昼夜节律基因多态性之间的性别特异性关联RORA基因皮肤黑色素瘤易感性

背景

黑色素瘤是最致命的皮肤癌，每年在世界范围内的发病率都在上升。这是一种多因素疾病，最有可能由遗传易感性和环境暴露于紫外线引起。生物生物钟组成部分的遗传变异被认为是不同类型癌症的危险因素。此外，时钟基因的两种变体，RORA基因，与黑色素瘤患者的预后有关。我们的目的是验证生物钟基因的特定单核苷酸多态性(SNPs)可能显著影响皮肤黑色素瘤的易发性或黑色素瘤患者的预后。

方法

我们对1239名受试者、629例黑色素瘤患者和610名健康对照组进行了基因分型，分析了7个选定时钟基因的14个已知SNPs:AANAT，时钟，NPAS2，PER1，PER2，RORA基因,永恒的．采用q-PCR进行基因分型。多因素logistic回归用于黑色素瘤易感性评估，并建立模型。按性别进行亚组分析。对于女性亚组，进一步按年龄进行了区分。对于黑色素瘤的预后评估，采用多变量Cox比例风险回归。多重比较采用Benjamini-Hochberg法进行校正。

结果

我们确定了两个RORA基因与黑色素瘤易感性相关的snp具有统计学意义。考虑到RORA作为核类固醇激素受体的假定作用，我们按性别进行了亚群分析。有趣的是,RORA基因rs339972 C等位基因仅在女性亚组中与黑色素瘤易感性降低相关(OR 0.67;95% ci 0.51-0.88;P = 0.003)RORA基因rs10519097 T等位基因仅在男性亚组中与黑色素瘤易感性降低相关(OR 0.62;95% ci 0.44-0.87;p = 0.005)。此外,RORA基因rs339972 C等位基因仅在50岁以上女性中患黑色素瘤的易感性降低(OR 0.67;95% ci 0.54-0.83;p = 0.0002)。所研究的snp均与预后无显著相关性。

结论

总的来说，我们不能确定昼夜通路遗传变异与黑色素瘤易感性或预后有关。尽管如此，我们发现了黑色素瘤易感性和RORA基因多态性具有性别特异性，值得进一步研究。

黑色素瘤是由黑色素细胞不受控制的增殖引起的，是最致命的皮肤癌，在美国，每年每10万居民中就有22例新发病例。这是一种多因素疾病，最有可能由遗传易感性和环境暴露于紫外线引起。表型特征，如白皙皮肤类型，发育不良痣和多个常见痣有助于增加黑色素瘤的风险。一般来说，黑色素瘤易感性遵循多基因模式，其中除了家族聚集的高外显率基因，如CDKN2A突变，许多低/中外显率基因被认为在一般人群中具有风险调节作用[1］．大约5-10%的皮肤黑色素瘤病例发生在家族环境中[2］．全基因组关联研究(GWAS)和改进的DNA测序技术，如下一代测序(NGS)，通过识别大量与黑色素瘤相关的新遗传位点，有助于阐明黑色素瘤易感性的遗传基础。虽然已经发现了几个导致黑色素瘤易感性的基因，但我们对这一领域的知识仍然知之甚少。3.］．

越来越多的流行病学研究将时间中断与各种类型的癌症(包括黑色素瘤)的风险联系起来[4，5]，导致国际癌症研究机构(IARC)将轮班工作(夜班，涉及昼夜节律紊乱)列为人类潜在致癌物(第2A组)[6］．关于生物钟机制与黑色素瘤之间的关系，大多数研究人员集中在黑色素瘤细胞系和人或小鼠皮肤活检中生物钟基因的表达。这些研究表明，与正常邻近组织(或与痣组织相比)相比，黑色素瘤中的时钟基因下调[7，8];此外，时钟基因表达减少与肿瘤侵袭性增加和预后较差有关[7，9］．只有一项研究解决了基因启动子区域的遗传变异性问题NPAS2时钟基因与黑色素瘤风险的关系，并发现其与多态性GGC重复序列的显著相关性[10］．另一项研究检查了类固醇激素受体多态性与黑素瘤预后的关系，并发现皮肤黑素瘤特异性生存率与时钟基因上的两个snp之间存在显著关联RORA基因，其推测的蛋白质编码配体激活的转录因子[11］．

在我们之前对皮肤黑色素瘤遗传易感性的分析中，我们研究了转录因子的拷贝数变异(CNVs)E2F1［12并发现1.6%的黑色素瘤患者携带两个以上的基因副本E2F1。与健康受试者组的差异有统计学意义。在本文中，我们将注意力集中在昼夜节律系统组成部分的单核苷酸多态性(SNPs)对黑色素瘤生物学的作用上。特别地，我们打算测试生物钟基因的特定snp的假设，如AANAT(arylalkylamine N-acetyltransferase),时钟(生物钟调节器)，NPAS2(神经元PAS结构域蛋白2)，PER1(周期生物钟1)，PER2(周期生物钟2)，RORA基因(维甲酸相关孤儿受体A)，以及永恒的(不受时间限制的生物钟)可以显著影响皮肤黑色素瘤的易感性或黑色素瘤患者的预后。为此，我们对629例黑色素瘤患者和610例健康对照患者进行了上述报道的14个已知时钟基因snp的基因分型。

研究设计

我们进行了一项回顾性研究，以检验昼夜节律通路的遗传变异(如snp)可能与黑色素瘤患者的易感性或预后相关的假设。为此，我们提取了2008年至2015年间在我们的机构(Veneto肿瘤研究所，意大利)治疗的患者的临床病理数据，使用了与我们的机构生物库(意大利帕多瓦i大学医院Clinica Chirurgica i)相关的前瞻性维护数据库。纳入研究的每个病例必须满足以下要求:(1)经组织学证实诊断为皮肤黑色素瘤或黑色素瘤转移;(2)基于病理的TNM分期信息;(3)随访资料(最少随访6个月);(4)外周血可用于基因分型。

患者和健康捐赠者

我们回顾性地选择了629名连续的黑色素瘤患者和610名健康对照。后者的选择以人群为基础(n = 270名献血者)，以医院为基础(n = 340名健康受试者，他们到I诊所进行常规检查)。所有患者都签署了一份知情同意书，解释了抽血的研究目的。健康对照数据集已在我们之前的分析中使用[13，14］．

单核苷酸多态性的选择

我们关注5个核心时钟基因，它们是时钟，NPAS2，PER1，PER2,RORA基因．此外，我们还添加了两个与生物钟相关的基因永恒的，在几项研究中，与癌症风险有关[15，16，17，18),AANAT因为它在褪黑激素生物合成中的作用，褪黑激素是昼夜节律系统的关键标志。

我们选择标签snp，询问华盛顿大学的基因组变异服务器(http://gvs.gs.washington.edu/GVS/)和美国国家环境健康科学研究所(https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html)，或已知与癌症易感性或预后相关的变异，其等位基因频率为> 5%。我们依赖于之前的元分析[19]，以我们以往的病例对照研究为基础[13，14，20.和文学。表中列出了涉及每种SNP的癌症研究的出版物2．

DNA提取及基因分型如[13］．

统计分析

对于黑色素瘤的易感性评估，采用多变量逻辑回归，并以小等位基因计数为模型。优势比(OR)和95%置信区间被用来衡量每个SNP的相关性。在这些多变量模型中，评估结果是黑色素瘤的存在或不存在，而解释变量是根据年龄和性别调整的单个snp。

按性别进行亚组分析。对于女性亚组，进一步区分年龄(> 50岁vs < 50岁)。

敏感性分析排除了原发不明黑色素瘤(MUP)患者。

对于黑色素瘤的预后评估，采用多变量Cox比例风险回归。总生存期定义为从肿瘤诊断之日起至因任何原因死亡之日或最后一次随访之日。使用风险比(HR)和95%置信区间作为相关性的衡量标准。在这些多变量模型中，评估事件是患者的生存期，到事件的时间是生存期的月数，解释变量是根据年龄、性别和黑色素瘤分期调整的单个SNP。

采用Benjamini-Hochberg方法(1995)作为多重比较的调整(虚假发现率在线计算器，2016年，碳正离子公司，https://tools.carbocation.com/FDR)．错误发现率(FDR)截点设为0.1。

使用oege -在线遗传流行病学研究百科全书对每个SNP的样本(患者和健康对照组)进行Hardy-Weimberg平衡(HWE)检测[26),http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml．该工具是一个基于卡方统计的双等位基因snp的HWE计算器。

使用范德比尔特大学的在线工具“power and Sample Size”(http://biostat.mc.vanderbilt.edu/wiki/Main/PowerSampleSize) [27］．幂被定义为在629例病例患者和610例对照组的情况下，正确拒绝相对风险(OR)等于1的原假设的概率。I型错误概率α设置为0.05，ψ(我们研究中认为与临床相关的OR)设置为0.80。最后，利用GTEx Portal (https://gtexportal.org/home/)．

指挥官。采用R软件包2.4-2版本进行分析。

这项分析基于1239名受试者，629例黑色素瘤患者和610名健康对照，他们都是欧洲血统。629名患者中有34名患有原发性黑色素瘤。健康对照数据集已在我们之前的分析中使用[13，14]，详细的受试者特征和我们所调查的snp的主要特征在表格中报告1而且2,分别。

在7个生物钟基因中，共有14个预先选择的snp被成功地基因分型，在对照组和患者中都没有观察到Hardy-Weinberg平衡的偏离，总结在附加文件中1:表S1。该分析的平均统计功率约为70%;每个SNP的详细统计能力在附加文件中报告1:表S1。

所选择的时钟基因SNPs和黑色素瘤易感性之间的关联进行了测试，假设遗传的附加模型。我们使用比值比(ORs)及其对应的95%置信区间(95% CI)来衡量每种多态性与黑色素瘤易感性之间的关联强度。结果见表3.．

经过多次测试调整后，我们确定了两个snpRORA基因与黑色素瘤易感性显著相关的位点。rs339972 C等位基因和rs10519097 T等位基因与黑色素瘤风险降低相关(OR 0.76;95% ci 0.63-0.91;P = 0.003, OR 0.77;95% ci 0.61-0.97;P = 0.026)。调整后的p值在附加文件中报告1:表S2。

除34例原发不明的黑色素瘤患者外，未发现差异。

考虑到RORA作为核类固醇激素受体的假定作用，我们决定按性别进行亚群分析。结果见表4．

有趣的是,RORA基因rs339972 C等位基因仅在女性亚组中与黑色素瘤易感性降低相关(OR 0.67;95% ci 0.51-0.88;P = 0.003)RORA基因rs10519097 T等位基因仅在男性亚组中与黑色素瘤易感性降低相关(OR 0.62;95% ci 0.44-0.87;p = 0.005)。进一步进行亚组分析，将女性数据集按诊断年龄划分(> 50岁vs < 50岁)，以区分绝经期或绝经前状态是否与乳腺癌相互作用RORA基因变异和黑色素瘤的关系。50岁以上的雌性携带RORA基因rs339972 C等位基因患黑色素瘤的易感性降低33% (OR 0.67;95% ci 0.54-0.83;p = 0.0002)。在校正多次测试后，没有其他测试关联具有统计学意义。

在附加文件中，对于每个SNP，未观察到与预后有统计学意义的相关性1:表S3。

eQTL搜索

利用GTEx Portal进行表达数量性状位点(eQTL)分析。结果显著(P = 0.000015)RORA基因rs339972，而未检测到显著的eqtlRORA基因SNP rs10519097。

总结

在本研究中，我们验证了生物钟基因的DNA遗传变异可能会影响皮肤黑色素瘤的易感性或黑色素瘤患者的预后。这一假设源于越来越多的研究将不同肿瘤类型的风险或预后与昼夜节律系统的遗传变异性联系起来[19］．此外，皮肤黑色素瘤和昼夜节律系统有一个共同的特征:紫外线辐射。长期暴露在阳光下，导致晒伤，特别是在儿童时期，是公认的黑色素瘤风险因素[45］．值得注意的是，光是主要因素授时因子(字面意思时间给予者)，因此在时钟同步中起着关键作用。我们在7个时钟相关基因中选择了14个单核多态性，并对1239名受试者、629名黑色素瘤患者和610名健康捐赠者进行了基因分型。我们的结果表明，两个snpRORA基因时钟基因与黑色素瘤易感性相关。特别地，亚组分析显示rs339972在女性中与黑色素瘤易感性相关，而rs10519097在男性中具有统计学意义。此外，雌性携带RORA基因年龄超过50岁的rs339972 C等位基因患黑色素瘤的易感性降低33%。未发现与黑色素瘤预后相关。

RORA基因结构

RORA(又称NR1F1，核受体亚家族1,F族，成员1)属于核甾体激素受体转录因子家族。它在20世纪90年代因其与视黄酸受体(RAR)序列相似而被发现[46，47］．没有配体的受体被称为孤受体。最近，其配体结合域的晶体结构将胆固醇和胆固醇硫酸盐确定为假定的配体[48，49］．的RORA基因该位点定位于人染色体15q22.2，全长730 KB，由15个外显子组成。不同的剪接方式和不同的启动子使用产生四种异构体RORA1-4，以不同的组织特异性方式表达。不同亚型的RORA具有不同的结合特异性和转录活性强度[47］．在21世纪初，RORA被证明在肝脏、肾脏、视网膜、肺和视交叉上核(负责昼夜节律控制的大脑区域)中以昼夜节律的方式显示有节奏的表达模式。几年后，RORA被证明是有节奏的昼夜节律行为所必需的，确实，缺乏RORA的小鼠显示出异常的昼夜节律性[50］．在时钟机制中，RORA与其他核受体REV-ERBα和β (NR1D1和2，核受体亚家族1,D组，成员1和2)竞争，结合核心时钟基因启动子中的特定DNA反应元件(RORE)BMAL1(脑和肌肉arnt样蛋白-1，也称为ARNTL1);RORA激活，rev - erba和β抑制BMAL1转录(51，52，53］．此外，褪黑素作为一种主要的生物钟输出，可能会调节RORA [54］．

这两个RORA基因研究的变体rs10519097和rs33997分别位于该基因的第一和第二内含子内RORA基因成绩单1，简称RORA1，当它们位于转录本2-4上游时，RORA2-4．

生物钟和黑色素瘤

大约十年前，在皮肤中也发现了生物钟[55]，特别是不同的细胞亚型，成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞具有局部的昼夜机制，其中包括RORA [56］．在皮肤黑色素瘤中，与正常邻近组织相比，时钟基因丰度普遍降低[8］．研究发现，与痣相比，RORA在黑色素瘤中下调，其表达与总生存率和无病生存率直接相关[7］．此外，非转移性皮肤黑色素瘤会导致中央和外周生物钟的时间中断[9］．最近，两种变体在RORA基因发现rs782917、rs17204952和rs7253062位点与黑色素瘤预后相关DNMT1也是一种类固醇激素受体。三种变异的风险基因型的联合分析显示，皮肤黑色素瘤特异性生存率以剂量-反应方式降低。作者进行了基于通路的分析，以评估191个类固醇激素相关基因的遗传变异[11］．这项研究的基本原理是基于这样一个共识，即黑色素瘤是一种与激素相关的恶性肿瘤[57］．

性激素和黑色素瘤

除了上述风险因素外，其他变量包括种族、年龄和性别，在后者中，女性的优势已普遍显露出来。生活方式、X染色体剂量和性激素在这种差异中起着作用[58］．据报道，皮肤黑色素瘤的发病率在女性中急剧上升，直到50岁左右，这表明雌激素是一个可能的风险因素。此外，使用雌激素、口服避孕药和激素替代疗法，皮肤黑色素瘤的风险累积呈剂量依赖性增加，[59]而目前服用口服避孕药的女性，尤其是服用时间较长的女性，绝经前黑色素瘤的风险可能会增加[60］．一项流行病学研究报告，妊娠相关黑素瘤的发病率随着产妇年龄的增加而增加(40-55岁妇女的发病率是15-24岁妇女的7.55倍)[61］．有严重青春期痤疮史的女性，反映了激素失衡，如较高的游离睾酮循环水平，患黑色素瘤的相对风险增加[62］．在男性中，前列腺癌和雄激素起主要作用的瘤变的个人病史被发现与黑色素瘤的风险增加有关[63］．

RORA的性二态调控

雌雄性激素对RORA的调控存在差异和相互作用，雄激素抑制RORA的表达，而雌激素则增强RORA的表达。二氢睾酮(DHT)和雌二醇分别增加雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)与雌激素的结合RORA基因启动子区域，RORA反过来增加睾丸激素水平。由此产生的负反馈在转录上调节芳香化酶，将雄性激素转化为雌激素[64］．

可能的RORA snp与黑色素瘤易感性的相互作用具有性别特异性

目前的研究结果支持激素受体在黑色素瘤易感性中的作用。特别进行了分析RORA基因多态性对黑色素瘤易感性有不同的影响，rs339972小等位基因对绝经前女性有保护作用，而rs10519097小等位基因只对男性有保护作用。一种推测可能是，这些多态性与性激素和RORA表达的相互作用不同，因为众所周知，时钟基因和RORA在包括黑色素瘤在内的癌症中都是下调的。另一种假设可能是，不同基因变异的影响与不同的基因变异有关RORA基因异构体或不同的RORA功能;除了参与昼夜节律性外，RORs分子还在发育、免疫和细胞代谢中发挥关键作用[53］．关于这些遗传变异的进一步信息来自我们以前的研究。在我们之前的元分析中[19]， rs339972基因与一般癌症的相关性具有统计学意义，而rs10519097基因与乳腺癌的风险相关。在我们之前的病例对照研究中[13，14，20.我们发现rs339972基因与胃癌和肉瘤易感性相关。在所有这些研究中，小等位基因C具有保护作用，但与目前的工作揭示的关联相比，这种关联在统计上不那么强大(就p值而言)。值得注意的是，在我们之前的荟萃分析中，采用两个数据集(4587名受试者)的亚组荟萃分析显示，rs10519097与乳腺癌的相关性是显著的，证据水平为中等(总结OR: 0.85, CI: 0.75-0.96, P = 0.008)。A等位基因与绝经后乳腺癌患者患癌症的风险降低相关(3700名受试者;OR: 0.87, CI: 0.75-1, P = 0.04) [19］．尽管如此，还需要进一步的研究来解释和理解我们的结果背后的机制。

查询GTEx Portal进行表达数量性状位点(eQTL)分析。结果显著(P = 0.000015)RORA基因rs339972在胰腺，但仍是GWAS [65与胰腺癌风险无显著相关性(OR: 0.92, CI: 0.85-1.00, P = 0.04)。进一步的分析是必要的，以阐明这些结果的生物学和临床意义。

据我们所知，这是为数不多的研究皮肤黑色素瘤易感性或预后与昼夜基因变异之间关系的开创性分析之一。然而，我们必须承认我们的工作有一些局限性。首先，我们测试了有限数量的时钟基因，并且根据我们之前的分析或文献，对每个基因只评估了选择的snp，因此我们迫切期待涉及更多基因和snp的研究。其次，所有入选对象均为白种人。为了在不同血统的人群中验证我们的假设，还应进行包括多种族在内的额外研究。第三，对照的来源是基于人群和医院的(意大利帕多瓦大学医院)，尽管如此，我们还是选择了不同病情的患者作为基于医院的部分(即治疗痔疮、甲状腺肿、胃炎的患者)，以避免选择偏差。第四，我们只使用了一种遗传模型(即加性模型)，而既没有探索隐性模型也没有探索显性模型:然而，我们的目的不是确定特定多态性的最佳遗传模型，而是(以定量的方式)总结有关所选遗传变异的证据。

总的来说，我们不能得出结论支持生物钟基因的可变性可能影响黑色素瘤易感性或预后的假设，但我们确实发现了黑色素瘤生物学和预后之间的有趣关系RORA基因基因变异，我们认为值得进一步研究。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章[及其附加信息文件]中。

SNP:

单核苷酸多态性

GWAS:

全基因组关联研究

门店:

下一代测序

研究:

国际癌症研究机构

或者:

优势比

人力资源:

风险比:95% ci: 95%置信区间

中:

原发不明黑色素瘤

eQTL:

表达数量性状位点

罗斯福:

错误发现率

HWE:

Hardy-Weimberg平衡

装备:

染色体

RAR:

视黄酸受体

DHT:

二氢睾酮

基于“增大化现实”技术:

雄性激素受体

呃:

雌激素受体

我们承认:生物库的人员1名^圣意大利帕多瓦大学附属医院外科门诊。威尼托肿瘤研究所(IOV-IRCCS，帕多瓦，意大利)的Manuela Ruffato和Sonia Nalesso负责组织抽样活动和知情同意检索;Paolo Del Fiore和Romina Spina负责管理临床病理数据和伦理委员会的要求。“Piccoli Punti”是意大利的一个非营利性黑色素瘤研究和预防协会，完全支持GS基金和部分研究。联合信贷银行(UNICREDIT BANCA)捐赠对本研究有用的实验室设备。MS Rocca博士，意大利帕多瓦大学男科与生殖医学学部医学部，对手稿提出了富有成效的建议。

帕多瓦大学，BIRD168075，“候选基因的生殖系多态性作为皮肤黑色素瘤和软组织肉瘤患者风险和预后的预测因子”。中国肿瘤研究所(IOV-IRCCS)， 5 × 1000, BIGID219MOCE。

作者指出

1. Senthilkumar Rajendran和Giovanna Spiro同样对这项工作做出了贡献

作者及隶属关系

1. 意大利帕多瓦大学外科肿瘤和消化内科

   Clara Benna, Senthilkumar Rajendran, Giovanna Spiro, Luigi Dall’olmo, Carlo Riccardo Rossi和Simone Mocellin

2. 第一外科诊所，Azienda Ospedaliera Padova，帕多瓦，意大利

   克拉拉Benna

3. 意大利帕多瓦，威尼托肿瘤研究所(IOV-IRCCS)外科肿瘤科

   Luigi Dall 'Olmo, Carlo Riccardo Rossi和Simone Mocellin

4. 意大利帕多瓦，威尼托肿瘤研究所(IOV - IRCCS)免疫学和诊断分子肿瘤科

   奇亚拉Menin

贡献

CB:概念化，形式分析，写作-初稿;SR, GS:调查，验证;LDO:资源;CM:写作-评论&编辑;SM, CRR:监督;融资收购。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到克拉拉Benna．

伦理批准并同意参与

帕多瓦大学医院伦理委员会第448号项目。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意

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