi中是不太可能的。gydF4y2Ba

RB-340-1是首次在人体中验证这一概念的药物，其目标是经过相对良好测试的独立临床实体，如HER2和PD-1。一项首次人体I期研究可以解决表达dcas9的CAR-T细胞的安全性、持久性和免疫原性问题。此外，基于HER2中度表达的免疫源性或免疫排除性癌症患者分层，可以探索在各自癌症免疫环境中的有效性[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RB-340-1被量身定制，以最大限度地提高每个组件的熟练程度。在CAR结构物中包含CD28共刺激结构域导致CD3 ζ链的基础磷酸化和CAR信号的增强，而含有4- 1bb的结构物则会吸收SHP-1磷酸酶，从而削弱CAR- t信号的传导[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．此外，CD28 CAR结构物与GRB2相互作用导致更强的CagydF4y2Ba^{+ 2gydF4y2Ba}助熔剂和PLC-γ1活化[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．然而，强烈的T细胞激活虽然改善了对抗原刺激的效应因子功能，但却以过早分化和衰竭为代价[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．我们选择CD28的原因是，本构激活可以在肿瘤浸润的早期阶段放大效应器功能的部署，并触发化疗吸引来扩大治疗窗口，而过早的衰竭可以通过抑制PD-1来对抗。在适配器中选择LAT是因为其表达的稳定性延长了T细胞的激活和持久性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．RB-340-1还被构建为有条件地表达LdCK，其中包含潜在的免疫原性细菌衍生的dCas9，以限制其在体内的表达，如与肿瘤微环境中表达her2的癌细胞接触。有趣的是，用不同密度的HER2表面结构域包被的小珠刺激显示了LdCK的抗原密度依赖性诱导。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).这一特征有三个好处:(1)它增强了系统的条件性，(2)降低了其dCas9免疫原性的潜力，(3)将LdCK激活与靶抗原密度联系起来，这反过来可能扩大治疗指数，因为良性组织的HER2表达低于癌症[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．考虑到最近有报道称HER2特异性CAR-T细胞可以根除HER2，这一点尤为重要gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肿瘤对曲妥珠单抗耐药是由于肿瘤基质内渗透增加和潜在的较低抗原密度要求，但对良性组织具有重要的靶向/脱靶潜力[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在目前的应用中，RB-340-1包含CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞群，其中CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在最终产物中所占的比例较大(大多数情况下为60-70%)，并且在免疫缺陷环境中具有较长的持久性，从而导致先前在原位胶质母细胞瘤模型中报道的优异的抗肿瘤活性[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．这可能与临床情况有关，其中RB-340-1将用于免疫衰竭患者。gydF4y2Ba

综上所述，RB-340-1是CRISPRi首次应用于临床相关产品。尽管该平台的潜力超出了免疫肿瘤学，延伸到其他免疫病理学和再生医学，但目前的研究为首次在人体内对直系同源蛋白的安全性、持久性和免疫原性进行概念验证评估铺平了道路。gydF4y2Ba

慢病毒载体构建gydF4y2Ba

人类codon-optimizedgydF4y2Ba链球菌gydF4y2BadCas9在c端与Kox1的KRAB (Krüppel associated box)结构域融合[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．将LAT (Human cDNA, NM_001014987.2)与dCas9-KRAB-GFP(或dCas9-KRAB-Q8)融合，组装成LAT- tcs - dcas9 - krab，并克隆到修饰的pHR-SFFV慢病毒载体[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba];将SFFV启动子替换为EF1α启动子、GZMB启动子或NFATRE启动子，得到pHR-EF1αp、pHR-GZMBp和pHR-NFATREp慢病毒载体(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．如前所述[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]， TCS序列(ENLYFQ)插入到LAT和dCas9之间，两侧连接GS连接器。两个核输出信号(NES, LALKLAGLDI和LQLPPLERLTL)位于LAT的两侧，以确保嵌合体蛋白的细胞质定位。gydF4y2Ba

her2特异性单链抗体4D5序列源于人源单抗4D5赫赛汀(曲妥珠单抗)[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．以Promab (PM-CAR-1024)采购的HER2 CAR载体为基础，通过PCR扩增4D5单链抗体，连接CD28跨膜和CD28和CD3ζ细胞内信号域，并亚克隆到pHR-EF1αp慢病毒载体中。烟草蚀刻病毒蛋白酶[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]被PCR扩增并克隆到HER2 CAR的c端。对于HER2 CAR检测和富集，将P2A-mCherry或P2A-tNGFR(截断的NGFR) c端融合到TEV上。小鼠U6启动子(mU6)驱动的PD-1 sgRNA (PD-1sg)被克隆到EF1α启动子上游的HER2 CAR-TEV载体中，以便于将ChaCha系统工程到人原代T细胞[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

将mU6启动子和人U6 (hU6)启动子串联驱动的PD-1sg和TIM-3 sgRNA (TIM-3sg)分别克隆到表达HER2 CAR-TEV的pHR-EF1αp慢病毒载体中进行多路复用实验。gydF4y2Ba

PD-1 sgRNA的设计与筛选gydF4y2Ba

基于预测的转录因子结合位点和靶PDCD1内源基因TSS + /−1 KB区域内核小体分布，设计了PD-1 sgRNA文库。PD-1 sgRNA的筛选是通过Neon电穿孔将96种不同的PD-1 sgRNA候选转染到表达dCas9-KRAB的Jurkat细胞中进行的。前8个被观察到敲除最多和计算预测脱靶最少的候选基因被克隆到pLenti6慢病毒载体中，以便在原代T细胞中进一步验证。选择首选的PD-1 sgRNA #45 (GCTCCGCCTGAGCAGTGGAGA)克隆到表达HER2 CAR-TEV的pHR-EF1αp慢病毒载体中。gydF4y2Ba

慢病毒载体生产gydF4y2Ba

第二代自灭活慢病毒上清是在293 T包装细胞系中产生的。简单地说，70%汇合的293 T T225瓶共转染32µg pHR-EF1αp慢病毒载体质粒，16µg psPAX2 (Gag/Pol)和8µg pMD2。G (VSVG包膜)使用108µl TransIT-LT1 (Mirus)和57µl ViralBoost Reagent (ALSTEM)包装质粒DNA。收集72 h病毒上清液，经0.45 μ m PVDF膜过滤单元过滤，分层于10%蔗糖溶液上，10000 ×高速离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置4小时。浓缩的慢病毒原液在-80°C冷冻以备将来使用。gydF4y2Ba

原代T细胞的分离和CAR - T细胞的生产gydF4y2Ba

健康供体白细胞从gydF4y2Bawww.pparesearch.comgydF4y2Ba．新鲜外周血单个核细胞(pmcs)根据制造商的说明通过淋巴细胞技术(干细胞技术)低密度离心分离。Pan T细胞用Dynabeads原样人T细胞(Invitrogen)分离。为了生成CAR-T细胞，在第0天，将冷冻保存的Pan T细胞解冻并在T细胞培养液(RPMI添加10%人血清、2 mM GlutaMAX、50µM 2-巯基乙醇(Gibco)、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素(Gibco))中，在人抗cd3 (OKT3, 1µg/ml, Biolegend)和人抗cd28 (αCD28, 1µg/ml, BD Pharmingen™)抗体包裹的24孔板中激活。重组人IL-7和IL-15 (Gibco)均为10 ng/ml。T细胞在激活后的第2天，用携带LAT-dCas9KRAB-GFP或LAT-dCas9KRAB-Q8的慢病毒载体转导T细胞，并在第2天转导HER2 CAR-TEV-mChr/PD-1sg或HER2 CAR-TEV-tNGFR/PD-1sg。在第5天，通过将转导的T细胞转移到经过组织培养处理的24孔板中来去除T细胞的活化。第6天，双转导T细胞通过细胞分选(Sony cell Sorter)富集GFP和mCherry或Q8和tNGFR双阳性T细胞。细胞分选后，T细胞维持在0.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba−1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在T细胞培养基中加入IL-7和IL-15 (10 ng/ml)。CAR-T细胞被用于体外试验或在生产运行的第14或21天植入小鼠体内。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

人头颈部鳞状细胞癌系FaDu是从ATCC (Manassas, VA)获得的。FaDu-PD-L1(以下简称FaDu)由慢病毒载体pLenti6.3/V5™-TOPO™(Invitrogen)转导，过表达PD-L1 (Human cDNA, NM_014143.4)，然后选择blasticidin生成。细胞在完全培养基(DMEM + 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素(Gibco))中培养。使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza)常规检测所有细胞的潜在支原体污染。gydF4y2Ba

HER2的定量。C一个R and dCas9 vector copies in transduced T cells

将工程细胞制成颗粒，用PBS清洗，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取DNA。采用慢病毒主干(RRE序列)引物，CAR和LdCK特异性引物进行PCR扩增。RPP30扩增用于细胞数量控制。液滴是使用QX200液滴发生器(Bio-Rad)根据制造商协议生成的。使用QX200滴滴阅读器(Bio-Rad)测量液滴中的扩增量，并使用Quantasoft软件进行分析。gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

使用人HER2- pe - cy7(克隆24D2, Biolegend)和PD-L1- apc(克隆MIH1, eBioscience)检测肿瘤细胞上的人HER2和PD-L1表达。使用抗曲妥珠单抗独特型Alexa Fluor 647偶联抗体(克隆2661E，研发系统)检测HER2 4D5 CAR。HER2 4D5 CAR也通过与Alex Fluor 647结合的人重组HER2蛋白检测到。使用以下抗体评估人T细胞表面表型和转导效率:NGFR-FITC(克隆ME20.4, Biolegend)， Q8(克隆QBEND/10, ThermoFisher)， CD45-AF700或CD45-BV605(克隆HI30, Biolegend)， CD3-APC(克隆SK7, Biolegend)， CD4-PerCP(克隆SK3, Biolegend)， CD4-BB700(克隆SK3, BD Bioscience)， CD8-BV510(克隆SK1, Biolegend)， CD27-PE-CY7(克隆M-T271, Biolegend)， CD28-BV605(克隆CD28.2, Biolegend。使用PD-1-BV421或PD-1-BV605(克隆EH12.2H7, Biolegend)、TIM-3-BV605或TIM-3-PE-CY-7(克隆F38-2E2, Biolegend)、CD39(克隆A1, Biolegend)、LAG-3-BV711(克隆11C3C65, Biolegend)分析T细胞抑制受体的表达。活/死区分使用活/死固定近红外死细胞染色试剂盒(ThermoFisher)。流式细胞术结果采用Kaluza软件(Beckman Coulter)进行分析。gydF4y2Ba

HER2微珠制备和HER2微珠刺激gydF4y2Ba

重组人HER2 (Thr 23-Thr 652, Acro Biosystems)的外膜化学生物素化方法是将30 μg HER2蛋白与20摩尔过量的es - link NHS-PEG4-Biotin (Thermo Scientific)混合在碳酸氢钠缓冲液(pH 8.3)中。在旋转器上4°C孵育2小时后，使用Zeba脱盐柱(7 kDa MWCO)纯化生物素化的HER2。为了将生物素化的HER2偶联到微珠上，首先将3mg直径为2.8 μm的Dynabeads(涂有链霉亲和素，M-280链霉亲和素，ThermoFisher)清洗两次并重新悬浮在1ml PBS中。在每个微管中分别加入3 μg或15 μg生物素化HER2蛋白，用于低密度或高密度。每根微管都被迅速涡旋以使溶液均质。在旋转器上4°C孵育过夜后，将微珠在PBS中洗涤一次，然后在旋转器上用添加2% (w/v)生物素化牛血清白蛋白的PBS在4°C下孵育1小时。最后，将微珠清洗两次，并在含0.02% NaN的PBS中重新悬浮gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba用于存储。使用小鼠抗人HER2抗体(克隆191924,R&D Systems)和QiFiKit(安捷伦)，通过流式细胞术评估微珠上HER2的表面密度。表面密度值(ABC/μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)分别为1487和3628,HER2低珠和高珠。gydF4y2Ba

在HER2珠刺激实验中，大约80000个CAR-T细胞被培养在96孔平板中，HER2低珠或高珠以1:1的比例加入HER2 CAR-T细胞。珠粒刺激3天后，收集CAR- t细胞，流式细胞术检测HER2 CAR (tNGFR)和LdCK (Q8)的表达。gydF4y2Ba

共培养实验与细胞因子产生gydF4y2Ba

在常规共培养实验中，将大约80000个FaDu肿瘤细胞接种在48孔平板中，6小时后按指定的效应:靶细胞(E:T)比例加入CAR-T细胞，并培养6天。每一种情况分别镀三个孔。收集培养上清，ELISA法检测IFN-γ、IL-2和TNF-α (Biolegend)。流式细胞术检测肿瘤细胞残留、CAR-T细胞增殖及PD-1表面表达情况。gydF4y2Ba

在重复肿瘤刺激实验中，CAR-T细胞与FaDu肿瘤细胞在第0天共培养(2万个CAR-T细胞;8万个FaDu细胞;E:T = 1:4)，并在第4、8和12天用10万个FaDu细胞重新刺激。未受刺激的CAR-T细胞保持在100u ml的培养基中gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}- 2。在指定时间点(第4、8、12和16天)，用ELISA法分析共培养上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量(Biolegend)。采用流式细胞术检测受刺激和未受刺激CAR-T细胞及PD-1、TIM-3、LAG-3和CD39的表面表达。gydF4y2Ba

动物实验gydF4y2Ba

计数后0.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba或1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba将FaDu肿瘤细胞重新悬浮在100µl PBS + matrigel(康宁)中，并皮下注射到6- 8周龄雌性免疫缺陷NSG小鼠的右侧(JAX实验室)。当肿瘤平均大小接近100mm时gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba，将小鼠随机分为不同组(见附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:详见图S3-5)，相关小鼠静脉注射抗pd - l1 (atezolizumab, 10 mg/kg)。次日，瘤内给药CAR-T细胞模型，共0.3 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba， 0.25 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba或0.1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba如图所示，瘤内注射20 μ l的HER2 CAR-T细胞;CAR-T细胞静脉注射模型为1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba或3 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba以100 μ l的体积静脉注射HER2 CAR-T细胞。在两个模型中，atezolizumab组小鼠每周连续两次使用atezolizumab (5 mg/kg)治疗。每两周用数字卡尺测量肿瘤大小，用公式计算肿瘤体积gydF4y2BaVgydF4y2Ba=½(长×宽gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)．根据IACUC协议人道安乐死小鼠，安乐死后立即切除肿瘤进行进一步分析。gydF4y2Ba

肿瘤浸润CAR-T细胞的分离gydF4y2Ba

收集实体瘤组织，PBS冲洗，使用gentleMACS分离器(Miltenyi)机械分离，单细胞悬液用所述抗体染色，流式细胞仪分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

两组间显著性差异的统计分析采用非配对双尾方法进行gydF4y2BatgydF4y2Ba使用GraphPad Prism8测试。生存曲线比较采用log-rank Mantel-Cox检验。一个gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为有统计学意义。调查结果的重要性定义为:gydF4y2BansgydF4y2Ba不显著的;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05;**gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.01;＊＊＊gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.001，****gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.0001。gydF4y2Ba

所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。按合理要求提供数据。gydF4y2Ba

行为:gydF4y2Ba

过继细胞疗法gydF4y2Ba

BSA:gydF4y2Ba

牛血清白蛋白gydF4y2Ba

汽车:gydF4y2Ba

嵌合抗原受体gydF4y2Ba

CRISPR:gydF4y2Ba

有规律地聚集在一起的短回文重复gydF4y2Ba

CRISPRi:gydF4y2Ba

CRISPR干扰gydF4y2Ba

dCas9:gydF4y2Ba

Nuclease-deactivated Cas9gydF4y2Ba

ΔU3:gydF4y2Ba

删除U3区域gydF4y2Ba

ddPCR:gydF4y2Ba

液滴数字PCRgydF4y2Ba

EF1α:gydF4y2Ba

人类伸长因子-1 α启动子gydF4y2Ba

艾凡:师:gydF4y2Ba

Effector-to-target比率gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

HER2:gydF4y2Ba

人表皮生长因子受体2gydF4y2Ba

HER2汽车:gydF4y2Ba

传统的抗her2 CAR-T细胞gydF4y2Ba

IL:gydF4y2Ba

白介素gydF4y2Ba

静脉注射:gydF4y2Ba

体外刺激gydF4y2Ba

带:gydF4y2Ba

Kruppel-associated盒子gydF4y2Ba

纬度:gydF4y2Ba

激活T细胞的连接剂gydF4y2Ba

LdCK:gydF4y2Ba

LAT-dCas9-KRAB复杂gydF4y2Ba

LTR:gydF4y2Ba

长终端重复gydF4y2Ba

LV:gydF4y2Ba

慢病毒载体gydF4y2Ba

mChr:gydF4y2Ba

mCherrygydF4y2Ba

mU6:gydF4y2Ba

小鼠U6启动子gydF4y2Ba

NLS:gydF4y2Ba

核定位序列gydF4y2Ba

NSG:gydF4y2Ba

NOD-SCID-IL2rγgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠gydF4y2Ba

NT:gydF4y2Ba

非转导的T细胞gydF4y2Ba

PD-1:gydF4y2Ba

程序性细胞死亡蛋白1gydF4y2Ba

PD-1sg:gydF4y2Ba

PD-1-targeting sgRNAgydF4y2Ba

PD-L1:gydF4y2Ba

程序性死亡配体-1gydF4y2Ba

我想gydF4y2Ba

16-残馀截断CD34细胞外结构域gydF4y2Ba

scFv:gydF4y2Ba

单链可变片段gydF4y2Ba

sgRNA:gydF4y2Ba

单导RNAgydF4y2Ba

塔塔:gydF4y2Ba

TEV可劈裂序列gydF4y2Ba

TEV:gydF4y2Ba

烟草腐蚀病毒gydF4y2Ba

tNGFR:gydF4y2Ba

截断的神经生长因子受体gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子:gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子gydF4y2Ba

TSS:gydF4y2Ba

转录起始位点gydF4y2Ba

VCN:gydF4y2Ba

矢量拷贝数gydF4y2Ba

WPRE:gydF4y2Ba

土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

一个也没有。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Francesco M. MarincolagydF4y2Ba

   现地址:Gilead/Kite, Santa Monica, CA, 90404, USAgydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 避难所生物技术有限公司，门洛帕克，CA, 94025，美国gydF4y2Ba

   杨志芬，李凌玉，阿胡·图尔科兹，陈pohan, Rona Harari-Steinfeld, Maggie Bobbin, Ofir Stefanson, Hana Choi, Violena Pietrobon, Bennett Alphson, Angshumala Goswami, Vitaly Balan, Alper Kearney, Dharmesh Patel, Jin Yang, Damla Inel，王冰和Francesco M. MarincolagydF4y2Ba

2. 艾萨制药，南旧金山，CA, 94080，美国gydF4y2Ba

   维纳·维诺德和亚历山德拉·塞萨诺gydF4y2Ba

3. 阿拉巴马大学化学与材料工程系，美国阿拉巴马州亨茨维尔35899gydF4y2Ba

   庆浩卢武铉gydF4y2Ba

4. 斯坦福大学生物工程系，化学与系统生物学系，ChEM-H，斯坦福，CA, 94305，美国gydF4y2Ba

   雷珊琪gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

LSQ提出了将细胞感知与基因调控结合起来的想法。LL、BW和LSQ设想将HER2 CAR与PD-1调控结合。ZY和FMM设计了概念验证实验。RH-S、AK、DP、MB、VB、K-HH设计了配套实验。AT、PC、HC、OS、BA、VP、AG、JY、DI、VV进行实验。ZY分析了数据。ZY和FMM撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba雷珊琪gydF4y2Ba或gydF4y2BaFrancesco M. MarincolagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

这项研究得到了Explora BioLabs动物护理和使用委员会的批准(协议#EB17-010-122, 2020年2月3日)。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不是必需的。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

以下专利US#9,856,497涉及这项工作。雷s . Qi是Refuge Biotechnologies的联合创始人和科学顾问。gydF4y2Ba

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