Tenofovir Disoproxil, Emtricitabine和Dolutegravir联合cART对HIV-1感染的人源小鼠有有效的治疗作用

在联合抗逆转录病毒疗法(cART)的存在下，HIV-1储存库仍然存在。然而，cART已经将HIV-1感染转化为一种以控制HIV-1病毒载量和降低死亡率为标志的慢性疾病。主要挑战仍然存在，包括终止cART后的病毒耐药性以及HIV-1储存库组织分布的持久性和鉴定。因此，最好地模拟HIV-1发病机制的合适动物模型非常重要，目前的研究补充了我们之前发表的CD34+造血人源小鼠模型的验证。在这里，我们分析了使用最近开发的抗逆转录病毒药物组合(包括Tenofovir Disoproxil (TDF)， Emtricitabine (FTC)和Dolutegravir (DTG))对病毒的抑制作用，这一选择基于最近的临床结果，与以前的方案相比，显示其改善了抗逆转录病毒的效力，CD4+ T细胞的保存，耐受性和预防病毒耐药性。我们使用基于airyscan的定量超分辨率共聚焦显微镜对选定的小鼠组织进行观察。我们的数据使我们能够确定表达HIV-1核心蛋白p24的人T细胞的特定固体组织库。特别是，淋巴结、大脑、脾脏和肝脏被视为残余感染细胞的储存库。病毒复制明显减少。考虑到检测和可视化组织中HIV-1感染的隐藏位点显然是根除HIV-1的关键步骤，需要适当的具有伪人免疫系统的动物模型。 In fact, current studies with humans and non-human primates have limited sample availability at multiple stages of infection and cannot easily analyze the effects of differently administered combined antiretroviral treatments on multiple tissues. That is easier to manage when working with humanized mouse models, although we realize the limitations due to low human cell recovery and thus the number of cells available for thorough and comprehensive analyses. Nonetheless, our data further confirm that the CD34+ humanized mouse model is a potentially useful pre-clinical model to study and improve current anti-HIV-1 therapies.

HIV-1可以在单个细胞中建立稳定整合的、非生产性的感染潜伏状态，主要存在于通过稳态增殖维持的长寿CD4+ T细胞中[1，2］．即使cART取得了明显的成功[3.]，潜在的现有稳定水库是HIV-1治愈的主要障碍。尽管cART能有效抑制HIV-1的复制，但髓系的持续潜在储存库[4，5]和患者体内的T细胞是实现根除HIV-1目标的现有问题[3.，6，7，8］．HIV-1也可以在大脑微胶质细胞中复制，尽管cART仍然存在[9，10］．哈尼卡特等人。[11]报道，即使在cART治疗后，整合的HIV-1 DNA仍存在于人骨髓和脾脏巨噬细胞中，并且只有人骨髓细胞的小鼠在体内cART期间允许巨噬细胞持续感染．

体内CD4+ T细胞潜伏期的机制尚不完全清楚。此外，在病毒根除研究中，还需要更好地描述含有持久性病毒的细胞的组织，以及开发新的、更敏感的总DNA分析测定方法[12，13］．由于用于研究HIV-1潜伏期的转化细胞系不能模拟体内原发潜伏感染细胞的静止细胞环境，因此提出了拟人化小鼠模型来表征HIV-1储存库[14，15，16］．这些模型为消除HIV-1潜在储存库和防止病毒反弹的测试策略提供了平台。适当的人源化模型需要适当的动物人源化程序，以及使用含有各种突变的免疫缺陷受体小鼠品系[17］．SCID鼠标就是一个例子。18，19]，其中催化多肽亚基(Prkdc^scid编码DNA活化蛋白激酶(DNA- pk)的基因的缺失会阻止T细胞和B细胞受体重排所需的有效DNA修复。这反过来导致循环中的B和T淋巴细胞的缺乏。这种模型(具有可翻译为人类的免疫特征)的一个用途是在口服cART治疗期间提供关于不同组织的全面信息，这在受感染的人类中显然是不可行的。

潜伏感染细胞数量少(约1 / 1 × 10)⁶静息CD4+ T细胞)和缺乏表面潜伏期标记使得抗逆转录病毒治疗后检测HIV-1储存库非常具有挑战性[20.］．cART难得一见的潜伏储存库是病毒快速反弹的主要原因，当潜伏细胞在人体内被重新激活时，病毒就会迅速反弹[21]，它们的存在妨碍了目前可用的cART选项完全根除。此外，cART还不能完全抑制HIV-1的复制，因为药物渗透到某些组织，如中枢神经系统[22］．

我们之前的研究为使用HIV-1感染的hu-NSG小鼠测试cART(单独或联合CCR5靶向药物)对HIV-1病毒复制的影响奠定了基础[23］．我们发现hu-NSG模型模拟了体内HIV-1发病机制的关键方面，HIV-1储存库从免疫系统和抗逆转录病毒药物中隔离出来。目前的研究着眼于最近开发的cART鸡尾酒，包括Tenofovir Disoproxil (TDF)， Emtricitabine (FTC)和Dolutegravir (DTG) [24]，使用与我们之前研究相同的模型和方法来验证其在人源化小鼠模型中的有效性。在接受过治疗的患者中，与每日两次RAL相比，基于每日一次DTG的cART方案显示出更强的病毒抑制(71% DTG vs 64% RAL) [25，26］．McAllister等人表明DTG与TDF和FTC是MSM患者每日暴露一次的良好耐受选择[27］．此外，DTG表现出比RAL更高的抗性屏障。它的相互作用潜力很低，所以没有食物限制[28，29，30.］．根据最新的成人和青少年HIV-1感染者抗逆转录病毒药物使用指南[31]， DTG已成为大多数HIV-1感染者联合和推荐的初始方案的推荐成分。

hu-NSG模型是一种有效且有价值的无手术体内系统，用于评估HIV-1复制、抑制和动态治疗反应。此外，该模型确保可用的CD4+ T细胞数量与接受cART治疗的HIV-1患者数量相当[18］．这项研究允许对一组不易从人体受试者研究中获得的样本进行更彻底的分析。

NSG新生小鼠植入人脐带血CD34+细胞

新生动物移植剂量为1 × 10⁵从脐带血中获得的人CD34+造血干细胞，如前所述[14，18，23，32Lonza，捐赠者28753，猫号。# 2 c - 101)。用100 cGy照射3 ~ 4日龄新生儿，照射后3 h内肝内注射CD34+细胞。CD34+细胞在注射前解冻并评估其活力。动物被安置在马里兰州巴尔的摩市马里兰大学(SOM UM)医学院IHV动物设施中，在无病原体的条件下。所有实验方案均符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南，并由SOM UM IACUC批准。CD34+ HSC移植后20周，流式细胞术判断人CD45+细胞扩增T>B细胞(CD3+细胞数高于CD19+细胞数)，选择小鼠。人类CD3+ T细胞少于至少20%的动物未被选择用于本研究[23，32，33］．将13只小鼠分为3个实验组:8只小鼠腹腔感染10,000 TCID_50％其中5只小鼠口服cART治疗17周，5只小鼠未感染，作为对照组。HIV-1 BaL，一种R5复制能力病毒，包含大部分BaLenv基因在HIV-1 IIIB主干，滴度1 × 10⁵/毫升(34]，用来感染8只小鼠。病毒原液由IHV SOM UMµQuant Core Lab提供。美国国立卫生研究院的规定[35将两种性别的小鼠都纳入实验组的要求得到了尊重;每个实验组的性别比例为1:1。为了监测可能干扰实验结果的移植物抗宿主病(GVHD)，密切观察动物的毛发和体重减轻，因为它们是GVHD的主要适应症。没有观察到头发变化或体重减轻超过10%。根据IACUC协议规定，小鼠在第20周结束时被安乐死。

抗逆转录病毒药物治疗

标准cART的剂量是根据已发表的治疗人类慢性HIV-1感染的疗效来选择的[36，37，根据老鼠的体重调整。含有cART [Tenofovir Disoproxil (TDF)， Emtricitabine (FTC)和Dolutegravir (DTG)的混合物]的食物颗粒(Mod TestDiet)每天给小鼠服用17周。圆柱形药丸以每公斤食物60毫克TDF、60毫克FTC和48毫克DTG的单剂量制造。微丸还含有抗生素(阿莫西林，0.12%)，使用前经过辐照处理。每天给每只小鼠口服含有cART混合物的食物颗粒。监测小鼠的药物摄入量，并在吃完药物颗粒后给予常规食物颗粒。每周对小鼠称重两次，每天两次监测其毛发脱落或行为变化。淡水每2天更换一次，随时可自由取用。

共聚焦显微镜观察人类淋巴细胞和HIV-1结构蛋白的染色程序，p24

从供者全血中分离出的原代pbmc在感染前培养3天，从冷冻储存中活化，然后分为感染组和非感染组，感染组在37°C 5% CO下用HIV BaL (MOI = 0.00075)培养3小时₂．随后更换培养基，两组分别培养1周。感染和未感染原代细胞用兔α-CD4 (Invitrogen, Cat。MA5-16338)一抗，1:25稀释，山羊α-兔AF647 (Abcam, Cat。ab150079)二抗，1:250稀释45分钟，4°C。细胞用Foxp3固定和渗透缓冲液(Invitrogen, Cat. 00-5523-00)在4℃下固定和渗透45分钟，然后用小鼠α-p24 FITC (Beckman Coulter, Cat. 6604665)以1:25在4℃下染色45分钟，然后用50µg/mL DAPI染色1分钟。细胞在PBS稀释的1% PFA中成像。对照组不进行兔α-CD4原代染色，用小鼠IgG1 Alexa Fluor 488 (Biolegend, Cat. 400134)代替α-p24 FITC染色。HIV-1阴性和对照细胞未显示阳性染色(未显示)。

对于组织成像，玻片被加热(45°C)至少10分钟以去除石蜡，然后浸泡在二甲苯中。装有载玻片的容器放入含有100%乙醇的脱水桶中，孵育几分钟。用较低浓度的乙醇重复该过程几次，然后将载玻片在95°C的Dako目标提取液中孵育(Dako, Cat No。S2368)冷却20分钟，并根据制造商的说明冷却。阻塞在4°C, 20% BSA在1× PBS中过夜。表面标记物染色使用1:25 α-CD4 Alexa Fluor 488 (Stemcell Technologies, Cat. 60016AD)， 1:25一抗α-CD45 (Leica BioSystems, Cat. 60016AD)。NCL-L-LCA)，或1:25的一抗α-CD68 (Dako, Cat。M0814)室温1小时(RT)。CD45或CD68染色的载玻片用1:250的二抗α-小鼠IgG (H + L) DyLight 488 (Vector, Cat。用0.1% Triton X-100在1× PBS中渗透10分钟，用20% BSA在4℃的1× PBS中堵塞过夜，用1:25的一抗α-p24 (Sino, Cat编号40243-RP01)在RT中标记1小时，然后用1:25的α-rabbit Alexa Fluor 647 (abcam, Cat编号40243-RP01)标记二抗。 ab150079) for 1 h at RT. Slides were DAPI stained using 50 µg/mL DAPI for 2 min and treated with 1× True Black Blocker (Biotium, Cat No. 23007) for 30 s. Slides were cover slipped with Vectashield Mounting Media (Vector, Cat No. H-1000) prior to imaging. Control samples were stained with the same conditions described above, and for additional controls, HIV-1 negative cells/tissues were stained with DAPI and secondary antibody only (not shown).

图像采集

细胞相关荧光的共聚焦图像使用蔡司LSM 800共聚焦系统(卡尔蔡司显微镜，德国)通过Airyscan超分辨率模式获得。三条激光线，405nm(蓝色，代表细胞核)，488 nm(绿色，代表白细胞表面抗原[肝脏、淋巴结和脾脏中的CD45或CD4;CD68在脑]和647 nm(红色，为HIV-1蛋白，p24)。蓝色、绿色和红色信号由DAPI/FITC/TRITC/Cy5二向色分束器分离，并使用Gasp探测器进一步采集。Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC物镜用于多色标记细胞/组织样本的可视化。使用ZEN Blue 2.3软件(Carl Zeiss Microscopy, Germany)生成原始图像。所有图像都是在相同的仪器设置下获得的。信噪比通过平均使用相同增益偏置、探测器和激光激发功率获得的所有图像的数据来计算。采用软件控制的最小像素饱和度范围来避免信号饱和。

外周血病毒载量

小鼠定期进行眶后出血。根据制造商说明书，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Cat. 52904)从血浆中提取RNA。按照制造商的说明，使用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix Kit (Invitrogen 18080-400)将HIV-1 RNA转化为cDNA。采用qPCR扩增HIV-1 cDNA，定量方法如下:50°C下单周期2 min, 95°C下单周期15 min, 94°C下40周期15 s, 58°C下30 s, 72°C下30 s，然后使用BioRad LightCycler和BioRad iQ5软件进行72°C下单周期30 s。使用GraphPad Prism 9对每只小鼠绘制HIV-1 RNA数据(每治疗n = 3;随机选择)，以及每个处理的平均值。

DNA标准曲线

为了建立一个通过qPCR量化HIV-1 DNA拷贝的标准，HIV-1呕吐扩增子使用TOPO™TA克隆试剂盒(Invitrogen, Cat. 450640)克隆，转染到One Shot®TOP10大肠杆菌(表达载体,猫。C404004)，在含有50µg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长，使用QIAprep®Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Cat. 27104)从过夜培养中提取DNA。质粒DNA测序以确定HIV-1呕吐完整性和标准的连续稀释[38］．

使用HIV-1特异性引物与小鼠组织DNA样本一起进行qPCR扩增呕吐(30,000、3,000、300、30和3个标准拷贝)或人β-珠蛋白(100,000、10,000、1000、100和10个标准拷贝)。周期阈值根据对数尺度上的初始模板量绘制，以创建标准曲线[38］．根据标准曲线绘制DNA样本阈值，以量化DNA拷贝数。

组织中HIV-1 gag DNA定量。

通过qPCR测定总病毒DNA(整合和非整合，线性和圆形形式)，定量小鼠组织中的病毒DNA载量。使用QIAGEN DNeasy®血液和组织试剂盒(QIAGEN, Cat. 69506)从小鼠组织(大脑，肝脏，脾脏和淋巴结)中提取DNA，并使用QuantStudio 3 PCR系统(应用生物系统)对每个样本中含有10µL基因组DNA进行分析。样本与一套HIV-1标准一起进行了分析呕吐96孔板中DNA和人β-珠蛋白DNA三份。DNA拷贝数用QuantStudio 3 PCR系统采用标准TaqMan协议进行定量。这包括50°C下的单个循环5分钟，95°C下的单个循环10分钟，以及95°C下的45个循环15秒和60°C下的45个循环1分钟。所有qPCR实验均重复3次，以确保重复性。未知的hiv - 1呕吐或人类β-珠蛋白DNA拷贝数由已知的HIV-1标准DNA拷贝数外推确定呕吐DNA或人类β珠蛋白。我们表达了HIV-1呕吐每10份为一份⁶细胞。所有统计数据均使用GraphPad Prism 9进行计算。

基于我们之前的研究选择Hu-mouse组织样本[23]，我们在NSG小鼠中成功植入了CD34+细胞，并通过流式细胞术鉴定了人CD45+、CD4+和CD8+ T细胞。既往数据显示，在CD45+细胞总数中，CD3+ T细胞平均着床率为64%，CD4+ T细胞平均着床率为38%，CCR5+ T细胞平均着床率为10%，CD8+ T细胞平均着床率为23% [23，32］．在hu-小鼠中存在的人类细胞的流式细胞术数据相对于CD45+细胞数量归一化。从受感染小鼠的病毒载量测量证实，稳定的，多产的HIV-1感染最高达到5 × 10⁵到5 × 10⁶感染后第3周左右拷贝数/mL。这种负荷通常维持到感染后第20周[14，18，23］．

时间轴如图所示。1．在病毒攻击前20周，13只新生NSG小鼠接受100 cGy辐射，然后植入1 × 10⁵以CD3+细胞数大于CD19+细胞数为标准，在20周后用流式细胞术评估其移植情况。8只小鼠腹腔内感染10,000 TCID₅₀HIV-1 BaL [34]在第0周(图;1)，剩下5只老鼠作为未感染的对照组。随机抽血小鼠并评估病毒RNA，以及人类细胞数量，以确认生产性HIV-1感染(图。3.)．在第3周，感染小鼠被分为未治疗组(3只小鼠)和cart治疗组(5只小鼠)。开始cART治疗，每天口服一次，以食物颗粒的形式，直到终点在第20周，在那里他们评估病毒RNA(每个治疗组随机选择3只小鼠)和细胞内DNA。

HIV-1感染的hu-小鼠中HIV-1 p24蛋白的可视化，以证明生产性HIV-1感染

为了确认CD34+细胞的植入和HIV-1的感染，我们在进行功能检测之前，通过airscan共聚焦显微镜分析了HIV阳性和HIV阴性小鼠肝脏、脾脏和淋巴结组织中人类T细胞的存在以及病毒p24的表达。在无花果。2A，体外感染的单个T细胞代表细胞质p24(红色荧光)和α-huCD4 Ab(绿色荧光)的阳性对照。细胞核因核染料DAPI而呈蓝色。体外染色工艺优化后应用于754.34 PE mol/cell的组织染色实验;PE是用于表面CCR5的FACS评价的荧光团。如图所示。2B, D，细胞相关p24，如白色箭头所示，在HIV-1感染的hu-小鼠的LN、脾脏和肝脏中检测到。

我们之前通过流式细胞术在外周血样本中成功植入huCD45+和CD4+ T细胞[23］．在抗逆转录病毒治疗方案中持续存在的最明确的HIV-1储存库位于潜伏感染的CD4+ T细胞内[39，40］．我们最初专注于观察感染的CD4+ T细胞。然而，在感染小鼠的实体组织中，感染的huCD4+细胞很少，这表明HIV感染导致CD4表达下调。相比之下，未感染小鼠的淋巴结、肝脏和脾脏(图。2E，绿色荧光)确实含有huCD4+细胞，这表明要么是感染使这些细胞从固体组织中耗尽，要么是CD4细胞被Nef下调。但CD45+淋巴细胞也表达p24，如图所示。2B，显示淋巴细胞的生产性HIV-1感染。数字2B-E提供了来自三个不同器官的12张个体图像[6张为HIV(+)， 6张为未感染的小鼠]，通过ZEN Blue 2.3软件拼接在一起。从HIV-1(+) hu-小鼠的肠道和脑组织中获得了类似的结果(未显示)。图中细胞数量有很大差异。2D, E，因为人CD4+ T细胞被HIV-1感染耗尽，是未感染人源化小鼠中人CD45+细胞的大多数(> 60%)(如先前流式细胞术所示[23])。我们还用CD68作为标记，对脑组织中感染的单核/巨噬细胞和小胶质细胞进行染色。CD68+p24+和CD68+p24−细胞在感染小鼠中都很明显1:图S1)。

改良cART降低外周血中病毒RNA

我们通过qRT-PCR定量了病毒RNA拷贝数，以证明HIV-1感染，并显示这种cART组合减少了HIV-1 RNA拷贝数(图2)。3.)．在HIV-1感染样本中，HIV-1拷贝保持相对稳定，约为10份⁵-10年⁶拷贝数/mL感染后长达20周。在用改良cART处理的感染样本中，HIV-1拷贝保持相对稳定，约为10份⁵-10年⁶拷贝/mL，直到第3周给药，此时它们迅速下降到无法检测到，并在感染后20周内保持在那里，当cART治疗结束时。正如预期的那样，HIV-1阴性小鼠在整个20周内都没有检测到HIV-1 RNA。每组数据都是从随机选择的动物中获得。如黑线所示，样品进行了两次检测以确保可重复性。比率的p值如图所示。3.．由于所有终点值均为零，无法计算HIV(+) cART(+)与HIV(-)相比的显著性，但数据集在缺乏HIV-1可检测性方面是相同的。

改良cART减少组织中的病毒DNA

我们量化了病毒DNA拷贝数，以评估新的cART组合是否有效地降低了固体组织中的病毒载量。我们使用最初在原代细胞中验证的qPCR检测方法[38]以量化hu-mouse HIV-1和cART处理的组织中的病毒DNA。我们首先比较了我们从感染的胡鼠组织中提取的标准Ct值与ACH.2细胞的Ct值，ACH.2细胞具有单一的前病毒DNA副本。两组值在不同输入水平的一致性表明该方法是准确的(附加文件1:图S2)。

接下来，我们定量了感染湖鼠淋巴结、肝脏、大脑和脾脏组织中的总病毒DNA(整合和未整合)，以确定cART治疗的效果。本实验中使用的标准DNA曲线在附加文件中有详细描述1:图S2在最初的3周HIV-1感染后，小鼠口服新的cART配方共17周。我们还收集了未感染对照组的淋巴结、肝脏、大脑和脾脏组织。数字4显示了这三个实验组组织中的DNA拷贝数。第一列数据显示HIV-1感染小鼠和未治疗小鼠的病毒DNA拷贝数，第二列显示经car -t治疗的小鼠，第三列显示未感染小鼠。感染组有3只实验动物，男女比例为2男:1女，感染/cART组有5只实验动物，男女比例为3男:2女。未感染组实验动物5只(雄性3只，雌性2只)。

图中数据。4显示用新的cART组合治疗的小鼠的固体组织中病毒DNA水平显著降低。cART在胡小鼠的淋巴结和脾脏组织中最有效，但在大脑和肝脏中也相当有效，尽管在这些组织中仍可检测到病毒DNA。图中数据。4分别来自三个独立的实验，每个实验组使用相同的小鼠组织。在感染但未治疗的小鼠中，肝脏的总病毒DNA拷贝数最高(平均每10个9275.3个拷贝)⁶细胞)。脑、淋巴结、脾脏分别为6547.1、767.4、902.55拷贝/10⁶分别是人体细胞。与感染但未经处理的组织相比，用新的cART治疗显示出更低的病毒DNA拷贝数(每10个中有11.4个)⁶肝脏细胞数量为1.5 / 10⁶淋巴结和脾脏均未检测到病毒DNA。在经cART治疗的肝脏和大脑中残留的病毒DNA因此支持了进一步强化cART的需要。这可能涉及到包括CCR5靶向药物，我们之前的体外和体内实验结果显示了其疗效[23，38］．

这项研究表明，在我们的实验中使用的cART治疗成功地降低了外周血中的HIV-1 RNA和HIV-1感染的胡鼠组织(如脾脏、淋巴结、肝脏和大脑)中的DNA数量。它进一步证实了hu-NSG小鼠模型适用于高级抗逆转录病毒疗法的临床前测试，因为它们能够减少HIV-1病毒复制，特别是因为这种模型在不同的治疗阶段提供了各种可获得的组织。我们通过使用超分辨率airscan共聚焦显微镜在不同的人-小鼠组织中显示可视化的HIV-1感染位点，以及使用Tenofovir Disoproxil (TDF)、Emtricitabine (FTC)和Dolutegravir (DTG)联合治疗的HIV-1人-小鼠中病毒DNA拷贝的显著减少，为该模型提供了额外的支持。我们选择这一药物组合是基于其在临床研究中优异抗病毒疗效的最新证据[27，28，41，42]与以前的cart相比。这项研究可以为未来使用纳米配方疗法等在体内研究提供基础，其中可能包括使用CCR5靶向药物增强这种cART或使用酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)等细胞抑制药物作为标准cART选项的佐剂。

已有几种方法可实现持续的病毒缓解，包括被动免疫、早期启动cART、治疗性疫苗接种和清除HIV-1感染细胞的免疫调节[43］．目前的cART提供持续和持久的HIV-1抑制[44这在很大程度上可以有效地阻止病毒复制。然而，迄今为止，还没有任何药物组合能够完全根除HIV-1患者体内的病毒库。HIV-1建立潜伏感染的能力导致这些储存库在各种组织中形成，包括中枢神经系统、LN、肠道和骨髓。有利于病毒储存库存在的两个主要因素是潜伏感染细胞的寿命和无效药物渗透到某些器官(特别是中枢神经系统，[45])。检测和可视化组织中HIV-1感染的隐藏位点显然是根除HIV-1的关键步骤[46]，并将需要适当的动物模型与伪人类免疫系统。

在人类和非人类灵长类动物的研究中存在的问题是，在感染的多个阶段和不同的抗逆转录病毒联合治疗中，样本的可用性受到限制。当使用人性化的小鼠模型时，这更容易管理。对于这些类型的研究，一个方便的小动物模型显然是必要的，尽管我们认识到，由于人类细胞回收率低，因此可用于彻底和全面分析的细胞数量有限，这样的模型可能会存在局限性。由于小鼠身体大小(20-22克)，样本量在某种程度上进一步受到限制，但这些问题可以通过先进的成像和更敏感的qPCR技术来解决[47］．然而，与hu- mouse合作的主要优势是在不同的治疗方案和不同的治疗时间下可获得各种器官组织。有趣的是，Satou等人证明了HIV-1感染细胞在hu-小鼠中存在动态的克隆扩增，这使得hu-小鼠模型更具吸引力[48］．最后，与受感染的个体相比，人源化小鼠的异质性似乎更小，因为先前的研究表明人类有数千个整合位点[48(尽管分析的患者数量很少)。这是值得考虑的，因为在创始人病毒序列、初始感染途径、HIV-1感染持续时间和治疗方面存在差异，这些差异会影响受感染细胞的克隆扩增及其组织分布。

考虑到这些因素，我们使用了一种小鼠模型进行这种类型的抗逆转录病毒治疗研究，并确定了cART药物的新组合在多大程度上减少、耗尽或阻止病毒库的建立。这种人造血干细胞移植NOD/SCID/IL2R γ null (NSG)模型的一大优势是与其他hu-mouse模型相比，人细胞重建的时间更短[19］．

我们首先通过在选定的小鼠组织中显示p24的表达来观察HIV-1感染(图2)。2和附加文件1:图S1)。我们接下来测量了血浆病毒载量以证明cART的有效性(图。3.)，并在选定的固体小鼠组织中量化总病毒DNA拷贝数。血浆病毒RNA和组织中的病毒DNA均被该cART显著降低。通过超分辨率共聚焦成像，可以更精确地显示HIV-1阳性细胞内的p24，我们显示了多个生产性HIV-1感染位点，使我们能够评估新的cART组合对HIV-1的抑制作用[14，18］．通过LN、肝脏、脾脏和大脑中的HIV-1 DNA拷贝判断，用这种组合治疗17周后，HIV-1病毒复制显著减少或消除。

已作出重大努力，以根除实体组织中作为潜伏感染的CD4+ T细胞亚群存在的HIV-1储存库[14］．在本研究中，根据HIV-1感染的hu-小鼠的细胞内DNA拷贝总数判断，目前新的cART治疗可以有效抑制病毒复制，从而减少新储存库的建立。我们目前的研究进一步证明了这种人-小鼠模型在分析体内HIV-1感染动力学和通过共聚焦显微镜和功能分析识别HIV-1生产组织方面的效用，尽管一个缺点是缺乏完整的人类免疫细胞谱。需要进一步的人鼠研究来解决由于T细胞稳态而如何抑制HIV-1感染细胞的克隆扩增。

大脑和肝脏组织似乎比LN含有更高的表观病毒载量，可能是因为它们含有更高比例的感染细胞，而不是更高数量的感染细胞。LN的拷贝数较高，但拷贝/细胞数较低。LN中高度分布着人类细胞，由于感染期相对较短，在收集和分析样本之前，感染可能无法在如此大的人群中传播。用这种cART药物组合治疗的HIV-1感染hu-小鼠的肝脏和脑组织中缺乏总的HIV-1 DNA抑制(图。4)，表明需要进一步的cART药物强化策略，可能包括CCR5靶向药物。

在当前研究期间和/或分析的数据集可根据合理要求从通信作者处获得。

作者感谢IHV动物设施的Harry Davis先生对动物的悉心照顾。

该项目由马里兰大学人类病毒学研究所和医学院的内部基金资助。

作者及隶属关系

1. 美国马里兰大学医学院人类病毒学研究所，巴尔的摩，21201

   Matthew Weichseldorfer, Yvonne Affram, Alonso Heredia, Zahra Rikhtegaran-Tehrani, Mohammad M. Sajadi, Sumiko P. Williams, Yutaka Tagaya, Francesca Benedetti, Habib O. Ramadhani, Arshi Munawwar, Joseph Bryant, Davide Zella, Marvin Reitz, Fabio Romerio和Olga S. Latinovic

2. 美国马里兰大学巴尔的摩市医学院医学系，21201

   阿隆索·埃雷迪亚，穆罕默德·m·萨扎迪，田谷丰和法比奥·罗梅里奥

3. 马里兰大学医学院生物化学与分子生物学系，巴尔的摩，21201，美国

   Francesca Benedetti & Davide Zella

4. 摩根州立大学生物科学学院，巴尔的摩，MD, 21011，美国

   弗兰克保时捷跑车

5. 美国马里兰大学医学院微生物与免疫学系，巴尔的摩，21201

   奥尔加·s·拉蒂诺维奇

6. 德克萨斯大学健康科学中心微生物发病机制与免疫学系，德克萨斯州布莱恩，77843，美国

   伊冯Affram

7. 约翰霍普金斯大学医学院分子与比较病理学系，巴尔的摩，21201，美国

   法比奥Romerio

贡献

概念化:MR和OSL;形式分析:MW;方法:MW、YA、ZRT、SPW、FB、FD、AM、DZ、FR;监督:OSL;写作-初稿:OSL;编审:MW、AH、ZRT、MMS、YT、AM、JB、MR、FR、OSL。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到奥尔加·s·拉蒂诺维奇．

伦理批准并同意参与

动物被安置在马里兰大学(SOM UM)医学院IHV动物设施中，在无病原体的条件下。所有实验方案均符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南，并由SOM UM IACUC批准(规程#1215007)。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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