循环肿瘤DNA作为高危子宫内膜癌的预后标志物

背景

目前，没有可靠的基于血液的标志物来追踪子宫内膜癌(EC)患者的肿瘤复发。液体活检，特别是循环肿瘤DNA (ctDNA)分析成为监测肿瘤转移的一种方法。本研究的目的是探讨ctDNA在高危EC复发监测和预后评估中的可行性。

方法

在初次手术期间收集了9例高危EC患者的肿瘤组织，并对肿瘤DNA进行了下一代测序，以使用78个癌症相关基因组获得初始突变谱。收集基线和连续的术后血浆样本，并开发用于患者特异性突变的液滴数字PCR (ddPCR)检测，以跟踪连续血浆样本中的ctDNA突变。采用Log-rank检验评估术前、术后ctDNA检测与无病生存之间的相关性。

结果

所有病例均发现体细胞突变。最常见的突变基因是PTEN，FAT4，ARID1A，TP53，ZFHX3，自动取款机,FBXW7．针对每个患者，针对1 - 3个高频率突变设计个性化的ddPCR检测。DdPCR分析和肿瘤面板测序在评估基线肿瘤组织DNA中的突变等位基因部分方面具有高度的一致性。在67%(6 / 9)的基线血浆样本中检测到CtDNA，这不能预测无病生存(DFS)。在44%(4 / 9)的患者的术后血浆样本(CtDNA追踪)中检测到CtDNA，这预示着肿瘤复发。中位DFS为9个月(检测到ctDNA)，中位DFS为未定义(未检测到ctDNA)，风险比为17.43 (95% CI, 1.616-188.3)。术后ctDNA检测判断肿瘤复发的敏感性为100%，特异性为83.3%，优于CA125和HE4。

结论

个性化ctDNA检测对高危EC有效且稳定。术后血浆CtDNA追踪对预测肿瘤复发有价值。

子宫内膜癌是女性生殖道最常见的侵袭性恶性肿瘤之一。高危EC包括3级子宫内膜样EC (G3 EEC)、浆液性癌(SC)、透明细胞癌(CCC)、癌肉瘤和其他罕见类型，如去分化癌。手术是EC的标准治疗方法，其次是化疗、放疗或激素(孕激素)治疗。高风险ECs有更高的转移和复发率[1];它们只占ECs的20%，但占肿瘤相关死亡率的48% [2，3.];因此，高危EC患者经标准治疗后预后仍较差[4］．

并非所有高风险ec都会复发;最常用的肿瘤标志物为CA125和HE4，但仅在存在宫外转移时才会升高，且敏感性较低。其他标志物包括p53;微卫星不稳定性(MSI);POLE校对突变;热点突变PIK3CA，喀斯特，CDKNA2，CTNNB1，FBXW7，FGFR2，PPP2R1A,PTEN［5，6］．但肿瘤组织活检属于侵入性手术，不能反映肿瘤的异质性;此外，一次活检无法实现连续监测。因此，为了提供个体化治疗，需要更敏感、个性化定制、易于监测的标志物来预测复发和预后。

循环肿瘤DNA (ctDNA)可在晚期癌症患者的血浆和血清中检测到[7]，作为表征肿瘤体细胞遗传特征的一种潜在的非侵入性手段[8，9，10，11，12］．可用于监测肿瘤复发和转移[13，14，15，16，17]，评估预后[18，19，20.，21]，并评估治疗反应[22，23通过基因和表观遗传测试。结合对循环蛋白的评估，检测ctDNA突变可使非转移性癌症检测的特异性提高到99%以上，在卵巢癌、乳腺癌等六种癌症中，有83%的患者可将癌症定位到少数解剖部位[24］．这种“液体活检”比组织活检简单易行，且不影响肿瘤的异质性和连续监测。

在这里，我们分析了高危EC的个体肿瘤基因组，并评估了这种方法在长期和动态随访中的敏感性和特异性。我们的研究旨在探讨ctDNA结合患者的临床特征在高危子宫内膜癌患者复发监测和预后评估中应用的可行性，并提供了大量关于ctDNA测量在高危子宫内膜癌患者评估中的潜在效用和局限性的信息。

研究设计

高危ECs患者分别来自瑞金医院、上海交通大学、复旦大学妇产医院，均采用标准治疗。在初次手术时从预处理肿瘤活检组织中提取肿瘤DNA，并使用包含78个癌症相关基因的基因组进行测序，获得初始突变谱。收集患者的连续血浆样本，以评估ctDNA检测预测治疗后复发的潜力。我们开发了针对患者特异性突变的液滴数字PCR (ddPCR)检测，以跟踪ctDNA在基线和术后连续血浆样本中的突变。评估术前和术后ctDNA检测与DFS之间的关系。

患者队列和样本收集

经两家医院的机构审查委员会批准后，所有患者在采集标本时都提供了书面知情同意书，允许使用其组织进行研究。纳入最终病理诊断为高危EC的患者，其中浆液性癌6例，子宫内膜样癌G3 1例，透明细胞癌1例，去分化癌1例。收集其他临床病理特征，包括年龄、FIGO分期、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结状态、淋巴血管间隙侵犯(LVSI)、下子宫段受累、辅助治疗和预后(附加文件1:表S1)。所有患者均接受标准手术治疗，随后进行标准化疗，或在需要时进行放化疗联合治疗。在完成标准治疗后，对患者进行随访。在基线(术前)、术后6天、随访期间每3-6个月或直到复发时收集血浆样本(所有术后样本，包括随访期间的单个术后样本和连续样本称为“ctDNA跟踪”样本;无花果。1)．在采集ctDNA样本的同一时间点，同时评估每例患者的血清CA125和HE4。

肿瘤样品加工及DNA提取

所有手术肿瘤样本均进行H&E染色，以确认活检样本与最终诊断病理相同，并确保肿瘤细胞百分比在80%以上。使用基因组DNA提取试剂盒(UnigeneDx)按照制造商说明书分离肿瘤DNA。根据制造商的说明，使用基因组DNA提取试剂盒(细胞或组织)(UnigeneDx)从浅色被毛DNA中提取生殖系DNA。

肿瘤面板测序(TPS)基线肿瘤样本

手术过程中冷冻的肿瘤组织被送往服务提供商(上海金宝生物科技有限公司)进行DNA测序。如前所述，分离总DNA。在文库构建之前，使用Qubit和Agilent 2100芯片分析对核酸进行量化和鉴定。简单地说，DNA文库是用一个针对78个已知癌症相关基因的基因面板准备的，该基因面板被命名为肿瘤面板(附加文件)2:表S2)，使用KAPA Hyper Prep Kit和定制设计的NimbleGen探针(Roche)在标准程序下。执行质量控制步骤后，在Illumina HiSeq平台上对文库进行测序。平均生成1.2-1.5G PE150 DNA文库原始数据(平均深度~ 1000X)。原始数据经过标准信息学管道进行质量控制、读取对齐和变量调用。三级分析使用内部软件来注释vcf文件中的变量，并集成来自多个数据库的信息。

突变特异性ddPCR检测方法的建立

来自肿瘤组织测序的突变仅在同时满足两个标准时才被选择用于ddPCR分析:1)发生在两个以上的患者中并存在于宇宙数据库中，2)突变等位基因频率超过30%，表明它可能是创始突变而不是亚克隆突变。在检测技术开发之前，我们通过对患者血液样本的基因组DNA进行桑格测序，确保这些变异不是种系突变。

采用TaqMan化学技术，在QX200 DdPCR系统(Bio-Rad)上进行DdPCR。针对每种肿瘤突变，我们开发了一种特定的ddPCR检测方法。简而言之，构建包含野生型和突变型序列的质粒作为质量控制。引物和Taqman探针对均为定制设计。突变型特异性探针通常是FAM荧光标记，而野生型特异性探针通常是VIC荧光标记。优化退火温度和循环条件，用连续稀释的质粒测定LOD和检测灵敏度。根据制造商的指示，使用QuantaSoft软件进行数据分析。

循环游离血浆DNA DdPCR分析

在无细胞DNA采集管中采集的血液在样品采集后5天内进行处理，并在1600 g离心10分钟，然后再16000 g离心10分钟;血浆保存在-80°C直到DNA提取。根据制造商的说明，使用MagMAX™无细胞DNA分离试剂盒(应用生物系统公司)从2 mL血浆中提取DNA。循环游离DNA保存在50 uL的DNA洗脱液中。所有循环DNA样本的浓度使用量子位3.0 (Thermo Scientific)进行评估。接下来，进行患者特异性ddPCR检测，以跟踪ctDNA、基线和术后连续血浆样本的突变。简单地说，900 nM探针和250 nM引物与2 × Droplet PCR Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)、5 μL (10 ng至30 ng)模板DNA和H₂O每次反应生成20 μL。将反应混合物放入DG8墨盒(Bio-Rad)的样品孔中。然后将70 μL的液滴生成油加载到油井中，在液滴发生器(BioRad)中形成液滴。处理后，将液滴转移到96孔PCR板(Eppendorf)。PCR扩增在C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad)上进行，热剖面如下:95℃保温10 min, 94℃保温30 s, 58℃保温1 min, 40个循环(ramp 2℃/s)， 98℃保温10 min, 4℃结束。扩增后，将平板加载到液滴读取器(Bio-Rad)上，自动读取平板各孔的液滴。使用QuantaSoft软件对pcr阳性(FAM通道)和pcr阴性(VIC通道)液滴进行计数，以提供目标DNA的绝对定量。每个目标的定量测量值表示为每1µl反应的拷贝数。由生成的泊松浓度计算%mut: %mut = [FAM]/[FAM + VIC]*100。突变仅根据测定的敏感性被认为存在。

统计分析

在MedCalc软件上用Bland-Altman图分析TPS和突变特异性ddPCR对基线肿瘤的突变频率的一致性。3.a).使用Mann-Whitney评估基线ctDNA水平与临床病理因素的相关性U或适当的Kruskal-Wallis H检验(表1)．该研究的主要终点是使用Kaplan-Meier方法计算的单变量生存估计来评估ctDNA检测到和未检测到ctDNA的患者的DFS，并使用log-rank检验来估计生存差异(图2)。4a, b). Mann-WhitneyU采用两个独立样本的试验，检测基线时血浆ctDNA拷贝数/突变拷贝数/突变等位基因分数与复发/未复发之间的相关性(图2)。4c). Fisher精确检验用于检验ctDNA检测与临床病理变量之间的关联(附加文件5:表S5)， ctDNA/CA125/HE4/影像学与肿瘤复发之间的相关性，并计算kappa指数，该指数通常用于评估评分者之间的信度，以评估复发状态与上述四项检测结果的一致性(图S5)。5d). kappa指数在0.61-0.80之间表示一致性较强，较高的值表示一致性较高。使用临床病理变量和ctDNA/CA125/HE4/成像对DFS的预测由单变量logistic回归分析估计(附加文件6:表S6)，采用多变量Cox回归分析检验术后ctDNA检测的独立预后价值，并对分期、肿瘤大小、肌层侵犯和淋巴结状态进行调整。所有统计分析均采用SPSS 21.0或GraphPad Prism 5进行。所有P值都是双面的。

肿瘤面板测序和ddPCR检测方法的建立

为了确定疾病相关的突变，我们首先对肿瘤样本进行了NGS分析。为此，我们收集了所有9名招募患者的肿瘤样本和相应的血液样本，并使用肿瘤小组(tumor Panel)分析了肿瘤dna。所有病例均发现体细胞突变。9例患者中有7例发现了体细胞PTEN突变，如先前报道的那样，这种突变的频率很高[252个为错义突变，5个为多命中突变(多于一种类型)。TP53所有6例浆液性癌患者(EM001, 002, 003, 007, 008, 009)均存在突变，其中大部分为错义突变，而非浆液性癌患者(EM004, 005, 006)则不存在错义突变。在我们的分析中，最常突变的基因是PTEN，FAT4，ARID1A，TP53，ZFHX3，自动取款机,FBXW7(无花果。2a).结果部分符合EC浆液样/拷贝数高亚群的突变模式，以突变为特征Tp53, pik3ca, fbxw7, ppp2r1a, pik3r1, chd4, pten而且CSMD3（PPP2R1A, CHD4,CSMD3不包括在肿瘤小组内)[25］．我们关注的是Tp53 pten pik3ca pik3r1,FBXW7CLISING和cBioportal数据库中记录的这些基因的致病性或可能致病性突变(附加文件)3.:表S3)，以确定是否与复发或FIGO分期有关。但复发/非复发病例与晚期/早期病例之间无特异性突变模式。关于突变基因的数量，PTEN我们可以在大多数基因中看到多位点突变(图2)。2b).在EM001、003、006中，变异数远高于其他情况;然而，它与预后或任何其他临床特征无关(图。2c)。

为了追踪血浆DNA中的体细胞突变并识别ctDNA的存在，我们选择了1 - 3个高频突变来为每个病例设计个性化的ddPCR检测(附加文件)4:表S4)，种系突变被排除。这些突变通常被报道为外显子上的移码、停止增益或nSNV变异，TPS和ddPCR的检出率与某些ddPCR方法的检出率高度一致。

个体化肿瘤特异性ddPCR分析有效可靠

在每个病例都鉴定出体细胞突变，并建立了个性化的ddPCR检测后，我们在9名患有高风险EC的前瞻性队列中研究了ctDNA分析在高风险EC中的潜在用途(图2)。2)．

数据显示TPS和ddPCR分析在评估基线肿瘤组织DNA中的突变等位基因部分方面具有高度的一致性(图2)。3.a)，证明了开发针对不同突变的ddPCR分析的强大能力。DdPCR在单分子灵敏度下准确定量突变DNA，即使存在大量野生型DNA (64,060 cfDNA拷贝中有60个突变拷贝，0.09%)(图。3.b). EM004和EM005患者的肿瘤存在相同的体细胞突变(PTEN-c.389G > A)，无病患者未检测到ctDNA，复发患者检测到ctDNA(图。3.B)，证明了该方法的有效性和可靠性。在原发肿瘤中发现不止一种突变的患者中，我们追踪了血浆中的所有突变，在同一血浆中存在/不存在突变的一致性稳定(图2)。3.C)，强调所开发的测定方法的可重复性和鲁棒性。

术后ctDNA状态与无病生存期相关

我们确定ddPCR分析的ctDNA状态是否与肿瘤复发相关。如前所述，个性化的ddPCR检测用于跟踪收集的连续血浆样本中的突变。我们评估了不同时间点复发与ctDNA状态之间的相关性。与先前的观察相一致[16]，在67%(6 / 9)的基线血浆样本中检测到ctDNA。基线水平包括中位cfDNA水平、突变拷贝数、突变等位基因分数和ctDNA检出率与疾病的晚期状态如FIGO分期和淋巴结状态相关，但与其他临床病理特征如年龄、病理亚型、肿瘤大小、肌层侵犯、LVSI和子宫下段受累无关(表2)1)．

基线时CtDNA检测，即在任何治疗前，并不能预测DFS(图。4a).复发患者的CfDNA和ctDNA基线水平高于未复发患者(CfDNA拷贝数:中位数为344,200对52,760/mL;突变拷贝:中位数1840 vs 30/mL;突变等位基因分数:复发和DFS的中位数分别为3.25%和0.045%)，尽管没有达到统计学显著性水平(图2)。4c)。

CtDNA在一系列术后血浆样本中的追踪预测肿瘤复发。然后我们评估了ctDNA追踪报告肿瘤复发的潜力。在44%(4 / 9)的患者术后血液检测中检测到CtDNA(图4 / 9)。4b)，具有高度可变的突变负载(中位数为900拷贝/mL;范围为290 ~ 81,300拷贝/mL，突变等位基因比例为0.15% ~ 79.47%)。在这些样本中，ctDNA检测可预测肿瘤复发(DFS:中位数为9个月[检测到ctDNA]，中位数为未知[未检测到ctDNA];风险比[HR]， 17.43 [95% CI, 1.614至188.3])。4b).在ctDNA追踪中，根据基线值，ctDNA检测与FIGO分期和淋巴结转移相关(附加文件5:表S5)，与肿瘤大小和肌层侵犯一起，是肿瘤复发的预测因子(附加文件)6:表S6)。这些结果提示，术后ctDNA检测与肿瘤复发密切相关，但由于样本量小，我们在多因素cox回归分析中无法统计证明ctDNA是独立的预后因素(P = 0.336, HR, 0.007, 95% CI 0.000-164.011)。

CtDNA在肿瘤复发检测方面优于CA125或HE4

在分析ctDNA时，同时监测常用的上皮肿瘤标志物CA125和HE4。在未复发的患者中，5/6的患者术后血浆中均未检测到ctDNA (P = 0.048)。1例患者(EM003)在术后8个月检测到ctDNA，但在术后26个月的随访期间无疾病(图。5a).在随访期复发的患者中，所有病例(3/3)在术后血浆样本中均检测出ctDNA(图3)。5b)。

普通肿瘤标志物的表现不如ctDNA检测可靠。所有复发病例CA125阴性，假阴性率极高，无病病例CA125阳性占一半(3/6)。HE4在估计肿瘤复发的敏感性和特异性均为66.7%，kappa指数为0.308，仅表明该标志物与肿瘤复发估计具有较好的一致性(图3)。5c).影像学与复发完全一致，敏感性和特异性100%。总体而言，术后ctDNA检测对判断肿瘤复发的敏感性为100%，特异性为83.3%，kappa指数为0.769，表明术后ctDNA检测与肿瘤复发具有较好的一致性(图2)。5d)。

我们的研究重点是高恶性的高危ECs (G3 EEC, SC, CCC，癌肉瘤等)，因为大多数子宫内膜样ECs经过标准治疗后复发风险相对较低，ctDNA监测没有太大价值。探讨ctDNA个体化检测在高危EC复发监测和预后评估中的价值。此外，我们在随访期间进行了完整的连续ctDNA监测，并与传统的血清生物标志物进行了比较，这在大多数其他研究中都没有包括在内。我们发现这些方法是有效和稳定的;肿瘤复发与ctDNA追踪样本的状态相关，ctDNA是一种优于常规血清肿瘤标志物CA125或HE4的生物标志物。

一些研究发现，癌症患者中超过一半的cfDNA突变可能来自克隆造血[26]，因此cfDNA突变可能不代表肿瘤突变。然而，ddPCR分析中设计的突变来自肿瘤突变，我们通过在血浆ctDNA检测之前检测匹配的白细胞来排除种系突变。此外，我们的结果显示，NGS和ddPCR在同一突变位点上的突变等位基因片段高度一致(图2)。3.一个);同一突变在不同样本中的表达因预后不同而异(图;3.b)，在同一样品的不同位点观察到相同的解释(图。3.c).这些结果表明了本研究中使用的方法的严谨性。

我们的研究使用了78个癌症相关基因的大小组，包括所有已知的分子治疗靶点。一些研究使用了与我们类似的小组[27，28]而其他人则使用包含2-4个基因热点突变位点的小板[29，30.］．大的面板包含更多的变异，使得突变的检出率更高，但由于突变位点分散，测序和ddPCR检测的成本都增加了。小样本可能会遗漏一些突变，但更适合临床应用，成本更低。

本研究术前ctDNA检出率与FIGO分期及淋巴结阳性有关，与其他研究相似，提示与肿瘤负荷密切相关。在我们的研究中，ctDNA阴性的3例均为FIGO I期，在I ~ II期的病例中，ctDNA检测仅占1/4，而在III ~ IV期的病例中，ctDNA检测占5/5。这与18%的早期病例中检测到ctDNA的结果相似[30.］．因此，该方法对晚期病例评估肿瘤缩小效果和复发监测更有意义。

术前ctDNA的检出率似乎也与病理类型有关。与其他研究相比，我们报道了手术中ctDNA的最高检出率(67%)，可能是因为只包括高危病理类型的ECs。检出率为41.2% [27]当时高危ECs的比例为28.3%，报道的比例为33% [30.]当只包括子宫内膜样EC时。恶性程度越高，肿瘤越容易扩散，越容易被发现，这是合理的。

除了术前(基线)ctDNA测量外，我们还在随访期间进行了完整的连续ctDNA监测(术后第6天和此后每隔3个月收集血浆样本)。我们观察到大多数病例在术后第6天ctDNA被清除，说明ctDNA的半衰期很短，对肿瘤负荷的变化反应迅速，非常敏感。术后ctDNA(图;4b)而不是基线ctDNA(图;4A)预测肿瘤复发。数据显示复发组与非复发组之间在cfDNA数量、突变拷贝数或突变等位基因分数方面存在差异，但由于样本量较小，差异无统计学意义。基线时cfDNA丰度、突变拷贝数或突变等位基因分数与FIGO分期和淋巴结转移相关，提示晚期患者由于肿瘤负荷较高，cfDNA数量较高。晚期疾病的复发率较高，术前ctDNA可能与肿瘤分期的复发有关，因此在预测复发方面不如术后序列样本ctDNA的特异性，因为后者在评估残余肿瘤负荷方面表现更好。

CA125和HE4是EC的常规肿瘤标志物。我们的研究结果显示，ctDNA在复发评估方面优于血清肿瘤标志物CA125和HE4。5c, d).但复发病例ctDNA未早于影像学发现，可能是随访时ctDNA检测与影像学同时进行，检测间隔较长，可能漏检早期。先前的研究表明，ctDNA检测比临床复发的平均提前时间为7.9个月(范围为0.03至13.6个月)[17]，提示ctDNA在早期预测肿瘤复发方面的潜力。

这项研究也有一些局限性。所有病例均未检测到CtDNA。早期(FIGO I期至II期)大多数病例(3/4)为阴性，晚期(FIGO III期至IV期)所有病例(5/5)基线ctDNA均为阳性，提示ctDNA在局限性病变中特异性不够，而在肿瘤负荷高的情况下更适用。EM003病例术后9个月呈阳性，但术后2年无病。因此，应使用足够的输入，并谨慎设置ddPCR分析的阈值，以降低假阳性率。样本量小，随访时间短，随访间隔较长可能导致本研究的偏倚。NGS面板中包含的基因不是为EC定制的，因此一些与EC相关的关键基因可能被遗漏，ddPCR检测方法的设计可能受到限制。NGS和ddPCR检测的高成本也限制了个性化液体活检的临床应用。

CtDNA作为预后标志物，在术后随访中监测高危EC复发有价值，且优于传统血清肿瘤标志物。当活检样本不能评估时，液体活检应评估复发病例的药物敏感性。CtDNA检测用于高风险ECs的复发或药物反应监测有待进一步探索，未来需要降低成本。

所有数据在文中以表格、图表和补充表格的形式呈现。原始肿瘤组测序数据可按要求提供给通讯作者。

CtDNA:

循环肿瘤DNA

电子商务:

子宫内膜癌

DdPCR:

液滴数字PCR

DFS:

无病生存

G3EEC:

3级子宫内膜样癌

SC:

浆液性癌

CCC:

透明细胞癌

MSI:

微卫星不稳定

TPS:

肿瘤面板测序

一个也没有。

本研究由上海市教委高峰临床医学资助基金(20172003)资助WF。

作者指出

1. 冯维维、贾楠、焦海宁对这项工作同样有贡献

作者及隶属关系

1. 上海市黄浦区瑞金二路197号，上海交通大学医学院附属瑞金医院妇产科，邮编200025

   冯薇薇，焦海宁，张月如，朱崇英，沈丽菲，龙文庆

2. 复旦大学妇产科医院妇产科，上海，200091，中华人民共和国

   贾楠，朱梦涵

3. 上海金宝生物科技有限公司，上海，201210，中华人民共和国

   陈军，陈燕

贡献

WF设计了这项研究并审阅了手稿。NJ, HJ, YZ, MZ, CZ, LS和WL采集数据。NJ, JC和YC分析了数据。NJ起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到冯胖子．

伦理批准并同意参与

本研究获得了瑞金医院、上海交通大学、复旦大学妇产医院伦理委员会的批准。所有患者在标本采集时均提供书面知情同意书，允许使用其组织进行研究。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限