SARS-CoV-2大流行爆发后，全球死亡人数不断增加，15个月过去了，标准的治疗方案仍未找到。
由于间充质干细胞的再生和免疫调节功能，它们可以作为缓解COVID-19主要并发症如急性呼吸窘迫综合征的合适治疗选择。然而，它们的同源外泌体作为无细胞产物的优越特性使它们在临床中更受欢迎。本文就这些新型治疗策略在COVID-19治疗中的临床现状进行综述。然后，我们深入研究了干扰rna掺入作为COVID-19基因治疗的潜力，并介绍了涉及SARS-CoV-2发病机制的靶点。此外，我们提出了miRNAs和siRNAs候选，在靶向上述目标方面有很好的结果。
最后，我们提出了一个装备外源性iRNAs的间充质干细胞来源的外泌体治疗平台，可以作为一种新的治疗方式用于COVID-19的治疗，旨在防止病毒在肺内的进一步传播，阻碍病毒的生命周期和发病机制，如免疫抑制，最终增强抗病毒免疫反应。
截至2020年12月，已报告约6700万例严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SRAS-CoV-2)感染确诊病例，其中150多万例死亡[1］．为了应对SARS-CoV-2疫情，人们提出了许多治疗方法，并对其进行了临床评估，以降低COVID-19的死亡率。然而，目前全球市场上还没有一种产品被一致批准用于治疗SARS-Cov-2阳性患者[1］．因此，开发新的治疗方法，特别是先进的治疗平台，仍然是持久的。
虽然基于基因转移的方法在疫苗设计中已被单独利用，而且多种候选疫苗目前正在临床评估中[2]，除DeltaRex-G外，还没有任何基因疗法用于COVID-19的临床测试(NCT04378244)。考虑到针对治疗目的开发短干扰RNA的广泛研究，RNA干扰可以作为SARS-CoV-2危重病例的遗传治疗方法。由于其天然特性，外泌体被认为是干扰RNA (iRNA)传递的合适载体。
从几种细胞类型中收集的外泌体显示出了诱导病毒感染患者缓解的希望，特别是SARS-CoV-2阳性个体[3.，4］．多项临床试验目前正在评估间充质干细胞(MSC)来源的外泌体在COVID-19危重患者中的应用[4］．
本文综述了基于外泌体的治疗的现状，特别是来自间充质干细胞的治疗及其作为遗传物质传递载体的前景。然后详细阐述了间充质干细胞在缓解肺部并发症，特别是COVID-19方面的免疫调节和再生能力，作为其作为外泌体来源的理由。随后，我们深入研究了正在进行的外泌体治疗COVID-19的临床研究。然后，解释了基于RNA干扰(RNAi)的基因治疗COVID-19的前景。
然后，潜在的干扰RNA候选人及其同源靶标被分为四类，前病毒microRNAs (miRNAs)，病毒基因本身，介导病毒进入和复制的宿主基因，以及在诱导过度炎症中发挥作用的宿主基因。
最后，我们描述了一个携带上述irna鸡尾酒的msc来源的分泌体的管理管道，作为COVID-19危重患者的一种新的治疗方法。
通过呼吸进入肺部后，SARS-CoV-2主要侵入并破坏肺上皮细胞。释放的病毒分子结构然后通过模式识别受体(PRRs)识别肺部固有免疫细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞。然后触发局部免疫反应，产生炎症细胞因子和趋化因子，吸引其他免疫细胞，包括T淋巴细胞和单核细胞。在正常情况下，随后的抗病毒免疫反应会在病毒广泛扩散到全身之前以最小的损害将其消灭。然而，某些个体异常的超炎症反应导致促炎细胞因子突然释放过量，这一过程被称为“细胞因子风暴”[5，6，7］．累积报告将COVID-19的严重程度与促炎介质水平过度升高联系起来，包括白细胞介素1 (IL-1)、白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)以及多种药物，其他地方报道了这些药物的列表[8，9，10，11］．由于细胞因子风暴，血液循环免疫细胞，包括中性粒细胞和T淋巴细胞，被大量招募到肺中，导致严重的组织损伤，从而导致肺损伤。肺损伤可能发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，这是COVID-19患者发病的主要原因[12］．
骨髓间充质干细胞因其在遇到高度炎症环境时的免疫调节和组织修复方面的深刻表现而闻名，特别是在肺部。这些细胞通过细胞与细胞的直接相互作用或通过潜在介质的旁分泌释放发挥其免疫调节和修复作用，这些介质包括细胞的迁移元件、免疫调节剂、抗凋亡因子和血管生成介质[13，14，15］．
它们通过抑制T淋巴细胞增殖和将Th1炎症细胞和T调节细胞之间的平衡转向后者，将免疫系统状态从炎症模式转向调节模式[16，17］．它们还诱导促炎M1巨噬细胞转化为抗炎M2巨噬细胞，这反过来导致中性粒细胞浸润肺的减少[18，19］．据报道，间充质干细胞还能抑制树突细胞的成熟和活化，并阻止自然杀伤细胞的功能和增殖[74]，并阻止树突细胞(DC)的成熟和活化[20.，21］．
在调节肺内的免疫反应后，它们通过逆转肺功能障碍和阻止肺纤维化来促进受损组织的再生[22］．这些双重有益的治疗机制为MSCs进入COVID-19治疗的多项临床研究铺平了道路[23］．
虽然少量研究证明了MSCs治疗的安全性和有效性，但SARS-Cov-2感染MSCs的可能性尚不清楚。最近国内的一项研究表明，病毒进入的两种重要受体ACE2和tmprss2在MSC细胞上不表达，而注射MSC也没有诱导其他类型细胞感染的作用[24］．本研究结果揭示了基于msc的治疗COVID-19患者的安全性。
尽管间充质干细胞具有巨大的益处，但利用它作为免疫调节和再生剂并非没有局限性，特别是当通过静脉途径给药时[25］．例如，这些细胞可能被困在毛细血管水平，几乎可以从循环中清除，其中一小部分在到达目标部位的过程中存活[26，27］．因此，为了有效地将细胞运输到目标位置，需要管理和监控足够的细胞数量，这可能是一个消耗资源的过程[28］．此外，间充质干细胞表达组织因子(TF/CD142)，引起对血栓栓塞事件的关注[25］．
自第一份报告以来近三十年后[29]，外泌体现在被认为是细胞-细胞通信的重要介质[3.，29，30.，31］．它们也是基础细胞生物学和病理学的关键参与者，包括癌症[32]和心血管疾病[33］．外泌体是细胞外囊泡，起源于内吞，几乎由每种细胞类型分泌，通常大小在30-100纳米[30.］．它们携带大分子，包括脂质、蛋白质和核酸(主要是RNA)，它们的组成取决于它们的亲本细胞[3.，4，29，30.，31］．
含有生物活性大分子的分泌外泌体可以通过两种不同的机制将它们的货物运送到目标细胞。首先，在与细胞表面受体选择性结合后，外泌体被认为可以转导特定的细胞内信号，从而诱导受体细胞的生理变化[34］．第二种机制是通过与细胞膜融合，将外泌体内内容物如mRNA和mirna直接转移到受体细胞[35］．
从药物方面来看，外泌体在以天然形式使用时表现出治疗潜力。例如，来自受刺激血小板的外泌体在闭塞性血栓抑制方面表现出了优越的效率[36］．此外，mcs衍生的分泌体(稍后将讨论)显示出作为天然细胞外囊泡的广泛能力，包括在皮肤、肌肉、心脏和骨骼损伤中的再生功能[37］．然而，如后文所述，外泌体可被操纵为纳米载体，将各种药物货物，包括非编码rna (ncrna)，也递送到感兴趣的细胞[38］．
目前的大流行使许多研究人员对外泌体作为对抗COVID-19相关疾病的有效和安全疗法的适用性产生了兴趣。截至2020年11月，已在clinicaltrials.gov上提交了7项临床试验，以评估基于外泌体的治疗方案对SARS-CoV-2阳性患者的安全性和/或有效性(表2)1）.
msc来源的外泌体可被视为一种替代方法，因为它们被反复证明在不同的情况下(包括肺部并发症期间的高度炎症情况)发挥类似的免疫调节和再生作用[39，40，41，42，43，44，45］．尽管msc对COVID-19治疗有效力，但与细胞源性外泌体相比，msc源性外泌体在临床中是更好的选择。虽然它们会导致相同的结果，但msc衍生的外泌体作为一种无细胞产物更稳定，更容易存储，且免疫原性更低[37]，使其成为治疗多种疾病的绝佳替代品，包括肺损伤[46］．此外，这些天然产品的成本效益使它们成为治疗流行病的优良选择。特别是在欠发达国家，缺乏适当的设施阻碍了任何基于细胞的疗法的使用，而更容易将外泌体作为冻干粉输送，增加了它们在这些地区的可及性[47，48］．与基于细胞的疗法相比，外泌体的另一个优势是，也可以通过吸入非侵入性给药[49]，降低了剂量，防止了静脉注射的成本和副作用。
在中国瑞金医院的一项I期试点研究中，首次通过气溶胶吸入(NCT04276987)给SARS-CoV-2肺炎重症患者使用异体脂肪MSC-derived exosomes (MSCs-Exo)。据报道，这项研究已于2020年7月完成，但研究结果尚未公布。在另一项正在进行的健康志愿者平行临床研究中，如金医院评估了上述外泌体雾化吸入的安全性和耐受性，并确定了临床剂量参考(NCT04313647)。
在2020年4月进行的I期前瞻性非随机开放标签队列研究中，Direct Biologics证明了其产品ExoFlo™的安全性和有效性。该产品由异基因骨髓间充质干细胞来源的外泌体制成，已在24例患有中重度ARDS的COVID-19重度患者身上进行了测试。单次静脉注射ExoFlo无不良事件，存活率为83%，氧合恢复，绝对中性粒细胞计数和淋巴细胞减少显著改善，急性期反应物包括c反应蛋白、铁蛋白和淋巴细胞减少d二聚体(4］．因此，计划开展一项II期多中心随机双盲安慰剂对照试验研究(EXIT COVID-19)，评估ExoFlo治疗COVID-19患者中重度ARDS的潜力(NCT04493242)。
2020年7月，俄罗斯启动了一项研究，评估气溶胶吸入外泌体治疗因新型冠状病毒肺炎住院的重症患者的疗效，加入了针对细胞因子释放综合征介导的ARDS (NCT04491240)的msc来源的分泌组的竞赛。
但值得注意的是，骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗在新冠肺炎中的应用还存在障碍。这些障碍包括开发已建立的隔离方法、装载、实时监测贩运以及外泌体的潜在脱靶效应。例如，通过将新型配体附着在目标组织上，可以增强这些递送工具的靶向疗效[50］．此外，与MSC给药类似，外泌体的促凝成分是需要关注的一个主要方面。COVID-19患者存在高凝状态(如弥散性血管内凝血(DIC)和血栓栓塞)的风险，在服用一些MSC产品后，已报道了这些不良反应[25，51］．因此，在临床环境中，需要监测患者的凝血状态，并采取预防措施。最后，由于当前大流行的复杂性以及不断增长的全球需求，开发强大的物流以一致的方式提供充足和高效的间充质干细胞和外泌体作为产品至关重要，但也具有挑战性。
来自其他细胞的细胞外囊泡也为COVID-19治疗的临床研究铺平了道路。CSTC-Exo是一种基于病毒特异性T淋巴细胞衍生的外泌体的产品，在激活和共刺激信号存在的情况下，病毒特异性T淋巴细胞暴露于病毒肽片段，在体外被激活和扩增。这些T细胞分泌的外泌体携带免疫介质，此外，它们可以作为现成的治疗方法，与基于病毒特异性T细胞的免疫疗法相比，后者主要是hla限制的。在土耳其TC Erciyes大学的一项单臂开放标记联合介入性(I/II期试验)临床试验中，CSTC-Exo正在用于sars - cov -2相关肺部疾病的早期患者。该药物正在通过计量吸入器输送，以评估其阻止疾病进展的潜力(NCT04389385)。
Zofin (Organicell Flow)是由Organicell再生医学公司开发的另一种非msc衍生外泌体药物，目前正在评估其用于治疗covid相关中重度急性呼吸综合征的1/2期临床试验的安全性和潜在疗效。Zofin是一种从人羊水(HAF)中提取的非细胞、最低限度操作产品，含有各种抗炎药物，如常见的miRNAs (NCT04384445)。
ncrna是翻译后基因沉默器，通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导序列特异性基因调控机制。在这个过程中有两种类型的RNAi介质:小干扰rna (siRNAs)和miRNAs。
siRNAs是抗病毒免疫的一部分，它针对病毒基因并使其表达沉默。最近(2018年)，fda批准了首个基于siRNA的药物(即Alnylam的Patisiran)用于治疗成人遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变(hATTR)的神经损伤，证实了siRNA的治疗潜力[52］．基于sirna的抗病毒疗法也已进入针对各种病毒感染的临床试验，包括艾滋病毒、埃博拉病毒和RSV病毒，表明尽管利用不同的机制来逃避宿主免疫，但仍可抑制各种病毒病原体的复制[53，54，55］．
MicroRNAs作为另一类RNAi，可以在更广泛的范围内调节转录后水平的基因表达[56］．在病毒感染中，宿主miRNA表达通过直接与病毒基因组结合，在控制病毒复制方面发挥重要作用[57]以及介导T细胞和抗病毒效应功能[58］．miR-32是首个靶向病毒RNA的miRNA，与逆转录病毒PFV-1转录本结合并减少病毒复制[58］．
两种模式主要涉及基于miRNA的治疗，miRNA模拟物和抗miRNA寡核苷酸。miRNA模拟传递用于恢复给定的miRNA浓度，这是疾病病理的一部分。相反，抗mirna寡核苷酸靶向危险的过表达mirna。这两种策略都在各种并发症的临床试验中得到了广泛评估[59，60］．
由于基于rnai的疗法在治疗各种肺部疾病方面显示出有希望的结果[61，62]，包括早期的SARS病毒[63]，基于rna的治疗SARS-CoV-2的药物可能成为住院患者的潜在治疗方法。
长期以来，人们已经确定SARS-CoV-2进入肺上皮的机制是由病毒刺突(S)蛋白与血管紧张素转换酶2 (ACE2)受体结合以及随后通过跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)处理引发S蛋白介导的[64，65］．新冠病毒进入细胞后，会劫持多种细胞途径和机制进行繁殖，抑制免疫反应，最终削弱宿主在病毒感染后的生存。
干预病毒病理生理学通路理论上可以通过靶向病毒基因或病毒利用的宿主基因来阻止病毒的繁殖和发病机制，主要是参与病毒进入和复制、免疫逃逸以及随后的超炎症诱导的基因。
多项研究已经揭示了针对病毒转录本和宿主mrna的候选RNAi，这些基因参与了病毒的发病机制。依赖rnai的基因表达操纵也被反复证明在一定程度上介导病毒病理生理。病毒起源的miRNAs和宿主细胞上调的miRNAs有助于病毒复制周期，也可以作为潜在的治疗靶点(图2)。1) [66］．
COVID-19中干扰rna的潜在目标。针对其基因组保守区域内的基本病毒基因会阻碍病毒的生命周期。由于病毒编码的mirna和宿主前病毒mirna有助于病毒的发病机制，它们通过抗mirna寡核苷酸的阻碍可以破坏上述机制。负责病毒进入的人类基因和被病毒劫持的基因也可以作为有希望的iRNAs目标。靶向与SARS-CoV-2临床表现(如ARDS)相关的各种炎症基因可以缓解COVID-19呼吸道并发症
SARS-CoV-2基因组有14个开放阅读框(orf)，编码27个蛋白质，其中4个为结构蛋白、1个包膜蛋白(E)、核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)。ORF1a和ORF1b区域内的15个非结构蛋白(NSPs)位于基因组的5 '端，基因组的3 '端包括8个附属蛋白和结构蛋白的序列[67］．在突变率方面，iRNAs靶向的兴趣区域应该是高度保守的，并且对病毒生命周期至关重要。N蛋白和E蛋白编码基因和RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因高度保守，编码病毒复制和传播所不可缺少的元件;因此它们可以作为合适的iRNA候选设计[68，69，70，71］．
设计siRNA是一个多功能的过程，存在多种siRNA设计方法，并已在其他地方进行了综述[72］．有几个小组一直在针对病毒基因组的保守区域开发siRNAs。通过计算分析，Lin等人引入了9种潜在的针对RdRp和N等基因的siRNAs，但其功效尚有待实验评估[73］．在另一项研究中，在78个siRNA候选中，有8个被预测能有效地靶向N和S基因[74］．主要制药公司也开始开发基于sirna的COVID-19疗法。Vir Biotechnology和Alnylam Pharmaceuticals联手评估了350个针对sars冠状病毒基因组设计的sirna，包括保守区域[75］．在各自的项目中，OilX制药公司和Sirnaomics也在探索针对病毒关键基因的sirna的潜力[76，77］．
在设计sirna时，值得考虑的是，在SARS-CoV-2进入细胞后，阳性意义的单链基因组RNA被翻译成病毒聚合酶蛋白。随后合成互补的负意义RNA，编码结构蛋白的区域和一些辅助蛋白开始作为病毒mRNA转录的模板[78，79］．因此，编码这些蛋白质的rna比ORF1a和ORF1b编码的rna具有更高的拷贝数。
因此，病毒的各种基因组位点在宿主中存在差异，因此将不成比例地成为靶向。病毒基因组前20 kb部分的基因以两种形式存在，阳性和阴性感觉链。这部分包含ORF1a和ORF1b的序列，设计针对这些位点序列的siRNA理论上会导致病毒基因组双靶向。在基因组3 '端10 kb的区域内，病毒mrna旁的负感和正感链可以通过两条siRNA链三重靶向，从而产生更高的病毒传播抑制[80］．然而，最近有证据表明，靶向基因组3 '端10 kb内的序列会降低siRNA的药效。原因可能是大量的亚基因组复制与基因组rna竞争，以结合到siRNAs和rna诱导的沉默复合体(RISC)，以进行随后的切割。因此，仅存在于基因组RNA中的ORF1被发现是对抗SARS-CoV-2基因组的最有效靶点。然而，这种更高的效率也可能是由于ORF1的二级RNA结构或核衣壳蛋白的丰度较低，使ORF1更容易接近RNAi机制[81］．研究还表明，在RNAi靶向过程中，负性基因组RNA保持不变;然而，我们相信这条链也可以通过改变siRNA链在5 '端的热力学稳定性来靶向。在这种独特的情况下，两条siRNA链之间缺乏偏好，使得Argonaute将它们都加载到RISC中，这反过来又导致同时靶向阴性和阳性意义的病毒基因组rna [82］．需要进一步的经验证据来确定RNAi机制在SARS-CoV-2基因组中的最佳靶点。
人类miRNAome已被充分探索以选择具有抗病毒基因潜力的mirna。在人类miRNA库中，有7个miRNA被预测靶向和抑制SARS-CoV-2基因，包括N [83］．在Liu等人的一项研究中，发现人hsa-miR-4661-3p靶向N基因，作为宿主抗病毒反应[84］．Adan等人还鉴定出479种针对各种SARS-CoV-2基因的人类mirna，包括N、E和RdRp [85］．Khademul Islam等人试图区分各种致病冠状病毒的表观遗传调控，鉴定出106种针对SARS-CoV-2的宿主抗病毒mirna，其中3种已显示出在感染期间具有抗病毒作用的实验证据[86］．在对SARS-CoV2基因组的综合序列分析中，确定了9个靶向SARS-CoV-2基因组的miRNAs，其中6个也靶向人类基因，包括IFNB也[87］．
大量研究发现了病毒mirna和前病毒人mirna对病毒发病机制的贡献，其中一些研究揭示了抗mirna寡核苷酸对其消融的作用。抗mirna寡核苷酸是中和感兴趣的mirna的合成寡核苷酸[88］．SARS-CoV-2基因组的计算分析预测了针对抗病毒应答介导基因的假定病毒mirna，包括参与EGF受体信号通路、凋亡信号通路、VEGF信号通路、FGF受体信号通路等途径的人类基因[89］．Liu和同事使用同样的方法预测了病毒基因组上的45个miRNAs，其中40个靶向73个人类基因中的3 ' UTR，主要参与免疫反应，11个靶向13个基因中的5 ' UTR，其中许多参与细胞骨架组织。这项研究进一步证明了病毒MR147-3p在肠道中提高了TMPRSS2的表达。一些病毒编码的miRNAs也被发现靶向编码结构蛋白的病毒基因的5 ' UTR [84］．在Adan等人的一项研究中，发现病毒mirna样寡核苷酸靶向1367个人类基因，导致免疫系统的影响无效，降低宿主转录率，有利于病毒基因表达，这种现象被称为“宿主关闭”[85］．Khademul Islam及其同事披露了170个SARS-CoV-2成熟miRNAs，这些miRNAs有可能靶向参与宿主免疫应答的宿主基因，如自噬、ErbB信号、VEGF信号、Wnt信号、FGF受体结合、t细胞介导的免疫、mTOR信号、tgf - β信号、tnf - α信号和MAPK信号[86］．
已确定的参与病毒进入、复制和发病机制的宿主基因和途径的数量正在增加，它们的靶向已被引入作为COVID-19的治疗干预手段。许多研究正在评估它们的扰动，以确定显示抗病毒影响的蛋白质和途径。
病毒通过膜结合ACE2蛋白在肺细胞上的结合介导进入，由于与病毒颗粒的内吞作用，其在被感染细胞表面的存在减少，这一事件参与了疾病的发病机制。尽管它似乎是一种令人兴奋的候选药物，但它的抑制伴随着严重的副作用。90，91］．尽管如此，抑制在病毒感染期间受到刺激的1型血管紧张素II受体(ATR1)已被证明可以改善小鼠模型的急性肺衰竭[92］．此外，TMPRSS2蛋白转换酶(PC)和组织蛋白酶B/L也有助于病毒的进入，它们的阻断被认为是一种有前景的治疗策略[65，93，94］．
Furin，即成对的碱性氨基酸裂解酶(PACE)，是另一种PC，介导S蛋白结合和融合结构域的暴露，是病毒进入细胞所不可缺少的。通过阻断SARS-CoV-2和其他具有呋喃裂解结构域的病毒的病毒进入，抑制呋喃可能具有治疗潜力。Furin蛋白抑制剂在各种病原体疾病模型中显示出有希望的结果，包括甲型流感病毒、铜绿假单胞菌和HIV。GM-CSF双shrna呋喃质粒(VP)携带两个针对呋喃的短发夹rna (shrna)，目前正在对尤文氏肉瘤和卵巢癌进行临床评估，并被提议作为一种用于抑制病毒传播和促进免疫反应的药物[95，96］．
在基于crispr的全基因组筛选实验中，Wilen等人发现了Cathepsin L，一种通过内噬作用进入病毒的介质[97]， SWI/SNF染色质重塑复合体和SMAD3蛋白，TGF-β信号通路的成员，作为新的前病毒剂，它们通过小分子抑制显示出治疗潜力[98］．基因网络表达的构建揭示了ACE2和TMPRSS2共表达的基因，并将ADK、DPP4、IL13RA2、HDAC8和CD55作为潜在的治疗靶点[99］．Krogan等人还通过构建宿主与SARS-CoV-2蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用图，鉴定出66种可药物的人蛋白或宿主因子[One hundred.］．
irna作为COVID-19治疗药物对抗上述基因的有效性的可能性尚未得到评估，据我们所知，从这个角度进行的研究只有一项。Ramakrishnan及其同事在一项研究中发现了7个候选miRNAs，这些miRNAs靶向SARS-CoV-2发病过程中受体激活和宿主蛋白劫持机制中的信号通路中的宿主编码蛋白[101］．
抗mirna寡核苷酸也可以设计为靶向宿主mirna，协助病毒发病机制。研究发现，SARS-CoV-2感染诱导的人miRNAs下调了抗病毒防御反应的多种途径，包括不同的toll样受体(TLRs) [86］．
COVID-19的临床表现之一是病毒诱导炎症，导致ARDS。在此综合征之前，炎症参数显著升高，如c反应蛋白(CRP)水平，血清铁蛋白，红细胞沉降率，和d-二聚体作为促炎细胞因子增加的结果[102］．
炎症反应通常包括四个步骤:PRRs识别刺激、炎症通路激活、炎症介质释放和免疫细胞招募到炎症部位。损伤相关分子模式(DAMPs)和病原体相关分子模式(PAMPs)与PRRs如TLRs和nod样受体(NLRs)结合后，多种炎症通路中的转录因子，包括核因子κB (NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Janus激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)通路转运进入细胞核，上调各种炎症细胞因子和趋化因子的表达。少量炎症因子如CRPs、高迁移率基盒蛋白1 (HMGB1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶-1 (GPx)、NADPH氧化酶(NOX)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2 (Cox-2)从受病细胞中释放出来，并通过与炎症受体结合促进炎症[103］．涉及肺部疾病的无数炎症信号级联已被表征，其中一些对SARS-CoV-2的发病机制具有概念证明作用。
Cox-2合成前列腺素以响应细胞因子并介导炎症和组织损伤。其启动子包含对NF-kB和IL-6的调控反应元件，而SARS-CoV N蛋白先前已被证明可诱导其表达[104，105］．尽管在最近的一项临床试验中，针对非甾体抗炎药的Cox-2在治疗COVID-19患者中表现出了安全性[106]，其在肾脏中的自然表达对其系统性阻断造成了重大缺陷，使其局部抑制成为最佳情况[96］．
尽管在COVID-19中缺乏irna介导的Cox-2沉默的经验，但它的敲除和随后的炎症调节已被广泛研究用于其他疾病，包括癌症和肝纤维化。在Espisni等人的一篇综合综述中，提供了分析各种siRNAs和miRNAs的研究列表[107，108］．在另一项研究中，miR-146a被证明特异性抑制肺上皮细胞中的Cox-2 [109］．
在MAPK信号组中，p38 MAPK通路在SARS-CoV-2感染期间异常上调，导致促炎细胞因子如IL-6、TNF-α和白细胞介素1β (IL-1β)的产生。多项临床研究正在评估p38抑制剂对多种并发症的影响[110］．许多研究评估了siRNA在各种疾病中p38下调的候选者，包括乳腺癌，在缺血-再灌注损伤肺移植模型中，更重要的是，肺腺癌和所有癌症都已被证明是导致炎症改善的有效抑制因子[111，112，113］．
一些miRNAs也证明了下调p38的有效性，并可作为治疗候选。为了揭示三种抗病毒miRNAs (miR-124、miR-24和miR-744)的作用机制，p38被确定为多种病毒感染中普遍存在的抗病毒靶点，包括流感和呼吸道合胞病毒(RSV)感染[114］．在ARDS引起的早期肺纤维化小鼠模型中，miR-200b/c过表达伴随p38 MAPK和TGF-β/smad3信号通路的抑制和ARDS的缓解[115］．在慢性炎症大鼠模型中，携带miR-16的载体管理通过抑制p38激活缓解炎症诱导的疼痛[116］．miR-375被发现通过阻断p38来阻止肌成纤维细胞的转分化和胶原合成，这是肺纤维化的一个关键病理生理过程[117］．
NF-kB已多次被证明可调节炎症并导致炎症引起的肺部并发症，包括ARDS [118］．NF-kB是一种已知的SARS-CoV发病机制中的转录因子。它被病毒元素激活，包括N蛋白[119越来越多的证据表明，在COVID-19中也存在同样的特征。DAMPs与TLRs和细胞因子受体的结合触发NF-kB。它的激活上调了促炎因子，包括IL-1b, IL-6和TNF-a，导致并发症，如细胞因子释放综合征CRS和促炎免疫细胞募集。这些细胞因子以反馈-阳性循环的方式诱导NF-kB的进一步激活[120，121］．
作为众多炎症细胞因子和趋化因子的重要调节因子，靶向NF-kB转录因子同时抑制多种促炎级联反应，是一种较好的治疗候选药物。越来越多的证据表明，NF-kB抑制在冠状病毒介导的SARS治疗中的潜力，因为在SARS- cov动物模型中，NF-kB抑制增加了其生存期，降低了促炎剂的表达[122］．RECOVERY临床试验(NCT04381936)的初步结果也认可了NF-kB抑制的基本原理，其中具有NF-kB抑制作用机制的化学物质地塞米松可显著减少COVID-19危重患者[123，124］．
研究人员设计并证明了多种sirna可有效下调NF-kB或NF-kB信号通路成员，并随后降低各种肺部环境中与炎症途径相关的NF-kB调控基因的表达，包括小鼠脓毒症诱导的急性肺损伤模型、大鼠脂多糖诱导的急性肺损伤模型、肺癌细胞[125，126，127，128］．
已经发现了大量的miRNAs，它们在各种器官和方式中下调NF-kB通路。几篇论文列出了在癌症中表达水平改变并影响这一途径的主要miRNAs，其中一些可作为治疗候选[129，130］．在肺部并发症方面，研究表明，上调miR-140-5p可通过靶向TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制急性肺损伤中炎症细胞因子的产生[131］．miR-23b簇和miR-125a-5p被证实沉默KRAS和NF-kB通路的多个成分，从而抑制肺肿瘤的发生[132］．MicroRNA-26b通过调控NF-κB/MMP-9/VEGF通路抑制肺癌转移[133］．miR-449a通过阻断hmgb1介导的NF-κB信号通路抑制肺癌侵袭[134］．
长期以来，人们认为干扰rna介导的病毒防御机制主要局限于真菌、无脊椎动物和植物。然而，动物病毒也被发现受到宿主rna介导的抑制。因此，在宿主和病毒之间的进化军备竞赛中，病毒也进化出了消除rnai介导的细胞抗病毒防御的方法。这些机制下的病毒蛋白被称为RNAi抑制因子。除了以各种方式在病毒生命周期中发挥作用外，这些蛋白质还操纵组蛋白和DNA甲基转移酶作为宿主转录基因沉默机制的组成部分，以抑制细胞抗病毒沉默机制[135］．许多哺乳动物病毒，如艾滋病毒和埃博拉病毒，被发现编码rna阻断蛋白[136］．在SARS-CoV病毒中也发现了这种RNAi抑制基因;一种来源于ORF7a，另一种是SARS-CoV的结构核衣壳蛋白[137，138］．考虑到两种病毒的同源性，在SARS-CoV-2中，7a和N蛋白极有可能也是RNA干扰抑制因子[139］．Karjee等人还建议，完整的RdRP和刺突蛋白都可能是SARS-CoV-2基因组中的候选RNAi抑制子，这是基于这些蛋白质中共享的基元和一个常见的RNAi抑制子子集[136］．这种RNAi抑制因子可能会限制使用RNAi技术对抗SARS-CoV-2的效率。因此，针对它们可以被视为一种对抗病毒的战略。
利用外泌体作为药物传递系统于2011年被提出[140]，迄今为止，由于外泌体体积小，能够逃脱免疫系统，细胞骨架可变形，与细胞膜相似，以及微负zeta电位，使它们能够在体内循环更长的时间，它受到了广泛的关注[140］．非编码rna是非常适合外泌体的货物，可以靶向特定途径以减少各种疾病的炎症，包括肺损伤[141］．
由于MSC分泌的外泌体具有再生功能，是心脏缺血、肝纤维化、脑血管疾病等多种疾病的理想外泌体来源。由msc衍生的外泌体传递的mirna的治疗作用也已被少数研究证实[142，143］．
在COVID-19中，与其他传染病类似，免疫细胞利用携带mirna的外泌体靶向被感染细胞的病毒RNA。因此，通过msc来源的外泌体进一步递送专门设计的ncrna可以加速对抗SARS-CoV-2并诱导组织再生[144］．为了评估宿主细胞外泌体内iRNAs的抗感染能力，Moon等人公布了msc衍生的细胞外囊泡的抗sars - cov -2 mirna含量[144］．本研究在一定程度上揭示了msc来源的外泌体作为核酸治疗载体在COVID-19中的作用机制。
为了将上述来自msc的外泌体的抗covid -19作用与对抗SARS-CoV-2发病机制的irna结合起来，应从msc收集的外泌体中装载感兴趣的irna。多种来源的间充质干细胞可作为外泌体供体，包括脐带、骨髓和脂肪组织[145］．主要是通过直接将核酸插入外泌体或从转基因间充质干细胞中收集小rna来装载外泌体(图。2）.
携带irna的外泌体从间充质干细胞生产的管道。治疗性携带irna的外泌体可以通过两种方式产生。编码感兴趣的miRNA或/和shRNA的质粒可以转移到间充质干细胞中，随后将收获并富集含有irna的外泌体。或者，合成的mirna模拟物或/和sirna或/和反mirna寡核苷酸可以化学地插入msc衍生的外泌体中，然后收集和分离由此产生的负载外泌体。由此产生的两种外泌体都将被用于COVID-19危重患者
当外源合成时，sirna、miRNA模拟物和抗miRNA寡核苷酸可以通过电穿孔、脂质体转染、超声处理、氯化钙、共孵卵或皂素渗透转移到外泌体中[146，147］．多项研究报告了外源性irna成功递送到msc衍生的外泌体中，并观察到预期的功能[148，149，150，151］．
另一种方法是，细胞细胞质中irna浓度的增加与它们在外泌体中拷贝数的增加相伴而生[152］．在这方面，MSCs可以通过转染或转导来表达感兴趣的shRNA或miRNA。释放的外泌体可以在验证所需小rna的存在后被分离出来。该方法已在少数报告中证明了适用性[153，154，155，156］．
多项临床试验正在评估骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞来源的外泌体在缓解危重患者COVID-19症状方面的疗效。富集携带外源性irna的msc衍生外泌体用于COVID-19治疗是一种前所未有的策略，尚有待于在临床环境中开发。正确的irna组合不仅可以阻止病毒在已经感染的细胞中的传播、炎症诱导和免疫逃逸，还可以阻止病毒颗粒进入未感染的细胞，以及病毒在肺组织内的进一步扩散。
不适用。
间充质干细胞
严重急性呼吸综合征冠状病毒2
2019冠状病毒病
RNA干扰
小分子核糖核酸
小干扰rna
模式识别受体
树突细胞
包括非编码rna
人类羊水
RNA干扰
遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性
峰值蛋白质
血管紧张素转换酶2
跨膜丝氨酸蛋白酶2
开式阅读架
信封的蛋白质
核衣壳蛋白
基质蛋白
非结构蛋白
依赖RNA的RNA聚合酶
1型血管紧张素II受体
蛋白质转化酶
配对碱性氨基酸裂解酶
短发夹rna
toll样受体
c反应蛋白
Cyclooxygenase-2
损伤相关分子模式
病原体相关的分子模式
点头样受体
核因子B
丝裂原活化蛋白激酶
Janus激酶信号换能器和转录激活剂
高迁移率群盒蛋白
谷胱甘肽peroxidase-1
NADPH氧化酶类
诱导型一氧化氮合酶
白介素1
肿瘤坏死因子α
急性呼吸窘迫综合征
白细胞介素1
呼吸道合胞病毒
细胞因子释放综合征
超氧化物歧化酶
rna诱导沉默复合体
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