中国散发性扩张型心肌病患者的靶向下一代测序基因分析

背景

遗传性扩张型心肌病(DCM)约占特发性DCM病例的25%，在家族性DCM患者中这一比例甚至更高。大多数研究都集中在家族性DCM，而中国散发性DCM患者的遗传特征仍不清楚。

方法

2018年6月至2019年9月，本研究纳入了24例无家族史的特发性DCM患者。所有患者都使用靶向下一代测序技术进行了80个dcm相关基因的基因筛查。

结果

通过芯片分析，99个检测到的变异中有10个被认为是致病或可能致病的，包括7个TTN截断变量(TTNtv)，帧内删除TNNT2，一个错义突变RBM20,一个移码缺失变体FLNC．在这些变种中，有8种是首次报道的。

结论

利用有针对性的下一代测序，确定了特发性DCM的潜在遗传原因。在中国散发性DCM队列中，肌节突变仍然是遗传性DCM最常见的遗传原因。

扩张型心肌病(DCM)是一组导致心室扩大和收缩障碍的心肌疾病。2002年分层抽样调查中DCM在中国的发病率为190 / 100万，2014年另一份报告中5年死亡率分别为~ 50% [1］．DCM的病因是多种多样的，包括明确的原因(例如，缺血损伤)和未知的危险因素;后一种情况被称为特发性DCM。几十年前，随着基因技术的迅速发展，基因突变被发现是导致dcm20的直接原因。此外，在8-25%的特发性DCM患者中发现了基因突变[2］．与散发性病例相比，有DCM家族史的患者更有可能具有遗传病因。与肥厚性心肌病不同，DCM的遗传病因是高度异质性的。由于高通量测序技术，超过50个dcm相关基因已被鉴定[3.，4］．最常见的传播方式是常染色体显性，其次是常染色体隐性、x连锁和线粒体遗传。大多数基因编码肌节、细胞骨架或核层的组成部分。然而，很少有基因变异被可靠的实验数据证明是致病的[5］．了解DCM的遗传背景，可以为DCM精准医疗的发展提供新的发病机制。以往的研究大多集中在家族性DCM的遗传筛查上。基于这些研究，目前推荐家族性和/或年轻DCM患者进行常规基因筛查。此外，散发性DCM的遗传特征还有待进一步研究。目前的研究旨在发现一组中国患者中散发的特发性DCM的遗传背景。

纳入和排除标准

本研究纳入了2018年6月至2019年9月期间诊断为特发性DCM的患者。特发性DCM的诊断标准与AHA科学声明和ESC工作组立场声明所描述的指南一致[3.，6］．

排除标准包括由缺血性心脏病、高血压、瓣膜疾病、内分泌疾病(如糖尿病性心肌病和甲亢性心肌病)、炎症、毒性和应激引起的围生期心肌病和继发性扩张型心肌病。在最近发表的一项研究中，Ware和他的同事们发现DCM和酒精性心肌病之间有相似的特征良好的DCM引起基因的遗传谱[7］．因此，过量饮酒的患者没有被排除在研究之外。

受试者和临床评价

在研究期间，广东省人民医院心内科共纳入24例无关联患者。收集患者入组时的临床资料，包括病史、家族史、体格检查、血液检查、12导联超声心动图(ECG)、经胸超声心动图和/或心脏磁共振成像。

本研究得到广东省人民医院伦理委员会的批准，符合《赫尔辛基宣言》的原则。所有入选患者均知情同意。

DNA样本采集和定向下一代测序(NGS)

采集纳入患者及其亲属(如有)的外周静脉血，用于基因组DNA分离。根据制造商的协议，使用磁性通用基因组DNA试剂盒(TIANGEN)提取DNA。为了覆盖DCM相关基因的编码序列区域和侧边序列(相邻的内含子区域对剪接至关重要)，定制了179个与遗传性心脏病相关的基因(包括80个与遗传性DCM相关的基因，见附加文件)1)用于目标序列库。建议将每个制备文库的基因组DNA片段在180-280 bp和500 ng之间进行混合捕获。使用IDT xGen Exome Research Panel v1.0试剂盒制备扩增子库和混合捕获，该试剂盒按照制造商的说明进行。爱荷华州,美国)。用量子比特2.0荧光计(Invitrogen;赛默飞世尔科学公司)。NGS采用诺华基因技术有限公司(北京，中国)的Illumina NovaSeq 6000系统(Illumina，美国)。收集测序数据并进行质量筛选(详见附加文件)2:图S1)。结果数据随后使用Burrow-Wheeler Aligner与人类参考基因组组装(2009年2月，GRCh37/hg19)进行比对。使用SAMtools检测单核苷酸变异和插入和删除(indels) [8]和内部过滤管道(附加文件2:图S1)。至少99%的目标碱基测序的读深度超过20倍。

变体注释和分类

使用基因组分析工具包CNVkit鉴定变异，并用ANNOVAR (http://wannovar.wglab.org/)．所有变异均经传统Sanger测序证实。通过基因数据库，包括dbSNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、千人基因组计划(http://www.internationalgenome.org/category/dbsnp/)、ExAC (Exome Aggregation Consortium)数据库(详细信息请参见附加文件3.)．使用生物信息学程序SIFT (http://sift.jcvi.org/)、Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，以及MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/)．根据美国医学遗传学与基因组学学院(ACMG)和分子病理学协会(AMP)的指导方针，对某一变异的致病性定义如下:致病性(P)、可能致病性(LP)、意义不确定的变异(VUS)、可能良性(LB)和良性(B) [9］．

临床特点

本研究纳入的24例无关患者中，男性19例，女性5例;DCM的平均发病年龄为40岁。这些患者均无心肌病或猝死家族史。未发现心外特征。高达25%的病例有传统的心血管危险因素，如吸烟和高血压。在这些病例中，87.5%有III或IV级心力衰竭功能。入组时平均左室射血分数(LVEF)为27.0±9.9%，平均左室舒张末期尺寸为70.1±7.8 mm。血清n端b型利钠肽中位数为2057.5 pg/mL，范围为698 ~ 18381 pg/mL。关于心律失常，20%的患者有室性心动过速[8%，植入式心律转复除颤器(ICD)]、房颤(8%)或束支传导阻滞(4%)。大多数患者接受指导下的药物治疗。 The patient clinical presentations are summarised in Table1．

的遗传变异

总共鉴定出分布在27个dcm相关基因上的99个变异。所有的变异要么在1000基因组计划和ExAC计划中等位基因频率< 1%，要么在本地数据库中找不到。根据硅片分析和ACMG指南，10例患者的10个变异被认为可能致病或致病。其他被分类为VUS或良性的变异没有包括在进一步的分析中(详细信息在附加文件中提供)4)．致病变异是帧内缺失导致编码序列中的氨基酸缺失TNNT2．其他可能致病变异的突变类型为:3个无义突变和4个移码小缺失，位于TTN，一个错义突变RBM20,其中一种移码小缺失变体FLNC．所有突变均为杂合。突变TTN是这组散发性中国DCM患者中最常见的变异。关于假定致病性/可能致病性变异的详细信息汇总在表中2．

此外，可以对3名患者的亲属进行检测到的突变的Sanger测序。对于患有RBM20错义突变，他父母都有野生型等位基因，说明是新生突变。15号病人，杂合无义突变的携带者TTN他有两个女儿;大女儿表现出与指示病人相同的突变，另一个是野生型。病人的框架内缺失TNNT2在指标住院期间死亡;他的母亲和叔叔都是同一基因的杂合子TNNT2突变，并在入学时保持健康。

突变TTN是目前中国散发性DCM患者群体中最常见的变异。连同一个TNNT2这种特发性DCM队列的遗传原因似乎与肌节突变有关，这与先前的报道一致[4，10，11］．然而，MYBPC3在该队列中未检测到其他肌节基因。

变异的TTN

的TTN该基因编码肌节蛋白肌动蛋白，是继肌球蛋白和肌动蛋白之后含量第三多的横纹肌蛋白。两个极性相反的肌肽分子横跨心肌的收缩单位肌节。此后，正常表达TTN是肌节组装和作为一个收缩单位的功能所必需的。肌肽是一种大的人体蛋白质，由大约34000个氨基酸组成。肌肽根据不同剪接方式有不同的异构体，其中N2BA和N2B异构体主要在成人心肌中表达。N2BA异构体比N2B更长、更顺从，在胎儿和新生儿心脏中大量存在。在发育过程中，主要表达一种更小、更硬的N2B亚型。因此，肌肽异构体的比例在调节心脏舒张功能中起着关键作用[12］．

TTN据报道，杂合突变是DCM的主要遗传原因[13，14］．赫尔曼和他的团队揭示了这一点TTN截断变异体(TTNtv)是DCM的常见病因，据报道在家族性特发性DCM和散发病例中的发病率分别约为25%和18% [10］．然而，并非所有TTNtv基因都具有致病性。据报道，TTNtv发生在总人口的约2% [15］．dcm相关突变通常富集在titin a带，该带靠近蛋白质的羧基端，并且在大多数异型中高度保守(附加文件)5:图S3)。也就是说，TTNtv的临床意义主要通过外显子的使用和变异位置来预测。此外，体外分析表明，iPS细胞来源的心肌细胞中突变的截断titin蛋白导致肌节功能不全和细胞信号激活受损，这可能是dcm相关TTNtv的潜在机制[16］．然而，TTNtv导致DCM的确切机制尚不清楚。

在我们的研究中，TTN24例患者中有7例检测到截断变异;其中包括4个移码缺失和3个无义突变。除Arg26949* (rs748689777)外，首次报道了6个变异。Arg26949*变异在DCM和围生期心肌病中均有报道[10，17］．它位于肌肽的a带区，与dcm最相关TTN截断突变是聚类的。在6个新突变中，4个聚集在a带，另外2个突变位于i带区的195外显子。除了在硅功能预测中，没有这些变异的功能分析可用。根据Roberts等人的致病性预测模型。TTNtv影响高表达外显子在DCM患者中有93%的致病性[15］．另一项针对几个大型DCM队列的研究证实了TTNtv在DCM患者中的致病性预测模型[18］．外显子195在i带高度表达。因此，结合内硅分析，我们假设所有7个TTNtv基因都可能致病。

值得注意的是，在一个小队列中观察到TTNtv位置和患者表型之间存在关联。羧基末端TTNtv截断主要亚型的患者可能出现严重的左心室功能受损和危及生命的室性心律失常[15，19］．然而，在一项包括83例携带TTNtv的DCM患者的更大规模前瞻性研究中[20.]， TTNtv的位置与表型的严重程度无显著关系。此外，TTNtv患者除了发病年龄较早、家族DCM阳性病史比例较高、室性心动过速发生率较高、传导疾病较少外，在临床特征或心血管死亡、心律失常事件、心力衰竭等中期心脏结局方面与非TTNtv患者无显著差异。

本研究中，7例TTNtv携带者均在30岁以后出现心力衰竭临床症状，平均发病年龄在42岁左右。平均LVEF为26.6±6.8%，平均LVEDD为68.4±2.7 mm。在7名TTNtv携带者中，6名有III或IV级心衰功能。未发现心外特征或室性心律失常。关于心律失常，一名患者在入组时有心房颤动，另一名患者有完全性右束支阻滞。TTNtv携带者和无TTNtv携带者在发病年龄、LVEF和LVEDD方面无显著差异(见附加文件)6:表S3)。但TTNtv携带者均为男性，且均无室性心动过速，这与既往报道不一致[10，20.］．作为一个小群体，基因变异和临床特征之间的关系不应该被过度解释。Gln16316*突变的患者有两个女儿;携带相同TTNtv突变的大女儿8岁，未检测到心脏异常。因此，所有检测到的TTNtv的外显率为87.5%，低于以往报道的95%的外显率[10，15］．这可能是由于在这项研究中进行基因筛查的年龄较低，其中4人在40岁之前完成了基因检测。

TNNT2突变

从第一个DCM谱系开始TNNT2自2000年以来，肌钙蛋白复合物突变在遗传性DCM发病机制中的作用已被广泛探讨。在一项特发性DCM的大型遗传研究中，家族性DCM中肌钙蛋白复合物突变的总频率为6% [21］．TNNT2编码肌钙蛋白T，这是肌钙蛋白复合物的一个亚单位，在产生心脏收缩力中起着重要作用。本研究中致病突变K217del(也称为p.K210del)导致肌钙蛋白T蛋白中一个赖氨酸缺失，导致蛋白功能明显异常。此前在不同的家族性DCM谱系中也有报道[21，22，23，24］．突变导致位于13外显子的赖氨酸缺失，13外显子是一个保守且功能重要的结构域，参与与其他肌钙蛋白亚基或原肌凝蛋白的相互作用[21］．功能分析表明，突变蛋白降低了Ca^{2 +}心肌收缩敏感，导致肌节发力不足[25］．此外，介绍了TNNT2小鼠中K217del突变导致DCM表型的诱导，生存率降低[26］．

在大多数谱系中，突变等位基因与DCM表型共分离良好，并被认为是在不同种族的DCM患者中观察到的一种复发突变[21，22，27］．虽然大多数K217del携带者表现为早发性(通常在30岁之前)和侵袭性DCM甚至猝死，但少数患者的症状较轻，他们一直活到六七十岁[22，23］．在我们的研究中，K217缺失的患者TNNT214岁出现急性心力衰竭，心源性休克发作后迅速恶化。经过一个多月的先进医疗支持，包括IABP和通气，他最终没有活下来。我们采集了他父母和叔叔的血液样本进行基因检测，结果显示母亲和叔叔都携带了与先证者相同的突变。对两名突变携带者进行了进一步的临床评估，但未发现心脏异常。因此，遗传性DCM的基因型-表型关系是复杂的，即使在肌钙蛋白T心肌病中也是如此，它通常表现为一种侵袭性和早发性疾病，伴有相当高的死亡率。

RBM20变体

RBM20编码RNA结合基序蛋白20,SR蛋白家族(丝氨酸/精氨酸丰富蛋白)的成员，在心脏中高度表达，并通过处理前信使RNA调节替代RNA剪接(附加文件)7:图S4)。事实上,RBM20调节一组基因的剪接，包括TTN，而这些靶蛋白是正常心脏结构和信号转导所必需的[12］．根据已发表的大型队列研究，RBM20突变约占所有DCM病例的3% [28，29］．

bruch等人首次报道了五种独特的RBM20在8个谱系中与DCM共分离的突变。他们发现所有5个突变都聚集在9号外显子内，编码一个RS-rich结构域(RS蛋白的一个主要结构域，富含精氨酸-丝氨酸重复序列)。改变的氨基酸残基(残基634、636、637和638)在不同物种中高度保守，被证明是突变热点[28］．此外，Filippello和他的同事发现491-658氨基酸有助于RBM20核定位和选择性剪接的正常功能[30.］．一项在RBM20中存在误义突变S635A的体内功能分析显示，突变的RBM20改变了肌肽异构体的表达，导致产生异常的高分子量肌肽异构体，从而促进心脏舒张功能和纤维化[31］．在我们的研究中，在一名17岁时出现心力衰竭的患者中发现了P638S突变。双亲对该变异的筛查均为阴性，表明为新生突变。突变热点处发生突变残基RBM20．虽然这种氨基酸变化是首次报道的，但在相同的残基上，如P638L，也有错义突变的报道[28］．由于功能分析表明突变体P638L丧失了功能[31]，结合ACMG标准，假设P638S可能致病。

DCM患者携带致病性RBM20据报道，与没有明确遗传原因的突变相比，突变具有较早的疾病发作[28］．此外，男性带菌者往往病情进展迅速，三分之一的受感染病例突然死亡或出现室性心动过速[32］．然而，超过30%的突变携带者经基因筛查无症状，且大多数突变携带者比其受影响的先证者年轻，提示年龄依赖外显率为RBM20突变。在本研究中，P638S突变体患者在青少年时期出现心力衰竭，与既往报道一致[28，32］．在指标住院期间，未观察到室性心律失常。

FLNC突变

FLNC编码蛋白丝蛋白C，交联肌动蛋白丝，构成心脏和骨骼肌细胞广泛的网络(附加文件8:图S5)。在心肌细胞中，丝敏C蛋白高度表达，参与肌节和细胞膜之间的机械和信号转导[33］．FLNC突变首先被认为是导致骨骼肌纤维肌病的遗传缺陷。作为~ 30%的受影响肌纤维肌病患者携带FLNC骨骼肌病和不明形式的心肌病均有突变[34]，为FLNC自2012年以来，突变已被纳入遗传性心肌病的遗传诊断。ortizz - genga等人筛查了2877例被诊断患有不同遗传性心血管疾病的患者FLNC在28个先证物中鉴定出23个截断突变[35］．其中20例被诊断为DCM, 7例为心律失常性心肌病。流行FLNCDCM患者的突变率为3.9%。这些患者均无骨骼肌病变。然而，在大多数受影响的患者中观察到明显的左心室收缩功能障碍、心肌纤维化主要影响左壁以及室性心律失常的高负担(约82%)的特定表型FLNC删除突变。观察到的这些临床特征FLNC截断突变在另一项319个DCM家族的遗传研究中得到证实，其中确定了13个DCM家族FLNC截断型携带者，85%有室性心律失常或心源性猝死[36］．此外，组织学研究发现右心室心脏间质纤维化，左心室纤维脂肪浸润，在一定程度上类似于心律失常性右室心肌病。除了DCM，还有一些FLNC突变也与肥厚性和限制性心肌病有关[37，38］．然而，与肌纤维肌病的情况一致，导致肥厚性心肌病(HCM)或限制性心肌病(RCM)的变异多为错义突变。患者心肌组织免疫组化染色FLNC截断显示没有异常的细胞质丝蛋白C聚集物，这在肌原性肌病以及HCM和RCM患者中有描述，但显示正常丝蛋白C水平下降[35，36，37，38，39］．因此，对的潜在机制提出了单倍不足假说FLNC提出了截断突变。

的FLNC本研究中检测到的突变是一种新的截断变异。携带K895Rfs突变的患者为女性，26岁时表现为室性心动过速和中止性室颤。在指标住院期间植入ICD进行二级预防。未检出骨骼肌病，这与以往其他报道一致FLNC截断突变载体。

在这个散发性DCM队列中，推定致病/可能致病突变的总患病率为10 / 24，这表明即使没有明确的家族史，特发性DCM中遗传原因的比例也更高。当然，由于缺乏强有力的证据来证实检测到的变异和DCM表型之间的因果关系，这种患病率被高估了。偶然的是，通过基因筛查发现，这些指标患者的三名亲属是突变携带者，这表明在发生任何心功能障碍之前进行周期性心脏评估可能是有用的。据我们所知，传导或室性心律失常与LMNA基于多项DCM遗传研究的meta分析，突变是唯一确定的遗传DCM的基因型/表型关系[11］．具有相同突变基因的遗传性DCM临床表现的异质性可能是修饰因素的结果，如修饰基因和表观遗传因素。因此，基因检测在临床特征预测和治疗指导方面的作用有限。在特定的基因型，如FLNC如果发现突变，应尽早考虑进行一级预防的ICD。

这项研究有几个局限性。首先，它是基于一个小的队列;因此，不应过度解读这一结果。此外，用于分析特定基因型的基因型-表型相关性或临床特征的数据有限。第二，除了在硅分析中，我们的研究还没有提供强有力的证据来证实遗传变异和DCM表型之间的因果关系。此外，我们还没有在健康的中国个体中进行变异检测作为对照。因此，对于以前报道的变异，我们通过参考公共在线数据库(如ExAC和dbSNP数据库)列出了等位基因频率(详见表)2)，并将这些信息作为对照。但是，为了节省研究成本，新鉴定的变异没有这样的背景种群变异作为对照。

总之，在中国的一个小型散发性DCM队列中，我们发现了高比例的遗传性DCM，经常检测到肌节突变，尤其是肌肽基因突变。因此，考虑到患者的意愿，对于特发性DCM的年轻患者，即使没有阳性家族史，也应考虑进行基因筛查。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其附加文件中。

ACMG:

美国医学遗传学和基因组学学院

啊哈:

美国心脏协会

DCM:

扩张型心肌病

ESC:

欧洲心脏病学会

ExAC:

Exome聚合联盟数据库

HCM:

肥厚性心肌病

ICD:

植入式心律转复除颤器

LP:

可能的致病

加:

小等位基因频率

门店:

下一代测序

病人:

致病性

RCM:

限制性心肌病

TTNtv:

TTN删除变体

VUS开头:

不确定显著性变量

作者感谢所有患者及其家属的合作。

广东省自然科学基金项目(No. 2017A030313476)资助;广东省人民医院临床科研基金(No.;Y012018085);广东省冠状动脉疾病防治基金重点实验室;Z02207016)。

作者指出

1. 李明敏、夏爽和徐岚对这项工作贡献均等

作者及隶属关系

1. 广东省心血管研究所心内科，广东省冠心病防治重点实验室，广东省人民医院，广东省医学科学院，中国广州

   李明敏，夏爽，徐岚，谭红，杨俊卿，吴泽佳，何旭宇，李立文

贡献

XH和LL构思并设计了该研究。ML, LX, SX, JY和ZW进行了研究。ML, SX和LX对NGS数据进行了解释并起草了这份手稿。XH和HT对此手稿进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Xuyu他或梨纹李．

伦理批准并同意参与

本研究得到广东省人民医院伦理委员会的批准，符合《赫尔辛基宣言》的原则。所有入选患者均知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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