下调FBXO43基因通过限制其与PCNA的相互作用来抑制人类乳腺癌中的肿瘤生长

背景

FBXO43在乳腺癌(BC)中的作用及调控机制尚不清楚。在此，我们旨在确定FBXO43在BC中的作用和机制。

方法

通过肿瘤基因组图谱(TCGA)分析FBXO43在BC中的表达。RT-qPCR和western blotting检测FBXO43在BC细胞系中的表达。应用慢病毒下调人BC细胞中的FBXO43。采用增殖试验评价BC细胞的增殖能力。采用流式细胞术对BC细胞的凋亡和细胞周期进行分析。通过Transwell法研究细胞迁移和侵袭。通过构建小鼠异种移植物模型，评价FBXO43在体内的功能。通过质谱、生物信息学分析和免疫共沉淀法(Co-IP)鉴定了可能与BC中FBXO43相互作用的蛋白。最后进行抢救实验，验证与FBXO43相互作用蛋白的抢救效果。

结果

FBXO43在BC中高表达，敲除FBXO43后显著下调。敲低FBXO43可抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。此外，体内实验表明，敲低FBXO43可抑制BC细胞生长。Co-IP实验结果显示FBXO43与PCNA相互作用。进一步的抢救实验证实，过表达PCNA可显著逆转敲除FBXO43对BC细胞的作用。

结论

FBXO43的下调通过限制其与PCNA的相互作用抑制BC的肿瘤生长。FBXO43可能是一个新的潜在癌基因和BC的治疗靶点。

乳腺癌(BC)是目前世界上最常见的肿瘤，也是20-59岁妇女肿瘤相关死亡的首要原因[1，2］．在全球范围内，2020年估计发生230万例新病例[2］．2021年美国与BC相关的新病例和死亡人数估计分别达到284,200例和44,130例[1］．尽管自1989年以来BC的5年相对生存率为90%，死亡率下降了40%，但其发病率仍以每年约0.5%的速度持续增长[3.］．尽管临床上采用了包括手术切除、放疗、化疗、激素治疗、免疫治疗等系统的治疗策略，但BC患者的预后仍不理想。因此，迫切需要进一步探索BC的分子调控机制，以鉴定出更多对预后和治疗有用的生物标志物。

仅F-box蛋白43 (FBXO43)，也被称为EMI2，是F-box蛋白家族的成员，其特征是大约有40个氨基酸的F-box基序。它最初在酵母双杂交筛选中作为一种与Plx-1相互作用的新蛋白质被发现，并被发现有助于脊椎动物减数分裂中细胞静态因子的阻滞[4，5，6］．FBXO43被证明是细胞抑制因子的关键成分，并被认为是后期促进复合物或环体的抑制剂[6］．据报道，FBXO43对小鼠减数分裂和精母细胞减数分裂I的进展至关重要[7］．然而，关于FBXO43在肿瘤发生和恶性进展中的作用的研究较少。

2019年，Xu等通过基因共表达网络分析证明FBXO43等10个基因可作为肝细胞癌预后和进展的生物标志物[8］．随后，有报道对FBXO43在BC中的预后价值进行了组织学分析。研究表明，FBXO43高表达与较差的预后和较高的转移风险呈正相关[9］．然而，FBXO43在BC中的内在分子机制尚不清楚。

在本研究中，我们构建了含有靶向FBXO43的shRNA的慢病毒载体，并用慢病毒转染人BC细胞，以阐明FBXO43在BC中的生物学功能以及FBXO43调控肿瘤生长的潜在机制。

基因表达分析

我们从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载了BC患者的RNA-seq数据(https://cancergenome.nih.gov/)．然后对数据进行过滤和标准化，分析FBXO43在BC肿瘤组织和邻近正常组织中的表达水平。

细胞培养

人BC细胞系MDA-MB-231、MCF7和T-47D来自GeneChem公司(上海，中国)。细胞在DMEM (Corning, 10-013-CVR)和10% FBS (Ausbian, A11-104)中培养，37℃，5% CO₂．

抗体

本研究使用的抗体如下:抗fbxo43 (Sigma, HPA024292, 1:20 00)，抗gapdh (Santa-Cruz, sc-32233, 1:20 00)，抗-β-actin (Santa Cruz, sc-69879, 1:20 00)，抗vcp (Abcam, ab109240, 1:10 000)，抗cd44 (Abcam, ab51037, 1:10 000)，抗pcna (CST， #2586, 1:10 000)，抗acly (Abcam, ab40793, 1:10 00)，抗hspa5 (Abcam, ab108615, 1:10 00)，抗actn4 (Abcam, ab108198, 1:10 00)，抗兔IgG (Santa-Cruz, sc-2004, 1:20 00)，抗小鼠IgG (Santa-Cruz, sc-2005, 1:20 00)，抗兔IgG (CST， #7074)和抗小鼠IgG (CST， #7076, 1:10 000)。

质粒构建和慢病毒转染

shRNA-1 (5 ' -CAAGTTATCAACTTAGAAA-3 ')和shRNA-2 (5 ' -TTAACACATCCTTTAGAAT-3 ')序列被设计为沉默FBXO43，而打乱序列(5 ' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ')被用作阴性对照。然后合成具有干扰序列的单链DNA寡核苷酸，引物退火后合成双链DNA。双链DNA的限制性内切酶切割位点直接连接到用限制性内切酶处理的慢病毒载体上。结扎产物转化为合格产物大肠杆菌细胞(TIANGEN， #CB104-03)，经定量PCR (qPCR)鉴定并验证阳性重组载体。按照厂家说明书使用EndoFree Midi质粒试剂盒(TIANGEN， #DP118-2)提取并纯化正确序列的慢病毒载体。同样，构建的慢病毒可以上调FBXO43、PCNA、VCP和ACLY的表达水平。

将具有干扰序列的慢病毒质粒转染293T细胞。培养48 h后，收集病毒上清，离心纯化，检测慢病毒质量。然后，荧光标记慢病毒转染MDA-MB-231细胞系。当荧光率超过80%，细胞汇合度达到80%时，收集细胞进行进一步实验。

细胞增殖试验

转染的人BC细胞系被播种到96孔板(1500个细胞/孔)并孵育。采用Celigo图像细胞仪(Nexcelom)检测绿色荧光细胞数，连续检测5天。细胞图像用Celigo软件(Nexcelom)进行分析。

MTT试验

用MTT溶液(Genview, JT343)评价细胞活力。简单地说，转染细胞被播种到96孔板(2000个细胞/孔)。将20 ml MTT溶液(5 mg/ml)加入孔中，孵育4小时。然后，取上清液，用100 μl DMSO(石毅股份有限公司，130701)溶解甲醛。采用酶标系统(Tecan Infinite, M2009PR)测定490 nm处的吸光度。

菌落形成试验

转染后的细胞接种于6孔板(500个/孔)，培养8天，大多数单克隆的细胞数大于50个。媒体每三天更换一次。细胞用4%多聚甲醛固定(国药控股化学试剂有限公司)，甲基紫染色(生工生物，CB0331)。ddH₂O被用来清洗细胞。用显微镜(蔡康光学仪器有限公司XDS-100)对细胞菌落进行扫描和定量。

细胞凋亡

使用FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞数量(eBioscience, 88-8007)。简单地说，转染细胞用冷的D-Hanks (pH 7.2-7.4)洗涤，并在1 ×结合缓冲液中重悬。然后加入10 μl Annexin V-APC，孵育10 - 15 min。最后用流式细胞仪(BD, C6 PLUS)检测凋亡细胞数量。

划伤愈合试验

细胞被播种到6孔板中。当细胞密度超过90%时，在盘子上产生划痕，然后用介质清洗盘子。然后，细胞孵育24 h。分别在0 h和24 h用荧光显微镜(Olympus, IX71)拍摄细胞图像，并通过Celigo图像细胞术(Nexcelom)分析细胞迁移面积。

Transwell迁移和侵袭试验

根据制造商说明书，分别使用Transwell迁移试剂盒(康宁，3433)和Transwell侵袭试剂盒(康宁，354480)评估细胞迁移和侵袭能力。感染细胞(1 × 10⁵细胞/腔)被镀入上腔，而下腔则补充30%胎牛血清培养基。孵育24小时后，丢弃培养基，拭子擦拭未迁移的细胞。用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色。在显微镜下计数迁移或侵袭细胞的数量(Olympus, IX71)。

实时定量PCR (RT-qPCR)

MDA-MB-231细胞总RNA使用TRIzol试剂(上海普飞生物技术有限公司，#3101-100)获得，并根据制造商的协议使用M-MLV逆转录酶(Promega, M1705)逆转录为cDNA。采用SYBR Master mix (TAKARA, DRR041B)在实时PCR仪(Roche, LightCycler 480 II)上进行qPCR。本研究采用引物序列:FBXO43: 5 ' -CTCCGATAAGTAATCTTGTGGC-3 '(上游)和5 ' - cttgtctttcttatggtgtcc -3 '(下游);PCNA: 5 ' -TGAAGCACCAAACCAGGAG-3 '(上游)和5 ' -GAAGGCATCTTTACTACACAGC-3 '(下游);VCP: 5 ' -TCTGATGATACTTGTTCTGATGAG-3 '(上游)和5 ' -ATGGCTGGATGCTGATGAC-3 '(下游);ACLY: 5 ' -GCGATACCATCTGTGATCTAG-3 '(上游)和5 ' -TTGTGACTTCGTGCTCCTT-3 '(下游);GAPDH: 5 ' - tgacttcaacagcgacacca -3 '(上游)和5 ' -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3 '(下游)。相对基因表达量按2^−ΔΔCt方法。

Western blot分析

PBS清洗细胞，用2 ×裂解液冷裂解10分钟。使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime Biotechnology, P0010S)检测细胞裂解液上清液中蛋白质的丰度。然后，蛋白质在10% sds -聚丙烯酰胺凝胶(Tanon Science & Technology Co.， Ltd.， VE-186)上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, IPVH00010)上。用含5%脱脂牛奶的PBST阻断细胞膜，并用抗体孵育。采用ECL-PLUS/Kit (Thermo, M3121/1859022)检测蛋白条带。定量分析采用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)．

免疫共沉淀(Co-IP)法和质谱法检测相互作用蛋白

构建含3 × Flag-FBXO43的慢病毒，稳定过表达3 × Flag-FBXO43，转染MDA-MB-231细胞。RT-qPCR和western blot检测3 × Flag-FBXO43的表达水平。

用IP缓冲液从转染的MDA-MB-231细胞中提取蛋白(Beyotime Biotechnology, P0013)。细胞裂解液、PBS和Flag珠孵育24小时。将混合物离心后用TBS冲洗，弃去上清。加入3 × Flag肽(Sigma, F4799)和TBS, 4℃孵育40 min。混合物离心浓缩后，加入加载缓冲液。反应产物在10% sds -聚丙烯酰胺凝胶(Tanon Science & Technology Co.， Ltd.， VE-186)上分离，并用考马斯亮蓝染色。最后进行western blotting。

用3 × Flag拉下的凝胶条被切断，每个凝胶条中的蛋白质被胰蛋白酶(Promega, V5117)消化并切割成多肽。每种肽样品均采用散弹式液相色谱-质谱联用仪进行检测。使用Proteome Discoverer 2.1 (Thermo)和MASCOT 2.5 (Matrix Science)软件对数据库进行查询，得到蛋白鉴定结果。最后，对所鉴定的蛋白质进行生物信息学分析。

动物研究

动物实验按照西安交通大学实验动物关爱委员会的指导方针进行。4周龄BALB/c裸鼠从Charles River实验室取，皮下注射1 × 10⁷用含有shRNA-1的慢病毒载体转染MDA-MB-231细胞。当肿瘤长度超过5mm时，肿瘤体积(π/6 ×长×宽²)和小鼠体重，每周检测两次。三周后小鼠被处死。在活体成像中检测牺牲前的总荧光强度。

细胞周期分析

转染MDA-MB-231细胞离心5分钟(1300 rmp/min)，丢弃上清液。用预冷的DPBS (pH = 7.2-7.4)清洗细胞，离心5分钟(1300 rmp/min)。用40 × PI溶液(2 mg/ml) (Sigma, P4170)、100 × RNase A (10 mg/ml) (Thermo Fisher Scientific, EN0531)、1 × DPBS和Triton X-100 (Sigma, SLBT4524)(染色液比为25:10:1000:40)对细胞进行染色。采用流式细胞仪检测染色细胞，细胞合格率为300 ~ 800 cell/s。采用ModFit软件(Millipore, Guava easyCyte HT)分析细胞周期。

统计分析

数据分析通过GraphPad Prism 8.3.0 (GraphPad Software, Inc.)、IBM SPSS 22.0 (IBM, Corp.)和R version 3.0.3进行。数据以均数(M)±均数(SEM)的标准误差表示。统计学差异采用t检验或单因素方差分析。与a的区别P-value < 0.05为有统计学意义。

FBXO43在人BC中过表达，RNA干扰下调

既往研究表明FBXO43表达与BC患者较低的生存率和转移有关[9］．因此，为了进一步验证FBXO43在BC中的功能，我们通过TCGA分析估算了FBXO43的表达水平，发现FBXO43在BC患者肿瘤组织中的表达水平明显高于邻近正常组织(图。1RT-qPCR检测也显示FBXO43在人BC细胞系中过表达，包括MDA-MB-231、MCF7和T-47D细胞(图2)。1B)。

接下来，我们用含有shRNA的慢病毒转染MDA-MB-231细胞，以沉默FBXO43或含有打乱shRNA的慢病毒。Western blot和RT-qPCR分析结果显示，FBXO43特异性shRNA显著抑制MDA-MB-231细胞中FBXO43的表达。1C, D)。

下调FBXO43抑制BC细胞增殖

为了阐明FBXO43干扰对BC细胞增殖的影响，我们进行了几次增殖实验。我们发现，与阴性对照相比，敲低FBXO43显著抑制MDA-MB-231细胞的生长(图2)。2MTT实验也显示FBXO43干扰对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用(图。2C)。此外，菌落形成实验显示FBXO43的敲低与mda - mb -231细胞菌落形成能力的降低呈正相关(图。2D, E)。所有结果表明，FBXO43干扰抑制了MDA-MB-231细胞的生长，降低了细胞活力。

FBXO43下调诱导BC细胞凋亡

鉴于FBXO43的敲低抑制MDA-MB-231细胞的增殖，我们研究了FBXO43的敲低是否影响细胞凋亡。我们进行了流式细胞术检测，发现敲低FBXO43后，凋亡细胞数量增加。3.A、B)。

下调FBXO43抑制了BC细胞的迁移和侵袭能力

为了研究FBXO43对BC细胞迁移和侵袭的影响，我们进行了划伤愈合和Transwell实验。创面愈合实验结果显示，FBXO43干扰后迁移面积减小(图2)。4此外，Transwell迁移实验显示，敲低FBXO43可显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力(图2)。4C, D). Transwell侵袭实验检测FBXO43干扰对MDA-MB-231细胞侵袭的作用。用含有fbxo43特异性shRNA的慢病毒转染MDA-MB-231细胞后，其侵袭能力明显受到抑制(图2)。4E, F).综上所述，这些结果表明FBXO43的下调抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移。

FBXO43的下调抑制了BC体内肿瘤的生长

鉴于FBXO43干扰抑制了体外BC细胞的增殖、迁移和侵袭，接下来我们通过皮下注射转染MDA-MB-231细胞建立裸鼠异种移植模型，以阐明FBXO43在体内的功能。我们发现FBXO43敲低组肿瘤体积和重量均小于阴性组(图。5此外，体内成像显示，与阴性对照组相比，FBXO43敲除组的总荧光强度较低(图2)。5C, D).总的来说，敲低FBXO43明显抑制了BC在体内的生长。

下调FBXO43通过限制其与PCNA的相互作用抑制BC细胞的增殖和迁移

为了探索FBXO43调控BC生长的内在分子机制，我们构建了稳定过表达3 × Flag-FBXO43的慢病毒(附加文件)1，2:图S1A，图S2A)，并进行Flag-tagged下拉实验，以鉴定与FBXO43相互作用的蛋白(附加文件)2:图S2B)。我们通过质谱分析确定了288种可能与FBXO43相互作用(数据未显示)。TGCA数据分析显示，288个蛋白中有66个与BC相关。接下来，进行生物信息学分析，估计FBXO43与66个已鉴定的与BC增殖和转移相关的蛋白的相互作用(附加文件)2:图S2C)。选择6个与BC增殖转移相关的蛋白(ACLY、PCNA、CVP、ACTN4、CD44、HSPPA5)进行Co-IP检测，验证质谱分析结果。ACLY、PCNA和VCP被发现与FBXO43相互作用。6一个)。

为了研究过表达ACLY、PCNA或VCP基因是否对FBXO43基因下调细胞有功能恢复作用，我们构建了过表达ACLY、PCNA和VCP的慢病毒，将这些慢病毒和含有FBXO43特异性shRNA的慢病毒共转染MDA-MB-231细胞，并进行了以下拯救实验。RT-qPCR结果显示，过表达后ACLY、PCNA和VCP的表达水平升高(附加文件1:图S1B-D)。高含量筛选(HCS)增殖试验表明，转染含有FBXO43特异性shRNA的慢病毒的BC细胞中，ACLY、PCNA或VCP的过表达逆转了FBXO43敲除对增殖的抑制作用。6B)。进一步的MTT实验表明，过表达PCNA显著减弱了FBXO43干扰对BC细胞活力的抑制作用(图。6C)。此外，侵袭试验证实，重新引入PCNA可以明显逆转敲低FBXO43的迁移抑制作用(图。6D).鉴于FBXO43和PCNA参与了细胞分裂和增殖的过程[6，7，10]，我们通过细胞周期分析证实FBXO43和PCNA对MDA-MB-231细胞分裂的影响。结果显示，抑制FBXO43可抑制细胞分裂，而过表达PCNA可显著逆转抑制FBXO43对MDA-MB-231细胞分裂的抑制作用(图。6E).所有结果表明，FBXO43下调通过限制其与PCNA的相互作用而抑制BC的肿瘤生长。

虽然BC在高收入国家的五年生存率已达到85-90%，但在许多中低收入国家，其预后仍然很差[11］．BC的发病率在全球许多国家持续上升[3.，12，13，14］．因此，有必要深入探讨BC的发病机制，寻找更多有用的生物标志物用于治疗和预后预测。

作为后期促进复合物或环体的抑制剂，FBXO43已被证明对卵母细胞和精母细胞的减数分裂分裂至关重要[7］．关于FBXO43在肿瘤中的作用，已有研究报道FBXO43表达升高与BC患者肿瘤大小、淋巴结转移、生存率差有关[9］．然而，该研究并未揭示FBXO43调控BC发生发展的机制。在我们的研究中，TCGA数据分析显示FBXO43在人BC组织中高表达，这与之前的研究结果一致[9］．RT-qPCR结果也显示FBXO43在人BC细胞系中的表达升高。随后，我们观察到下调肿瘤生长，促进肿瘤凋亡。此外，体内实验表明，敲低FBXO43可显著抑制肿瘤大小和重量。这些结果提示FBXO43可能是一个潜在的癌基因，FBXO43干扰可能有助于控制BC的发生和发展。

接下来，为了进一步阐明FBXO43在BC中影响细胞功能的机制，我们进行了Co-IP实验，发现FBXO43可以通过与PCNA相互作用来调节肿瘤生长。救援实验进一步证明，过表达PCNA可显著减弱FBXO43敲除对人BC细胞生长和迁移的抑制作用。上述结果证实了FBXO43和PCNA在调节BC进展中的重要作用。

细胞增殖能力是肿瘤诊断中重要的预后生物标志物。PCNA被认为是增殖和DNA复制的标志。首次在系统性红斑狼疮患者的有丝分裂细胞核中发现[15，16］．与此同时，另一个研究小组发现了一种在细胞周期中产生的蛋白质，并将这种蛋白质命名为细胞周期蛋白[10］．随后的研究表明，PCNA和cyclin是同一种蛋白质。PCNA在正常和恶性细胞的细胞分裂过程中均有表达，其在恶性肿瘤中的预后和预测价值已被评估。1993年首次报道PCNA与人类BC预后相关[17，18，19，20.，21，22］．酪氨酸211 (Y211)磷酸化的PCNA升高被证明与BC患者的不良预后相关[23］．后来，研究人员发现PCNA与c-Abl的结合可以通过PCNA的Y211磷酸化而促进[24］．在DNA损伤的BC细胞中，c-Abl被发现是PCNA染色质结合和核灶形成所必需的。通过细胞穿透肽抑制PCNA Y211磷酸化抑制PCNA与Abl的相互作用[24］．2013年，Yu等人。25]也证实了抑制PCNA Y211磷酸化后，三阴性BC细胞生长受到抑制，细胞凋亡诱导。此外，Li等。[26]发现三氟吡啶通过下调PCNA抑制三阴性BC细胞的生长并诱导细胞凋亡。以上结果均表明PCNA在BC的肿瘤调控中具有重要作用，这或许可以解释为什么过表达PCNA对FBXO43干扰引起的肿瘤生长抑制具有显著的恢复作用。

据报道，许多pcna结合蛋白，特别是癌症相关蛋白，是本质上无序的蛋白质或具有本质上无序的区域[27，28］．这些蛋白质通过一个包含保守基序的小区域与PCNA相互作用，称为PCNA相互作用蛋白序列(PIP-box)，以调节PCNA的稳定性，从而调节DNA复制和DNA修复[29，30.］．在我们的研究中，我们观察到FBXO43在BC中参与肿瘤生长并与PCNA相互作用。然而，FBXO43是否是一种内在紊乱蛋白，或者FBXO43是否通过PIP-box与PCNA结合，在本研究中尚未明确。因此，FBXO43与PCNA相互作用的结合位点有待进一步研究。

总之，我们的研究结果很好地解释了为什么FBXO43高表达与BC患者预后较差有关[9］．FBXO43的下调通过限制其与PCNA的相互作用来抑制BC肿瘤的生长。因此，FBXO43可能是一个潜在的癌基因和治疗BC的靶点。

数据包含在这篇论文中。

公元前:

乳腺癌

FBXO43:

只有F-box蛋白43

TCGA:

癌症基因组图谱

Co-IP:

Co-immunoprecipitation

RT-qPCR:

实时定量PCR

M:

的意思是

扫描电镜:

均值的标准误差

高碳钢:

高含量的筛选

PIP-box:

PCNA-interacting蛋白质序列

Y211:

酪氨酸211

一个也没有。

一个也没有。

作者及隶属关系

1. 西安交通大学第一附属医院外科肿瘤科，陕西西安雁塔西路277号，710061

   马汝兰，朱坤，袁大为，龚美君，李康，雷孟

2. 西安交通大学第一附属医院乳腺外科，陕西西安雁塔西路277号，710061

   李皮

贡献

RM写了手稿。LM和KL构思了这个项目。RM、KZ、DY、MG和YJ进行了实验。所有作者都参与了数据分析并对手稿进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到李康或Lei孟．

伦理批准并同意参与

动物实验按照西安交通大学实验动物关爱委员会的指导方针进行。

发表同意书

所有作者都同意发表这篇手稿。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

出版商的注意

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