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囊性纤维化的基因治疗:精准医疗的新工具

转化医学杂志体积19、物品编号:452（2021）引用本文

摘要

1989年囊性纤维化(CF)基因的发现为治疗该疾病取得令人难以置信的进展铺平了道路，现在加拿大CF患者的平均生存年龄约为58岁。基因靶向工具和新的细胞和动物模型的最新发展重新点燃了对所有CF的永久基因治疗的探索。在这篇综述中，我们重点介绍了一些最新的基因治疗方法和新模型，这些方法和新模型将为CF的个性化治疗提供见解。

介绍

囊性纤维化

囊性纤维化(CF)是最常见的致命性遗传病，全世界约有9万人受其影响。1］．它是一种常染色体隐性遗传病，需要CF基因在两个遗传等位基因中发生突变[2］．CF基因编码一种蛋白质囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)， CFTR是一种蛋白质氯离子通道，属于三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)转运蛋白家族。它由两个跨膜结构域(MSD1, MSD2)，两个核苷酸结合结构域(NBD1, NBD2)和具有多个磷酸化共识位点的功能调节结构域(R)组成，当磷酸化时，发生构象变化并打开氯离子通道[3.］．影响CFTR表达、蛋白水平或功能的CF基因突变，现在被称为CFTR变异，影响包括肺、胰腺、肝脏、肠道和生殖器官在内的多个器官系统。氯化物和碳酸氢盐通过该通道运输的变化会损害上皮细胞的功能，包括将异物从气道中运输出去、汗液氯化物浓度升高、胰腺激素调节障碍和肠梗阻[4，5，6］．在肺部，cftr介导的氯离子和碳酸氢盐离子通过上皮出口到气道表面液(ASL)中，在维持ASL pH和气道分泌蛋白组成(即粘蛋白)方面起着至关重要的作用。ASL的脱水使粘液分泌增厚，损害粘膜纤毛清除、抗菌酶活性，并促进由反复感染介导的促炎环境，导致肺损伤[7］．

类的雌性生殖道变体

在1989年,雌性生殖道在7号染色体长臂(1q.31.2)上被鉴定并定位，由27个外显子组成，横跨约215 KB的基因组序列[8，9，10，11］．虽然迄今为止已鉴定出的CF突变有1000 000个(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)，超过360种可引致CF疾病的变种(www.cftr2.org)。最近，根据CFTR蛋白功能障碍和/或基因表达将这些变异分为7类[12(图。1): I类是导致CFTR蛋白无功能的蛋白质产生变异，大约22%的CF患者携带至少1个突变等位基因;第二类是蛋白质加工变异体，产生错误折叠的CFTR蛋白并减少细胞膜上的表达以发挥功能。大约88%的CF患者至少有1个突变等位基因，主要变异p.Phe508del (F508del)-CFTR是由蛋白508位苯丙氨酸的突变缺失引起的;III类是损害CFTR门打开的门控变异，约占CF患者的6%;IV类导致离子通道传导缺陷，大约6%的CF患者携带这种变体;V类是蛋白质变异不足，导致表面膜CFTR数量减少，占CF患者的5%;VI类影响CFTR的稳定性，导致膜潴留减少，5%的CF患者至少有一个这种变异的等位基因，最后是VII类影响雌性生殖道mRNA表达导致无mRNA，包括大缺失，如dele2,3(21 Kb)突变。

图1
图1

类的雌性生殖道变异和CFTR调制器及其对CFTR表达和加工的影响

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的优点和缺点雌性生殖道调制器疗法

在过去的30年里，临床干预和CF研究的巨大进步使得CF治疗取得了革命性的进展。在针对CFTR蛋白的小分子(CFTR调节剂)开发之前，CF的治疗仅旨在缓解与该疾病相关的症状[13］．近年来，能够直接纠正遗传缺陷的CFTR调节剂为治疗CF铺平了道路[14］．在这里，我们简要介绍一些目前已批准或正在临床试验的CFTR调节剂。

CFTR调制器分为4组(图1)。1):校正器、增强器、稳定器和放大器。旨在稳定细胞质中错误折叠蛋白以防止降解的小分子被称为校正剂(例如来自Vertex Pharmaceuticals的lumacaftor (VX-809)， tezacaftor (VX-661)和elexacaftor (VX-445)以及来自Proteostasis的posenacaftor (PTI-801))。与CFTR通道的NBD结构域结合以促进其打开的小分子被称为增强剂(例如ivacaftor (VX770)和director (PTI-808))。cavosonstat (Nivalis的N91115)等稳定剂恢复了质膜上的蛋白质稳定性，促进了CFTR的成熟，目前正处于II期临床试验。放大器增加了CFTR的产量，包括nesolicaftor (PTI-428)，目前正在与PTI-801和PTI-808联合进行III期临床试验的候选产品。最后，对于导致cf的变体，其中帧内无义，移码和剪接变体引入过早终止密码子(PTC)雌性生殖道通过Eloxx制药公司开发的ELX-02和PTC Therapeutics公司开发的Ataluren PTC-124等药物读取mRNA(即W1282X和G542X)，旨在通过覆盖PTC信号来恢复功能性蛋白的产生[15］．然而，目前正在进行的ELX-02和PTC-124的早期临床试验在III期临床试验中未能显示至少有1个突变等位基因的患者的FEV1测量有显着改善[16］．转录本的数量因PTC的位置、细胞类型和患者的遗传背景而有很大差异[15，17］．其他无义介导的衰退(NMD)途径的小分子抑制剂，如SMG1抑制剂(SMGi)可以恢复雌性生殖道W1282X基因在细胞中的表达和功能雌性生殖道［18］．因此，结合小分子来改进雌性生殖道CFTR调节剂的转录产物和/或稳定性可能提供更好的临床结果。

已获批准的CFTR调节疗法ORKAMBI™(VX-770和VX-809的组合)和SYMDEKO™(VX-661和VX-809的组合)是联合治疗，已显示出对一些携带F508del-的患者的临床益处雌性生殖道。然而，对这些药物的反应存在很大差异，这表明虽然这些药物可以用于治疗相同的遗传缺陷，但其他因素，如环境[19，20.，21]和基因修饰因子[22，23，24，25可能会影响治疗反应。TRIKAFTA™是最近批准的一种药物，是2种校正剂(VX445和VX661)和1种增强剂(VX770)药物的组合，在改善F508del-CFTR患者的肺功能、汗氯传导和降低肺恶化方面显示出令人难以置信的前景。26］．这些调节剂的短期有效性为恢复基本肺功能提供了希望。然而，该药物在有效治疗所有携带至少1个F508del等位基因的CF患者中的疗效尚不清楚。许多罕见的CF变体不适合当前的调节剂治疗，因为这些药物预计不会像I类生产变体那样起作用。此外，调节剂治疗的长期潜在副作用尚不清楚[27]，而CFTR调节剂治疗的平均费用超过30万美元/年/名患者[28]，如果没有资金支持或报销，许多CF患者将无法接受可能挽救生命的治疗。因此，仍然需要新的治疗方法来治疗所有CF。

CF的基因治疗方法

基因疗法为治疗遗传性疾病提供了很大的希望。通过将基因突变替换为正确版本的雌性生殖道吉恩，这个方法有可能永久治愈。的确，自从CF基因被发现以来，许多研究都试图纠正它雌性生殖道通过基因治疗方法实现突变。虽然基因校正在细胞和动物模型中都显示出有限的成功[29，30.，31，但事实证明，对患者的治疗更加困难。体外研究表明，并非所有细胞都需要表达正常的CFTR才能影响正常的上皮功能。在将正常细胞与CF突变细胞混合的混合实验中，只需要6-10%的上皮细胞含有表达正常CFTR的上皮细胞，就能恢复与正常上皮相似的氯离子转运[32］．相反，在一项基因靶向研究中，高达25%的基因校正可以恢复纯合子F508del人气道上皮细胞的粘液运输[33］．野生型细胞的数量雌性生殖道这需要转化为患者的临床益处仍然未知。然而，从理论上讲，纠正气道内的干细胞群可能提供可再生和长期的内源性细胞来源，能够用表达野生型的细胞更新受损的上皮雌性生殖道。然而令人惊讶的是，除了MRT5005的I期和II期临床试验[https://www.cff.org/Trials/Pipeline/details/10157/MRT5005]，一种药物雌性生殖道-编码mRNA到肺部(RESTORE-CF)，目前还没有其他CF基因治疗的临床试验。这在很大程度上可能是由于以下几个原因:由于无法靶向气道的干细胞/祖细胞以维持细胞周转期间的表达，需要重复递送，2。由于高度炎症的微环境，供体质粒/基因向CF气道的递送不理想或靶向效率低。无法提供大的DNA片段雌性生殖道基因有效地与目前的递送方法，3。4 .对脱靶安全性的担忧可能导致插入性突变。免疫屏障限制了病毒载体的有效传递。在这篇综述中，我们简要介绍了一些最新的基因方法，这些方法可以使CF基因治疗恢复活力，并介绍了新的细胞和动物模型，这些模型可以测试当前的基因靶向策略，并为CF治疗的个性化方法提供见解。

基因编辑方法

基因编辑工具可以提供新的基因治疗策略，以实现永久纠正。在这里，我们列出了迄今为止用于测试体外CF基因校正功效的一些编辑工具。

锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)

基因编辑方法的早期发展包括使用人工限制性内切酶、锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活物样效应核酸酶(TALEN) [34，35),(表1;无花果。2)。这些基因修饰工具通过靶向核酸酶裂解实现了精确的基因组编辑，为基因治疗带来了新的希望。ZFNs由附着在FokI限制性内切酶上的特定寡核苷酸对组成，有助于在目标位点进行精确的双链断裂(DSB) [36］．TALENs由结合和识别延伸DNA序列的TALE重复序列组成，并与FoKI限制性内切酶连接以形成DSB [37，38］．在这两种情况下，DSB通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)诱导DNA修复机制[39，40］．ZFN和TALENs技术均未用于CF基因治疗，随着CRISPR-Cas系统的出现，使用后一种工具进行基因编辑更加灵活，使其成为许多研究人员选择的编辑工具。对一对ZFNs的特殊要求减少了可以识别用于基因校正的目标位点的数量。此外，ZFN的低结合亲和力在基因组中产生了不希望的脱靶突变[41］．与ZFN相比，TALEN显示出更少的脱靶性和更好的结合亲和力，然而，编码TALEN的cDNA的大小(3kb)可能是一个问题，无法将其递送到具有有限货物大小的细胞中[42］．

表1基因编辑工具的优缺点
全尺寸工作台
图2
图2

基因编辑技术图表

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CRISPR基因编辑

2013年，细菌使用一种新的基因编辑工具来抵御噬菌体，这种工具被称为簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)及其酶CRISPR相关蛋白9 (Cas9) [43]被证明在编辑培养的哺乳动物细胞的基因组方面是有用的[44］．CRISPR-Cas9系统的精确编辑以及该系统通过去除部分基因或用所需基因替代基因来沉默基因的多种用途使CRISPR-Cas9系统成为基因编辑的首选编辑工具。此外，设计特定目标位点的相对容易和低成本使得在相对较短的时间内完成高效的基因编辑[45］．CRISPR-Cas9由两个主要模块组成:引导RNA (gRNA)和Cas9蛋白酶。gRNA被设计用于识别靶点附近的特定序列基序，并招募Cas9蛋白切割并产生双链DNA断裂(DSB)。然后激活细胞的自然DNA修复机制，通过NHEJ或HDR修复断裂的DNA [39，40］．NHEJ直接连接断裂的末端，可以产生“插入”或插入或删除基因，有效地产生突变[46］．然而，有了修复模板，HDR反应将使同源重组成为可能。这种方法对于引入所需的基因(或基因的野生型版本)是有用的。然而，HDR的频率非常低[47因此，“修复”或替换突变基因的效率仍然是一个挑战。

碱基编辑：crispr - cas9系统对引入dsb的传统依赖带来了效率问题，因为不希望的随机插入或删除(indels)在DNA切割位点比HDR更频繁地发生。因此，碱基编辑被首创用于提高CRISPR-Cas9系统的效率，方法是完全绕过对dsb的需求，允许在靶位点不需要dsb的情况下将DNA碱基直接转化为另一个碱基[48］．胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)促进C-G碱基对永久转化为T-A碱基对，而腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)酶促地将A-T碱基对转化为G-C碱基对[49］．在CF的背景下，碱基编辑可能是治疗CF的一个有吸引力的新工具，因为许多雌性生殖道变异可以通过改变单个碱基对来拯救。因此，Geurts等人最近支持了在人类细胞内安全地利用这种碱基编辑工具，用两种不同的ABEs治疗CF的有效性和可行性[50］．碱基编辑的一个警告是只有4种可能的碱基到碱基转换的限制，并且对于某些基因传递载体来说太大了。

(ii)主要编辑主要编辑最近成为CRISPR工具箱中一个有吸引力的进步[51］．这种基因编辑技术使得使用由催化受损的Cas9蛋白和工程逆转录酶组成的融合复合体在靶位点编辑指定的可变长度的DNA序列成为可能[51］．引物编辑向导RNA (pegRNA)编码所需的基因编辑并将融合复合体引导到目标位点[51］．作为一种可能的基因替代治疗技术，启动编辑在CF的背景下是非常有前途的，因为最常见的雌性生殖道变体(CFTR-F508del)已在患者来源的肠道类器官中通过启动编辑修复[52］．然而，启动编辑确实导致了不同程度的靶向效率，并且还观察到不希望的脱靶突变[52］．然而，自从雌性生殖道基因是大的，完全替代了一个突变基因与野生型雌性生殖道虽然可能效率低下，但主要编辑是解决大量CF致病变异的主要方法。

基因传递

有几种基因传递方法来引入治疗基因或基因靶向。在CF基因治疗研究中，已经测试了非病毒和病毒传递载体。

(i)非病毒载体：非病毒载体被开发作为一种策略来传递雌性生殖道基因。这些非整合基因传递方法不会破坏宿主基因组，因此引起突变的风险很低。非病毒载体不受载货量的限制，使较大的供体DNA片段可用于基因修复。然而，基因传递的有效性相对于病毒方法要低。为了促进基因转移到细胞核，使用阳离子脂质来形成质粒DNA [53[复杂的雌性生殖道与非CF患者相比，CF患者的氯离子转运增强了20% [54］．使用雾化阳离子脂质pGM169/GL67A递送供体DNA，观察到CF患者肺部CFTR功能增加3.7% [55，56］．阳离子脂质体介导的方法的缺点是需要重复传递作为短暂的表达雌性生殖道没有持久的影响[57］．尽管有这些努力，基于非病毒的基因传递方法不能永久恢复肺功能。

(ii)病毒载体为了提高靶向细胞的效果，在临床前和临床试验中，已经测试了几种基于病毒的递送方法，包括腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒载体来递送纠正雌性生殖道基因。

腺病毒(广告)

基于基的载体曾经是基因传递的首选载体[58，59］．病毒复制基因和宿主免疫细胞逃避基因的早期1区和3区(E1/E3)的突变缺失，使病毒丧失了自我复制的能力，使这些病毒载体对基因治疗具有吸引力。然而，从E1缺失载体中漏表达病毒基因，以及衣壳蛋白，可以引起宿主对Ad载体的免疫反应[60，61，62］．使用腺病毒载体进行CF基因治疗的第一次临床试验(1993年)未能恢复雌性生殖道CF患者鼻上皮的表达[63，64］．这导致在CF临床试验中发现和检测其他2型和5型腺病毒，导致鼻腔和支气管上皮中氯化物转运的短暂恢复[65，66］．然而，这些Ad载体有促炎反应的证据，需要反复给药才能有效地传递基因[63，65］．即便如此，这些试验在CF患者中只显示出有限的临床益处[66］．

腺相关病毒

基于aav的载体已作为另一种基因传递工具进行了测试。由于具有转导终末分化和非分裂细胞的能力，AAV也可以持续更长时间已［67与广告相比。短暂免疫抑制可改善AAV载体在小鼠肺中长达8个月的再给药[68］．1998年，首次成功将AAV2-CFTR反复送入上颌窦的人体临床试验[69在分娩2周后显示CFTR功能恢复，没有明显的毒性或免疫反应升高。然而，多年后进行的其他临床试验研究未能显示AAV-CFTR对CFTR功能的充分纠正[70，71］．对AAV载体的一个警告是有限的靶基因大小(小于4.6 kb)，可以插入到病毒载体中进行有效表达。

辅助腺病毒(Hd-Ad)

为了避免Ad的有害免疫反应，研究人员开发了辅助性腺病毒(Hd-Ad) [72］．删除所有病毒编码序列允许Hd-Ad在不引起宿主免疫反应的情况下递送大量DNA货物(达37 kb) [73，74］．Hd-Ad载体的一个独特之处在于，它们可以在单个载体中同时传递基因编辑内切酶系统和供体DNA，以实现位点特异性基因整合，而无需在基因校正后表达内切酶[75，76，77］．利用Hd-Ad对CF小鼠和猪气道基底细胞进行基因校正，可以恢复CFTR功能，其水平与荧光成像板阅读器(FLiPR)测定的正常野生型细胞相似[30.，72，78，79，80，81］．HD-Ad矢量也被证明是有效的校正雌性生殖道基因在CF敲除小鼠肺中的表达[82］．然而，一个重大挑战仍然存在已基因治疗作为维持治疗效果的能力由于气道细胞的更新而丧失。因此，针对气道内的干细胞室已成为永久性CF基因校正的一个有吸引力的目标。

逆转录病毒和慢病毒

早在20世纪90年代末，逆转录病毒和慢病毒载体就被用于基因传递方法。人类的逆转录病毒雌性生殖道转入兔气管上皮细胞的基因在气道中持续表达达3周。然而，逆转录病毒的转导能力较低，并且只发生在受伤部位[83］．慢病毒载体在递送方面是有效的雌性生殖道转基因进入气道上皮[84有可能持续和持久地靶向肺干细胞群雌性生殖道表达式[85］．虽然逆转录病毒和慢病毒都可以有效地靶向宿主细胞并整合到宿主基因组中，但它们作为基因治疗的传递载体仍然存在重大问题。宿主免疫反应仍然是通过病毒方法有效传递外源遗传物质的重要障碍。在CF气道疾病的背景下，病变气道的促炎环境加上粘膜阻塞对任何基因传递方法都提出了挑战。其次，人们担心插入突变、表观遗传沉默以及使用病毒启动子驱动转基因不受调控的表达而引起的表达水平改变的继发性影响[86，87］．

因此，尽管新的基因编辑方法可能会提高基因校正的靶向效率，但精确有效地将遗传工具传递到正确的细胞类型以进行永久性基因校正仍然是临床应用的障碍。为了研究这一点，新的动物和先进的基于干细胞的模型可能使研究细胞传递和靶向策略成为可能。

CF动物模型

CF的动物模型是有价值的工具，可以用来进一步了解疾病的发病机制和测试新的治疗方法。在基因治疗对患者可行之前，有两个基本问题有待解决，动物模型提供了一个相关的平台，通过它可以安全地解决这些障碍。首先，基因靶向的体内效率需要达到能够转化为治疗结果的水平。其次，基因靶向的功效必须超过基因编辑工具对脱靶突变的担忧。动物模型一直是了解疾病发病机制的有效模型。最近的CF动物模型，特别是那些包含人类CF变体的动物模型，为测试新出现的CFTR调节剂提供了机会，这些调节剂被设计为专门针对特定的功能结果。在这里，我们简要介绍几种动物模型及其在CF治疗发现中的应用(图2)。3.)。

图3
图3

CF动物模型与人类疾病表型的比较

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(i)小鼠模型:小鼠与人之间氨基酸序列保守78%雌性生殖道(h雌性生殖道) [88]，当考虑到诸如成本、繁殖时间和易于维护等实际因素时，使用小鼠进行疾病建模并不令人惊讶。然而，CF小鼠模型仅表现出轻度胰腺疾病[89，90]如有，表现为胆囊变异性异常[90，91，92]，而肝脏病变在很大程度上只在晚年研究的小鼠中观察到[89］．虽然新的人源化小鼠模型已经可用，并可用于研究CFTR调节剂的功效，但它们具有一个主要的限制，即只能携带约6个h拷贝雌性生殖道基因(93- - - - - -95］．因此，目前尚不清楚这些人源化模型对基因治疗测试的有效性，但可能是CFTR调节剂测试的良好模型。

(ii)大鼠模型CF大鼠模型与CF小鼠表型相似。与CF小鼠一样，大鼠模型没有重现自发性肺部感染或胰腺和肝脏疾病[96，97]尽管一些模型显示了外分泌胰腺的组织病理学[98］．然而，大鼠拥有76%与h相同的氨基酸序列雌性生殖道［99]并在大气道中有粘膜下腺[97，One hundred.］．大鼠模型也为探索CF建模的新遗传进展提供了基础，例如使用CRISPR-Cas9生成第一个G542X CF无链突变大鼠模型[101]，以及一种新的F508del大鼠模型，可能在治疗药物的开发中具有宝贵的价值[97］．

(iii)家兔模型:家兔CF模型在该领域尚属新事物[102，103因此，与人类CF疾病的相关性仍有待观察。然而，由于兔子的气道解剖和炎症反应，兔子是研究肺部疾病的一个非常有前途的模型[104］．此外，兔与人之间存在92%的氨基酸序列保守性雌性生殖道［88］．对兔子模型的一个警告是，它们的呼吸道中没有粘膜下腺[One hundred.，104]，在人体呼吸道中含有表达cftr的细胞。

(iv)雪貂模型由于人类和雪貂肺之间高度保守的解剖结构[105，106]，雪貂CF模型准确地反映了CF的关键疾病表型，包括那些在其他模型中无法重现的疾病表型[107，108，109序列同源性为92%雌性生殖道［88]，以及遍布呼吸道的大量粘膜下腺[110]，雪貂是一种有吸引力的CF转化模型[111］．雪貂模型需要注意的是维持这些动物菌落的成本，目前的CF雪貂模型需要CFTR调节剂才能存活，这使得对疾病发病机制的长期研究变得困难。

(v)猪模型:猪模型与h具有92%的氨基酸序列一致性雌性生殖道［88]，并且由于它们的遗传、生理和解剖学与人类相似，可以说为CF研究提供了最高的转化潜力[112，113，114］．然而，猪CF模型比雪貂具有更大的实用性和成本挑战。它们庞大的体型，虽然与人类相当，但在劳动力成本和维护方面需要考虑很多。为了测试新药，猪模型可能会变得非常昂贵。然而，CF猪模型概括了所有关键的CF疾病表型，尽管明显比人类表现更严重[113，114，115，116，117］．

研究CF发病机制和治疗的细胞模型。

(i)目前的金标准肺细胞模型细胞模型在了解CFTR的生物物理特性、缺陷的机制原因和评估新的治疗策略方面发挥了重要作用(图2)。4)。人类原代上皮细胞系已成为评估离子通道功能和药物开发的主要工具[118- - - - - -121］．虽然最近培养条件的改善提高了原代细胞的增殖潜力，但这种增殖能力是有限的。122在培养中，原代细胞很快进入衰老。为了避免这种情况，永生化上皮细胞系，如A549、BEAS-2B、Calu-3和16HBE14o，通常用于研究药物转运、代谢和上皮完整性[123- - - - - -127］．然而，这些永生化细胞系来源于肺肿瘤细胞或已经转化，因此不显示原始肺细胞特征或反映在天然肺中发现的所有上皮细胞类型。原代鼻细胞是研究CF气道疾病的另一种细胞类型，因为从患者身上容易产生鼻上皮培养物。这些细胞的优点是相对容易从患者身上获得样本，并且可以多次采样(如果需要)。研究表明鼻上皮细胞是气道支气管上皮细胞的良好替代物[128，129］．然而，像原代支气管细胞一样，在培养中扩增这些细胞以充分利用而不重新取样的能力仍然是一个问题。此外，采样变异性会影响CFTR蛋白的表达和上皮的功能。最近，从支气管肺泡灌洗液中分离的肺干细胞可以在培养中产生可再生的气道类器官[130］．是否可以从患有气道疾病的个体中实现气道类器官生成方法用于疾病建模还有待观察。尽管如此，产生患者特异性肺气道细胞的可再生来源是确定肺部疾病患者特异性治疗的关键促成因素。

图4
图4

研究CF疾病和治疗的细胞模型。对于基因编辑方法，绿色”✓表明研究数据支持在CF基因校正的细胞模型中使用这些方法。红色“X”表示无信息。优点/限制部分以绿色“✓表示可能，红色“X”表示不可能

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㈡用于个性化医疗的人类多能干细胞(PSC)模型当前位置人类胚胎干细胞(hES)于1998年被发现，在修复疾病和组织再生方面有着巨大的希望[131］．hES具有自我更新和分化为所有三个胚胎胚层(内胚层、外胚层和中胚层)细胞的能力，成为再生医学的一个有趣的细胞来源。然而，由于与使用“胚胎/胎儿”组织相关的伦理问题日益增加，利用hES进行再生的研究面临匮乏。2006年，首次发现了诱导多能干细胞(iPSC)，并揭示了这些细胞与小鼠ES具有相似的特征[132］．到2007年，通过向成纤维细胞引入四种与多能性相关的转录因子，制备了第一个人类iPSC [133］．自从这一发现以来，人类iPSC的治疗应用已经导致了65个市场竞争者提供基于iPSC的产品。的确，iPSC是患者特异性疾病建模、药物发现和个性化再生医学的重要细胞来源。来自不同基因突变个体的iPSC生物库已成为疾病建模的有用资源。多伦多儿童医院现在已经获得了100多个CF患者细胞，这些细胞含有各种雌性生殖道变异和从每个个体产生的iPSC，包括一些基因校正的等基因iPSC系，用于对患者特异性的“正常”反应进行基准测试[134］．这无疑将使CF器官建模和患者特异性疾病的研究和治疗发现成为可能。

人类多能干细胞分化为多种组织细胞类型现在已经实现，尽管效率不同。大多数定向分化方法使用一种逐步激活和/或抑制已知影响动物模型(尤其是小鼠)发育生长的途径的方法。事实上，我们和其他人已经确定了从人类iPSC生成肺上皮细胞所需的关键发育途径[135- - - - - -138］．此外，纯合子F508del CF衍生的气道和肠细胞iPSC模型CF表型(缺乏CFTR膜表达)可用于筛选CFTR小分子校正物[136，139，140］．我们已经证明，CF ipsc衍生的气道细胞可用于高通量CFTR功能筛选，这是将这些细胞用于个性化医疗的一步[139- - - - - -143］．最近，我们已经改进了从人类PSC中生成肺细胞，并展示了捕获的实用性雌性生殖道分化细胞建模发育中的表达与功能[136，144］．对突变体CFTR在发育过程中的影响的了解仍然很少，这些新的PSC模型将促进我们对疾病机制的产前起源的理解。

使用iPSC模型的另一个好处是能够确定患者和组织特异性反应。这一点很重要雌性生殖道不同组织的表达和活性水平不同。已经在iPSC中测试了CF突变的纠正，但是这些基因编辑策略在体内的功效仍有待观察[141- - - - - -143］．最终，建立预测患者和组织特异性模型来预测患者结果是推进精准医疗的关键。

新的模型，新的基因编辑工具，新的目标?

在制定CF治疗策略的最大挑战之一是CF致病变异的绝对数量。即使在具有相同变异的患者中，症状的严重程度和对治疗的反应也存在巨大差异。迄今为止，CF的治疗方案是突变依赖的，没有可行的方案普遍适用于所有CF患者。尽管基因编辑的最新进展为个性化治疗带来了希望，但这对于治疗所有CF既不可行也不实用。

最近，Kemaladewi等人展示了一种新的不依赖突变的治疗方法来治疗1A型先天性肌营养不良症(MDC1A) [145］．利用CRISPR，通过寻找单一致病基因而不是靶向代偿修饰基因来治疗遗传性疾病的可行性得到了说明。在CF的背景下，除CFTR外的离子通道与CF疾病的严重程度和对调节剂治疗的反应有关。因此，针对其他已知也会影响CF疾病严重程度的离子通道，如钠离子通道ENaC [146]或替代离子通道TMEM16A (ANO1［147，148])及SLC26A9 [149，150可能需要进行评估，以找到对所有CF患者有效的治疗方法。

结论

自从30多年前发现CF基因以来，很明显，找到一种治疗所有CF的有效疗法仍然是一个挑战。虽然新的小分子调节剂的发现极大地促进了一些CF的治疗，但这些拯救生命的药物的有效性并不是普遍有效的，而是局限于特定类型的突变。罕见的雌性生殖道变种仍未治愈。现在，随着新的基因编辑工具的最新进展，结合ipsc衍生的组织模型和新的动物模型，新的精确基因靶向治疗CF疾病的方法将出现，并导致潜在的有效的个性化治疗。靶向致病变异的经典方法也可以被替代或与突变不可知论方法相结合，以治疗复杂的CF表型，并使用改进的临床前模型，现在可以对其进行测试。随着基因编辑技术的新进展，加上用于测试基因工程方法的先进细胞模型，这将导致针对所有CF的新疗法的快速发展。

数据和材料的可用性

不适用。

缩写

CF:

囊性纤维化

雌性生殖道:

囊性纤维化跨膜电导调节剂

F598del:

P.Phe508del

ABC转运蛋白:

三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运体

MSD1和MSD2:

跨膜域1和2

NBD1和MBD2:

核苷酸结合区域1和2

R域:

监管领域

美国手语:

气道表面液

PTC(列车自动控制系统):

过早终止密码子

NMD:

无义介导衰变

ZFNs:

锌指核酸酶

取得:

转录激活因子样效应核酸酶

双边带:

双链断裂

NHEJ:

非同源端连接

HDR:

Homology-directed修复

CRISPR:

有规则间隔的短回文重复

Cas9:

CRISPR相关蛋白

gRNA:

指导RNA

indels:

插入或删除

cbe:

胞嘧啶碱基编辑器

热?:

腺嘌呤碱基编辑器

pegRNA:

启动编辑指南RNA

广告:

腺病毒

AAV:

腺相关病毒

广告:

腺病毒

E1:

早期区域1

E3:

早期区域3

AAV:

腺相关病毒

Hd-Ad:

Helper-dependent腺病毒

FLIPR:

荧光成像板阅读器

h雌性生殖道：

人囊性纤维化跨膜电导调节剂

他:

人胚胎干

iPSC:

诱导多能干细胞

MDC1A:

1A型肌肉萎缩症

钠:

上皮钠通道

TMEM16A:

跨膜构件16A

ANO1:

Anoctamin-1

SLC26A9:

溶质载体家族26个成员9个

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致谢

这项工作得到了SickKids Foundation-CIHR IHDCYH NI20-1070和Medicine by Design (University of Toronto)资助。AC是多伦多大学夏季奖学金(2021年)的获得者;所有图片均由BioRender.com制作。

资金

适用。

作者信息

作者指出

  1. Alex Cho和Elena N. Huang对该报的贡献相同

作者及单位

  1. 发育和干细胞生物学项目，儿童医院，686湾街，PGCRL 16-9420，多伦多，安大略省，M5G0A4，加拿大

    李真阿和王美萍

  2. 加拿大多伦多大学检验医学与病理生物学系

    赵志强，黄宁，徐一鸣，Henry Quach, Jim Hu, Amy Wong

  3. 转化医学项目，儿童医院，多伦多，安大略省，M5G0A4，加拿大

    吉姆胡

作者
  1. 瑾李
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  2. 亚历克斯·曹
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  3. 黄宁
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  4. 翳明许
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  5. 亨利Quach
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  6. 吉姆胡
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  7. 黄美萍
    查看作者出版物

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贡献

J-AL:文献回顾和稿件准备，图表准备。AC:文献回顾和手稿准备。EH:手稿和图纸准备。YX:文献回顾和手稿准备。回顾文献和手稿准备。JH:审阅和编辑稿件。APW:文献审阅和稿件准备，稿件审阅和编辑。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到黄美萍。

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李,农协。，Cho, A., Huang, E.N.et al。囊性纤维化的基因治疗:精准医疗的新工具。J翻译医学19， 452(2021)。https://doi.org/10.1186/s12967-021-03099-4

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关键字

  • 囊性纤维化
  • 干细胞
  • 肺
  • 瀑样
  • 雌性生殖道
  • 替代氯离子通道
  • TMEM16A
  • 精密医学

转化医学杂志

ISSN: 1479 - 5876

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