使用循环中性粒细胞转录本的分类模型可以检测未破裂的颅内动脉瘤gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

颅内动脉瘤(IAs)是危险的，因为它们有破裂的潜力。我们之前发现有和没有未破裂IA的患者循环中性粒细胞中存在显著的RNA表达差异，并使用40个中性粒细胞转录组训练机器学习模型来预测IA的存在。在这里，我们的目标是使用来自更大人群的中性粒细胞转录组和更强大的机器学习方法开发未破裂IA的预测模型。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

从134例患者血液中提取的中性粒细胞RNA(55例IA, 79例无IA对照)进行了下一代RNA测序。在一个随机选择的训练队列(n = 94)中，最小绝对收缩和选择算子(LASSO)选择了转录本，从中我们通过4种完善的监督机器学习算法(K-Nearest Neighbors，随机森林和具有高斯和三次核的支持向量机)构建了预测模型。我们测试了其余样本(n = 40)中的模型，并通过受试者工作特征(ROC)曲线评估模型性能。采用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测9个ia相关基因，在49个中性粒细胞RNA样本中验证基因表达。我们还研究了人口统计学和共病对模型预测的潜在影响。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在训练队列中使用LASSO进行特征选择，识别出37个ia相关转录本。在测试队列中，使用这些转录本训练的模型的最大准确性为90%。所有方法的测试性能具有ROC曲线下的平均面积(AUC) = 0.97，比我们之前的模型有所改进。随机森林模型在训练和测试队列中表现最好。RT-qPCR证实了9个基因中7个的表达差异。对37个模型基因进行的基因本体和IPA网络分析反映了炎症、细胞信号转导和凋亡过程的失调。在我们的数据中，人口统计学和共病不影响模型性能。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们通过增加样本量、实施LASSO和更强大的机器学习方法，改进了之前基于循环中性粒细胞转录组的IA预测模型。未来的研究需要在更大的队列中验证这些模型，并进一步研究协变量的影响。gydF4y2Ba

颅内动脉瘤(IAs)在总人口中占比高达6%，但只有约10%在破裂前表现出任何症状[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．内窥镜破裂是非创伤性蛛网膜下腔出血的主要原因，其死亡率高达50% [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．临床研究表明，选择性血管内或手术治疗可降低未来破裂的发生率[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．然而，由于大多数IAs是无症状的，未破裂动脉瘤通常仅在因其他医学原因进行的脑成像中被偶然发现。磁共振成像/血管造影术(MRI/MRA)、计算机断层血管造影术(CTA)和数字减影血管造影术(DSA)通常不用于IA筛查，因为它们价格昂贵，并且由于其侵入性(如DSA)或暴露于辐射(如DSA, CTA)而存在严重并发症的风险。因此，通过血液检测来识别未破裂的IA个体，可以通过常规筛查和预防性治疗，促进向积极的IA管理的范式转变。gydF4y2Ba

我们假设循环中性粒细胞基因表达的改变与脑血管中IA的存在相关。中性粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞，是组织损伤和抵御微生物的重要哨兵，在协调先天免疫和炎症中发挥核心作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．最近的证据表明，中性粒细胞在表型和功能上都有很大程度的异质性，在稳态和疾病特异性反应中发挥着广泛的作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．事实上，在以前的出版物中，我们小组已经证明囊性纤维化和特发性关节炎患者之间存在不同的循环中性粒细胞特征[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，这表明中性粒细胞有能力使其转录组适应特定的生物学环境。gydF4y2Ba

最近的研究已经开始表明，中性粒细胞在IA病理生理过程中可能表现出疾病特异性反应。切除动脉瘤的研究发现中性粒细胞释放的关键蛋白质水平升高，即髓过氧化物酶(gydF4y2BaMPOgydF4y2Ba)和中性粒细胞明胶酶相关脂脂素(gydF4y2BaNGALgydF4y2Ba)在内务处的墙上[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．IA患者的血浆中也发现这些蛋白质水平升高[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这些蛋白可能在细胞外基质(ECM)降解和中性粒细胞活化中发挥关键作用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]通过产生活性氧(ROS)和保护MMP-9降解，分别在动脉瘤自然史中发挥作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．中性粒细胞可产生多种细胞因子，即炎症和免疫调节细胞因子、趋化因子(单核细胞浸润所必需)、血管生成因子和纤维生成因子以及肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．研究表明TNF在人IA组织中上调[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，并从疾病的动物模型中提取，对IA的形成至关重要[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．此外，根据中性粒细胞在腹主动脉瘤进展和破裂中的作用，中性粒细胞也可能在IA中释放中性粒细胞细胞外陷阱(NETs) [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在一项小型概念验证研究中，我们之前在病例对照队列(n = 11 IA, n = 11对照组)中进行了差异表达分析，并发现区分IAs与对照组的82个基因签名[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．生物信息学分析广泛反映IA患者的外周中性粒细胞激活，因为IA组中表达升高的基因与白细胞激活、细胞激活和防御反应有关[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．在后续研究中，我们接下来利用机器学习来确定一种算法是否可以使用差异基因表达来预测未破裂IA的存在[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在一个不匹配队列(n = 30)中，使用26个高信息性中性粒细胞转录本(FDR < 0.05, abs[fold-change]≥1.5)构建对角线性判别分析模型，该模型在一个小型独立队列(n = 10)中预测IA的存在，准确率为90% [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然这些结果令人兴奋，但由于样本量小，很难将我们的发现推广到更广泛的人群。因此，在本研究中，我们的目标是在更大的患者队列中证实这些结果。重要的是，样本量的增加将使我们能够:(A)实现更先进的特征选择方法(取代基本的阈值划分)和机器学习技术(即随机森林)来提高预测精度，(B)检查人口统计学和共病对模型预测的潜在影响。gydF4y2Ba

研究招生gydF4y2Ba

本研究由布法罗大学机构审查委员会批准。030 - 474433)。所有方法都遵循批准的协议。在样本采集前，所有受试者均获得书面知情同意。在纽约布法罗的盖茨血管研究所接受脑DSA的患者被纳入本研究，有或没有IA诊断。DSA的大多数适应症包括确认存在IAs或其他脑血管疾病的非侵入性成像结果，随访头痛或视觉障碍的非侵入性成像，或随访先前确定的IAs。所有同意参加本研究的患者年龄均在18岁以上，讲英语，之前未接受过IA治疗。免疫系统可能发生改变的患者被排除在外，包括，例如，近期接受侵入性手术的患者、正在接受化疗的患者、发烧(> 100°F)的患者、接受实体器官移植的患者、自身免疫性疾病患者或正在服用强的松或其他免疫调节药物的患者。gydF4y2Ba

在2013年12月至2018年9月期间，我们从盖茨血管研究所的脑DSA患者中收集了232份血液样本(103份来自IA患者，129份来自无IA对照组)。其中43个样本作为我们之前研究的一部分进行了测序[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．所有病例均通过DSA图像确诊IA。患者的医疗记录数据也被收集来研究人口统计学和共病。gydF4y2Ba

中性粒细胞隔离gydF4y2Ba

在DSA期间，从股动脉导管中抽取16ml血液，并转移到两个8ml的柠檬酸细胞制备管中(BD, Franklin Lakes, NJ)。中性粒细胞在采血后1小时内分离，如其他地方所述[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．简单地说，细胞制备管在1700×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba通过Ficoll密度梯度将外周血样本中的单个核细胞和血浆中的红细胞和中性粒细胞分离开来。将红细胞和中性粒细胞收集到3ml注射器中。红细胞低渗裂解后，400倍离心分离中性粒细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba在−80°C下保存在TRIzol试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA)中，直到进一步处理。通过流式细胞术分离出的中性粒细胞98%以上为CD66b+，且不含CD14+单核细胞[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RNA制备gydF4y2Ba

如前所述，提取中性粒细胞RNA [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba根据制造商的说明使用TRIzol。微量DNA通过DNase I (Life Technologies, Carlsbad, CA)处理去除。RNA使用RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Venlo, Limburg, Netherlands)进行纯化，并悬浮在不含rnase的水中。每个样品中RNA的纯度和浓度通过NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific, Waltham, MA)在260 nm和280 nm处的吸光度测量，保留200 ng至400 ng的RNA用于测序。通过quantitative - it RiboGreen Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)和TBS-380荧光仪(Promega, Madison, WI)测量精确的RNA浓度，并使用Agilent 2100 BioAnalyzer RNA 6000 Pico芯片(Agilent, Las Vegas, NV)测量RNA样品的质量。待测序RNA样品在测序前具有可接受的纯度(260/280比值为~ 1.8或更大，范围为1.76-2.12)和完整性(RIN为~ 5或更大，范围为4.5-9.1)。gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

对于新处理的样品，使用Illumina TruSeq搁浅总RNA金文库制备试剂盒(Illumina, San Diego, CA)进行文库制备。样品在HiSeq2500系统(Illumina)中进行50循环单读测序，并使用Bcl2Fastq进行多路分解。为了增加样本量，我们将这些新样本的读数与之前样本的读数结合起来[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]以同样的方式测序，但其文库使用Illumina TruSeq RNA文库Prep Kit V2 (Illumina, San Diego, CA)构建。对于所有数据，由Illumina HiSeq2500生成的每周期基本调用(BCL)文件使用默认参数使用bcl2fastq版本2.20.0.422转换为每读取的FASTQ文件。采用FastQC 0.11.5版本对测序质量进行评价。使用FastQ Screen 0.11.1版进行潜在污染检测。FastQC和FastQ屏幕质量报告使用MultiQC 1.5版本汇总。没有检测到适配器序列，因此没有执行修整。使用HISAT2 2.1.0版本和默认参数进行基因组比对。NCBI参比GRCh38作为参比基因组和基因注释集。序列比对使用samtools version 1.3压缩并排序到二进制比对图(BAM)文件中。使用Subread featurets version 1.6.2使用参数-s 2 -g gene_id -t exon -Q 60对基因组特征的映射reads进行计数，使用- a指定的注释文件是来自Illumina iGenomes的NCBI GRCh38引用。 Aggregate quality control data (i.e. alignment statistics and feature assignment statistics) were again summarized using MultiQC.

微分表达式分析和数据探索gydF4y2Ba

在实现我们的机器学习管道之前，我们对整个数据集进行了差异表达分析，以使用Bioconductor package edgeR version 3.24.0识别在IA中显著差异表达的转录本。在估计色散后，edgeR通过使用具有广义线性模型的负二项分布和准似然f检验来识别差异表达基因[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．我们将这两个测序批次纳入设计矩阵，以纠正由于不同的文库制备试剂盒而产生的任何潜在批次影响。所有样本中计数和为> 0的基因作为输入。采用Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)校正进行多重假设检验校正[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．fdr校正p值(q值)< 0.05的转录本被认为表达显著差异。为了探索转录组如何在大范围内分离IA患者和非IA患者，我们在默认设置下使用R中的hclust包(完全链接)进行了分层聚类。gydF4y2Ba

在可能的情况下，下一代测序通常对高质量的RNA (RIN > 7)进行[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．然而，临床样本，特别是含有高水平内切酶作为宿主对细菌防御反应的一部分的人类中性粒细胞，很少产生没有任何程度降解的RNA [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．本研究中IA组与对照组的RIN差异无统计学意义(p = 0.18, Student’s t检验)。但考虑到部分样本RIN水平较低，部分样本RIN水平较高，我们进行了协变量相关分析，如Xiong等。[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]以确定RNA质量是否会影响差异表达转录本的表达水平。如果Pearson相关系数r > 0.80且p值< 0.01，则认为基因表达与RIN相关。gydF4y2Ba

通过qPCR验证子队列中的表达差异gydF4y2Ba

为验证差异表达基因的表达差异，采用定量聚合酶链式反应(qPCR)。由于RNA数量的限制，在134个样本中的50个子集(20个IA和30个对照组)中对10个转录本进行qPCR。我们遵循之前描述的协议[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．简而言之，寡核苷酸引物使用Primer3软件(Primer3Web 0.4.0)和Primer BLAST (NCBI, Bethesda, MD)设计，其熔融温度为60°C，长度为15-25个核苷酸，产物为50-250个碱基对(至少有一个引物横跨外显子-外显子结)，估计效率为> 0.8(实际范围:0.82-1.1，平均值:0.96，中位数:1.0)[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．引物序列、退火温度、效率和产物长度在附加文件中报告gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1。对于反转录，使用qScript cDNA Synthesis kit (Quantabio, Beverly, MA, USA)根据制造商的说明从总RNA中生成第一链cDNA。qPCR使用qScript One-Step SYBR Green Master Mix试剂盒(Quantabio, Beverly, MA, USA)和基因特异性引物，每个引物浓度为0.02 μM，在Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, California)使用5 ng cDNA进行20 μ L反应，重复3次。温度剖面包括初始阶段95°C 1 min，随后95°C 15 s和60°C 1 min的40个循环，然后在20 min内从60°C到95°C的最终融化曲线分析。gydF4y2Ba

基因特异性扩增用Bio-Rad解离熔体曲线显示为单峰。样本归一化gydF4y2BaHPRT1 GAPDH,gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba谷歌价格指数gydF4y2Ba(管家基因[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba])的表达，这些表达对感兴趣的基因进行平行反应。额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1显示了表达的稳定性(来自RNA测序，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1A)和CgydF4y2Ba_tgydF4y2Bavalues (from qPCR，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:对照组和IA组管家基因图S1B)。均具有相似的变异系数值，两组间测序或qPCR的变异均无统计学意义(p值均为> 0.01,f检验)。他们的CgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba数值用于计算两组之间的基因特异性平均折叠变化，使用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCtgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．然后对所有家政基因的这些值进行平均。为了与qPCR数据进行比较，使用来自相同样本的RNA测序数据计算IA组和对照组之间基因表达的平均折叠变化。然后将此折叠变化值(表示为正方向或负方向的绝对折叠变化[对于折叠变化< 1])与由2计算的相同度量进行比较gydF4y2Ba^{−ΔΔCtgydF4y2Ba}方法，以确定表达的绝对折叠变化是否在同一方向上且有统计学差异(Student 's t检验，p值< 0.05显著性)。gydF4y2Ba

分类模型开发的特征选择gydF4y2Ba

为了建立IA的预测模型，我们从原始计数开始，以消除与edgeR中纳入的分布建模相关的偏差和不确定性。然后将原始计数归一化为百万分转录本(TPM)值，以通过基因长度和测序深度归一化来方便样品之间的表达比较。然后，我们通过在所有样本中仅选择平均TPM > 1的蛋白质编码基因进行丰度过滤，将潜在转录本集减少到18833个。为了解释我们研究设计中的两个测序批次(如在边缘分析中所做的那样)，我们在R[的默认设置下使用ComBat进行批效应校正。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．然后，70%的样本被随机分配到训练队列(n = 39个IA, n = 55个对照组)，30%的样本被随机分配到测试队列(n = 16个IA, n = 24个对照组)，保持IA和对照组的比例。gydF4y2Ba

对于训练队列中的特征选择，我们使用Hilbert-Schmidt独立准则最小绝对收缩和选择算子(HSIC LASSO)方法进行了监督特征选择。HSIC LASSO在ComBat校正数据集中实现，为模型选择特征。为了可视化这些选定的转录本如何从有和没有IAs的患者中分离样本，我们在默认设置下使用prcomp包进行主成分分析[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．遵循Xiong等的协变量相关分析[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]再次进行，以确定RNA质量(即RIN)是否会影响LASSO选择的tpm标准化转录本的表达水平。如果Pearson相关系数r > 0.80且p值< 0.01，则认为基因表达与RIN相关。gydF4y2Ba

模型训练gydF4y2Ba

我们使用MATLAB统计和机器学习工具箱(MathWorks, Natick, MA)在2个不同的基因面板上训练4个流行算法(k -最近邻，随机森林，高斯和三次核的支持向量机)——本研究中LASSO识别的37个转录本和我们之前研究中滤波识别的26个转录本。虽然这些算法已用于其他疾病分类应用[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，我们实现了所有4种算法，以确定哪种算法最适合我们的数据。各算法的具体参数如下:gydF4y2Ba

• 对于k - nearest Neighbors，我们使用欧几里得度量和10个邻居(k)。生成的模型通过计算测试样本与每个训练样本的距离来对测试样本进行分类，并通过选择测试样本10个最近邻居中最常见的类别来预测测试样本标签。gydF4y2Ba

• 对于随机森林，它在训练中构造大量决策树，并将类的模式输出为预测类[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，我们将树的数量设置为1000棵。随机森林是基于随机抽样和替换生成的训练数据子集构建大量决策树，并根据决策树的多数投票对测试样本进行分类。gydF4y2Ba

• 对于支持向量机，我们使用了两种不同的内核[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，高斯和立方。为了分离一个二进制标记的样本，支持向量机使用核将它们转换为多维空间，然后建立一个超平面，最大限度地扩大到任何一类样本的距离。得到的模型通过将测试样本转换为具有相应核的高维空间，并根据它们与超平面的符号距离进行决策，从而对测试样本进行分类。gydF4y2Ba

模型评估gydF4y2Ba

我们通过在训练队列中进行留一(LOO)交叉验证，估计了每个模型对新的lasso识别特征以及我们之前识别的26个特征的性能。将模型预测与每位患者的影像学临床诊断进行比较，并统计真阳性、真阴性、假阳性和假阴性。然后，我们计算每个模型的敏感性、特异性和准确性，如其他地方所述[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．基于模型预测，我们创建了受试者工作特征(ROC)曲线，并计算了ROC曲线下的面积(AUC)来评估模型性能。此外，为了衡量模型的预测价值，我们确定了阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。PPV和NPV的估算采用了先前描述的基于贝叶斯定理的公式[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba] 5%的动脉瘤患病率，在文献报道的IA患病率范围内(3.2-7% [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba])。然后在测试队列(n = 40)中独立评估分类模型，并将分类结果与临床诊断进行比较，以计算每个模型的真实敏感性、特异性和准确性。构建ROC曲线，并使用auc、PPV和NPV来评估每个分类器的性能。这是对在lasso选择的特征和之前26个特征上训练的算法进行的。gydF4y2Ba

检验临床协变量对基因表达差异的影响gydF4y2Ba

虽然我们将样本随机分配到训练或测试队列中，但这项研究并不是队列控制，而是使用了大量的异质人群。因此，IA状态以外的因素，如人口统计学或共病，可能会影响差异表达和模型性能。为了确定患者特征是否影响模型性能，我们首先进行卡方检验，以确定动脉瘤人群和对照组人群中是否存在不同的发生率。我们检查了性别、高血压、心脏病、中风、高胆固醇、癌症、糖尿病、关节炎、哮喘、吸烟状况和年龄。此外，我们在R中的MatchIt程序中进行了协变量匹配，在默认设置下为动脉瘤和对照组人群创建了6个协变量分布相似的亚类(年龄[60岁及以下vs 60岁以上]、性别、吸烟状况[非吸烟者vs当前吸烟者]、高血压、心脏病、中风史、高胆固醇、癌症、糖尿病、关节炎、哮喘和IA家族史)[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．为了创建子类，我们使用由逻辑回归模型确定的距离测量来估计倾向得分。然后，我们检查了每个子类的误分类率，以确定是否任何具有特定“协变量特征”的组与更大的误分类相关。gydF4y2Ba

生物信息学gydF4y2Ba

基因本体富集分析采用基因本体富集分析和可视化工具(GORILLA) [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．使用来自3个健康个体的中性粒细胞表达背景列表(每千碱基百万> 0.5个平均片段)来计算超几何统计学并赋予GO项显著性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．报道了p值< 0.001的GO函数和过程。匠心路径分析(IPA)软件(Qiagen Inc.，gydF4y2Bahttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysisgydF4y2Ba)用于研究edgeR识别的差异表达基因(q < 0.05, fold-change > 2)和LASSO在特征选择过程中选择的差异表达基因相关网络。每个基因标识符被映射到匠心知识库中相应的基因对象上，并叠加到由知识库中积累的信息派生出的分子网络上。基因网络是基于这些基因产物之间已知相互作用的“连通性”通过算法生成的。如果p-score≥15，网络被认为是显著的。网络分数的计算方法为p-score =−log10(p-value)，因此分数为15对应的p值为1E-15 [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

研究人群gydF4y2Ba

我们从符合数据和RNA质量标准的接受大脑DSA的个体中获得并分析了另外91个样本。结合我们之前分析的43个样本，我们的总数据集为134个中性粒细胞转录组——55个来自IA患者，79个来自对照组患者。研究人群特征见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；详细的动脉瘤特征在附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2。总体而言，134个样本的平均260/280比值为2.04(中位数:2.05)，平均RIN为6.7(中位数:6.7)，如附加文件中报告的质量数据所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3。IA患者有73个动脉瘤(其中12个人有多个IAs)，在2D图像上以最大直径测量，大小从1到19毫米不等。gydF4y2Ba

IA患者与对照组中性粒细胞RNA表达差异gydF4y2Ba

RNA测序数据用于鉴定IA组和对照组之间差异表达的中性粒细胞转录本。总体而言，我们的测序实验平均每个样本有5506万次读取和95%的读取映射率(或%对齐)，如附加文件中报道的那样gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3。图中的散点图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa显示IA患者与对照组的中性粒细胞表达差异，表达的平均折叠变化和显著性水平。edgeR差异表达分析发现65个转录本表达差异显著(q < 0.05, fold-change > 2)(图中红点和蓝点)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab). IA组23个基因表达较低，42个基因表达较高。对于所有差异表达的转录本，相关分析表明RIN不是一个显著的协变量;Pearson相关系数最大值为0.21，即R的决定系数gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.043 (RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_：gydF4y2Ba2.76E-6 ~ 0.043)， p值均< 0.01(补充文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2A)。使用所有转录组数据，我们进行了有监督的分层聚类，以确定基因表达是否也可以区分IAs患者和对照组。图中的树状图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac, IA组和对照组样本分离。树状图显示了7组主要为IA或对照样本(高亮部分)。总体而言，分级聚类将73%的样本聚集到各自的组中。gydF4y2Ba

生物信息学的结果gydF4y2Ba

为了从生物学角度深入了解IA组和对照组之间观察到的中性粒细胞RNA表达差异，我们使用基因集富集分析和生理通路建模进行了生物信息学分析。我们使用大猩猩分析与IA中表达增加和减少的edgeR基因相关的本体论，与健康个体的背景相比。IA表达增加的基因与细胞迁移、细胞运动性、T细胞迁移和淋巴细胞迁移过程相关。另一方面，IA表达降低的基因具有与钠通道活性、离子通道活性、门控通道活性以及膜电位过程的信号传递和调控相关的功能。附加文件中报告了与edgeR基因相关的完整本体列表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S4。IPA基因网络分析确定了3个显著网络，p-score分别为21、21和15(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．第一个网络与细胞形态、细胞间信号和相互作用、神经系统发育和功能有关，周围有枢纽gydF4y2BaIRS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRIK1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRIN2AgydF4y2Ba和l -谷氨酸。第二个网络与结缔组织的发育和功能，皮肤疾病和病症，有机体损伤和异常有关gydF4y2BaELAVL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCCND1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba在你gydF4y2Ba．最后，最后一个网络丰富了细胞死亡和存活、结缔组织疾病和炎症疾病功能，反映为一个主要的枢纽gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba．每个网络的相关分子和疾病/功能在附加文件中列出gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S5。gydF4y2Ba

RT-qPCR验证表达差异gydF4y2Ba

我们确认了9个突出的ia相关转录本的表达差异(gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGPR15gydF4y2Ba，gydF4y2BaHES4gydF4y2Ba，gydF4y2BaPVRL2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd163, cyp1b1, cdh2, zbtb16gydF4y2Ba，gydF4y2BaPTGDSgydF4y2Ba采用RT-qPCR (qPCR尝试在gydF4y2BaPDE9AgydF4y2Ba，但由于引物对效率低，结果未纳入;效率< 0.50)。选择这些基因是因为它们是显著差异表达的转录本，即在我们训练的模型中，在至少一个队列中高度丰富，或者显著差异表达。这一确认是在49个患者样本的子集中进行的，因为一个IA样本无法提供足够的数据进行所有基因的分析，因此这里不包括该数据。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表明，通过RNA测序和RT-qPCR计算，IA患者与非IA患者之间的表达差异方向相同，幅度相似，除了gydF4y2BaCDH2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaZBTB16gydF4y2Ba．qPCR与RNA测序结果有统计学差异gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaZBTB16gydF4y2Ba(p值均< 0.034)。只有gydF4y2BaZBTB16gydF4y2Ba与RNA测序结果相比，其折叠变化方向有显著性差异。gydF4y2Ba

选定的成绩单和模型培训gydF4y2Ba

使用LASSO的特征选择在训练队列中识别出37个具有显著表达的ia相关转录本，这些转录本用于使用4种机器学习算法创建模型。表格gydF4y2Ba2gydF4y2Ba报告37个模型基因的基因特异性准确性、敏感性和特异性。对于LASSO选择的所有转录本，相关分析也表明RIN不是一个显著的协变量;Pearson相关系数在0.54或R时最大绝对值< 0.08gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.29 (RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_：gydF4y2Ba4.36E−6至0.29)，尽管有11个基因的p值< 0.01(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2B)。gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba4gydF4y2Ba演示了PCA (a和d)、性能指标(b和e)和ROC曲线(c和f)，用于训练四种类型的机器学习模型，这些模型利用了新的37个转录本面板或我们原始的26个基因面板。图中的主成分分析gydF4y2Ba4gydF4y2BaA说明了这些转录本在训练队列中清楚地将动脉瘤样本与对照组分开的能力。与使用图中先前识别的26个基因的PCA相比。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad，从视觉上看，LASSO鉴定的转录本能够更好地分离IA组和对照组。gydF4y2Ba

图中报告了LOO交叉验证在训练队列中估计的敏感性、特异性、准确性、NPV和PPV。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB代表使用新的37个文本面板的模型。每种分类方法都取得了较高的性能，准确度在0.85至0.91之间。ROC曲线分析显示auc的范围为0.95至0.98(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)通过所有方法。所有模型的净现值都很高，约为1(0.98-1)。随机森林算法的灵敏度为0.87，特异性为0.95，准确率为0.92,AUC为0.98,NPV为0.99,PPV为0.46，优于k -最近邻算法和两种支持向量机算法。数字gydF4y2Ba4gydF4y2BaE报告了用26个先前识别的基因训练的4个分类模型的性能。敏感性、特异性、准确性、NPV和PPV在训练队列中通过LOO交叉验证进行估计。auc范围为0.71 ~ 0.92，如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf.使用LASSO选择的成绩单，培训队列的总体表现优越;使用新的37基因面板，4个模型的所有指标(准确性、敏感性、特异性、AUC、5% PPV、5% NPV)的平均值都更高。gydF4y2Ba

IA的预测模型具有较高的测试性能和NPVgydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba5gydF4y2Ba演示了用于测试机器学习模型的PCA (a和d)、性能指标(b和e)和ROC曲线(c和f)，这些模型使用了新的37个转录本面板或我们原来的26个基因面板。对测试数据进行主成分分析(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa)表明37个转录本可以区分IAs患者和对照组。使用37个新鉴定的转录本比使用26个先前鉴定的转录本，类之间的分离更明显。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).使用LASSO选择的37个特征，模型预测测试队列中的动脉瘤状态，准确度在0.83至0.90之间(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).图中的ROC分析。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac显示模型auc范围为0.95 ~ 0.99。在测试队列中，随机森林模型再次表现良好，敏感性为1.0，特异性为0.75，准确性为0.85,AUC为0.99。先前鉴定的26个基因面板的性能(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae, f)与检测队列中的37基因组相似，准确度为0.83 ~ 0.93,auc为0.84 ~ 0.97。虽然使用LASSO识别的37个基因组和之前识别的26个基因组的4个模型的平均准确性相同(86%)，但使用37个LASSO特征的模型具有更大的平均AUC (0.97 vs 0.91)。gydF4y2Ba

lasso选择转录本的生物信息学gydF4y2Ba

为了研究IA的生物学基础是如何具体地影响LASSO选择的基因的，我们仅使用37个新的面板基因(n = 23个在IA组中表达降低，n = 14个在IA组中表达增加)进行了生物信息学分析。IA组中表达降低的模型基因与凋亡执行阶段的负调控、内皮细胞增殖的负调控以及凋亡执行阶段的调控相关(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S6)。然而，IA组中表达增加的模型基因并没有返回任何显著的功能或过程。使用IPA产生的全部37个基因的两个网络具有显著的p得分(分别为47和25)。第一个网络展示了周围的枢纽gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMMP3gydF4y2Ba与癌症、细胞运动和结缔组织疾病有关。第二种周围有集线器gydF4y2BaHBBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaMAPKgydF4y2Ba与细胞周期、细胞组装和组织、DNA复制、重组和修复有关。我们注意到gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba被合并到使用edgeR和LASSO基因集生成的网络中。见图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S7为这些网络的详细信息，包括相关分子和顶级疾病和功能。gydF4y2Ba

临床协变量的存在和对模型性能的影响gydF4y2Ba

表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba显示了动脉瘤和对照人群的人口统计学和共病率。IA人群中只有吸烟明显较高(p = 0.017)，这是可以预料的，因为吸烟是IA和IA破裂的众所周知的危险因素[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．我们使用MatchIt创建了5个子类，因为在第6个子类中样本太少了。37基因预测模型对每个亚类的错分类范围为8%至19%，这表明没有一个亚类可能导致错分类。gydF4y2Ba

更强大的机器学习策略提高生物标记物的性能gydF4y2Ba

在这项研究中，我们实现了一种新的机器学习策略，用于IA生物标记物的发现，其中包括更大的数据集(94次训练，40次测试)，用于特征选择的LASSO，以及更健壮的算法，K-Nearest Neighbor，随机森林，以及具有立方和高斯核的支持向量机。我们更大的数据集和LASSO特征选择导致了一个新的37个基因面板用于IA预测模型。这37个基因中的两个，gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTGS1gydF4y2Ba，也在我们之前发现的26个基因组中。使用37个基因训练的新学习算法在测试队列中都表现得非常好，准确率为0.83-0.90,auc为0.95-0.99，比我们之前的算法有了显著提高。有趣的是，所有4个新模型的NPV都为1，这表明在测试数据集中不存在假阴性。这可能对未来应用这些生物标记物作为预筛选很重要，因为假阴性将特别有害。gydF4y2Ba

为了检查样本量的增加和改进的算法如何影响模型性能，我们在当前更大的数据集中使用新算法重新训练了之前的26个基因面板。在使用26基因面板的测试集(n = 40)中，重新训练的模型的性能较我们之前的研究有所改善，准确度在0.83至0.93之间，auc为0.84-0.97。尽管使用新算法的性能有所提高，但使用先前识别的26个基因的模型仍然低于使用新识别的37个基因的模型;使用26个基因的平均AUC为0.91，而使用37个基因的平均AUC为0.97。这表明，LASSO识别的37个特征比我们上一项研究中筛选的26个特征更可靠。gydF4y2Ba

改进的IA预测可以归因于我们增加的样本量，这提供了几个优势。首先，它允许我们使用LASSO来识别特征，而不是简单的过滤方法。阈值过滤器，正如我们之前所使用的，独立考虑每个基因，这可能会忽略在病理生理机制中共同发挥作用的基因组，并可能用作生物标志物。过滤方法还可以选择高度相关的冗余基因，增加做出准确预测所需的特征数量。HSIC LASSO，一种非线性特征选择方法，克服了这些问题，并识别出非冗余基因组合与疾病状态的强烈依赖。在训练数据集中实施LASSO识别出37个独特的ia相关基因，其中两个(gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTGS1gydF4y2Ba)在我们上次的表达谱研究中也被确定为26个基因组的一部分[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．非冗余特征的识别可能是本研究中创建的生物标记物优于我们过去努力的原因之一，因为26个特征中的一些(除了)gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTGS1gydF4y2Ba)可能最终对分类没有帮助。gydF4y2Ba

其次，更大的样本量也使我们能够利用更复杂的机器学习模型，即支持向量机和随机森林，它们在更大的数据集中表现得更好[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．在我们之前的工作中，我们确实实现了支持向量机，但只实现了0.70的测试精度，可能是因为训练数据集只包含30个患者[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在这个更大的研究中，我们能够实现0.85的支持向量机(高斯核)的精度。尽管如此，我们发现随机森林在我们的数据中始终表现最好，测试精度为0.85,AUC为0.99。随机森林和k近邻都是加权近邻方案。然而，K-Nearest Neighbors算法的性能可能较差，因为该分类器只是使用训练数据进行预测，而不是学习判别规则。K-Nearest Neighbors分类器的性能依赖于训练数据的质量，在来自人类样本的转录组的情况下可能有噪声。然而，这个问题在随机森林中得到了很好的解决。通过随机抽样过程，随机森林通过将异常值分类来处理它们。此外，随机森林方法通过对决策树进行平均，提供了一个低偏差和中等方差的模型，提高了输出模型的可泛化性。也就是说，Random Forest不仅在训练数据中表现良好，而且在未知(测试)数据中也表现良好。 And while Support Vector Machine performed well here, Random Forest likely surpassed Support Vector Machine by avoiding overfitting and achieving better predictive power.

我们注意到，样本量的增加可能导致我们的数据中有更多的可变性，这是由于一个更大的、非队列控制的异质人群。例如，在我们的整个人群中，我们发现IA患者吸烟明显更高(χ = 0.017)，这可能是因为吸烟是IA形成和破裂的众所周知的危险因素[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．在我们的模型中确实有两个基因，gydF4y2BaLRRN3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGPR15gydF4y2Ba桓等人的一项荟萃分析显示，这些基因是当前吸烟者和从不吸烟者血液中差异表达最多的基因之一。[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba它们在我们的预测模型中的存在可能是因为IA组中吸烟者的比例较高，或者因为这些基因捕获了与吸烟相关的生物学机制，这些机制在IA发病机制中很重要，如内皮功能障碍[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．尽管如此，当我们使用MatchIt进行协变量分析来创建IA组和对照组之间协变量分布相似的子组时，我们发现没有一个子组有明显更高的误分类率。例如，在“子类5”中，61%的受试者是吸烟者，而这个亚组的误分类率为13%。然而，“亚类1”的吸烟者为0%，误分类率为14%。这些结果表明，我们的预测模型可能不会受到协变量不平衡的很大影响，尽管需要在更大的队列中进行测试以确认这些结果。gydF4y2Ba

循环中性粒细胞在颅内动脉瘤中的复杂作用gydF4y2Ba

炎症被广泛认为在IA的病理生理学中起着核心作用[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．通常认为IA中的中性粒细胞被招募到囊内，在囊内浸润壁并协调炎症反应[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．在本研究中，基因本体富集分析显示，在整个数据集中，通过edgeR识别出IA中表达较高的基因与细胞迁移和淋巴细胞迁移本体相关。在我们之前的研究中，也在IAs患者的中性粒细胞中观察到这些过程[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，在外周激活时增加，并促使炎症细胞迁移和病变组织浸润[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．IPA分析反映了这些结果，显示了3个重要的网络，其中2个涉及激活相关过程:细胞间信号和相互作用，以及炎症疾病功能。有趣的是，所有网络中最大的基因连接节点之一是gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba是一种促炎细胞因子，具有多种功能，包括调节细胞增殖和凋亡。gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba在动物模型中已被证明对IA的形成具有机械性作用，[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]与颞浅动脉控制组织相比，IA在人类组织中的存在增加[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．在这个网络中，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba有预测的联系吗gydF4y2BaDEFA1gydF4y2Ba，在IA患者的中性粒细胞中显著升高。在IA组织中，中性粒细胞颗粒中含有较高水平的这种细胞毒性防御素蛋白，这表明在中性粒细胞进入IA壁之前，这种蛋白的产生可能发生在外周[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．这里是分子gydF4y2BaCCR4gydF4y2Ba(它是一种受体gydF4y2BaMIP-1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba激昂的演说gydF4y2Ba，gydF4y2BaCCL17gydF4y2Ba,gydF4y2BaMCP-1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba),gydF4y2BaCCR6gydF4y2Ba(它是一种受体gydF4y2BaMIP-3αgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]也与gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba节点。我们怀疑这些在炎症期间树突细胞和T细胞迁移和招募中发挥作用的受体，[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba一旦在动脉瘤组织中表达，可能会协调炎症细胞的迁移。gydF4y2Ba

我们还观察到炎症的失调和潜在的作用gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba在LASSO在训练数据集中选择的模型基因的生物信息学分析中。gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba是使用LASSO基因创建的网络中的连接枢纽。在这些网络中，我们观察到之间的间接关系gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba而补体系统(即。gydF4y2BaC1QTNF1gydF4y2Ba)，也与gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba(37种模式基因之一)。这可能是因为补体激活在炎症反应中起着关键作用，[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]与IA壁的降解和破裂有关，[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]并涉及在人类IA组织中增加的蛋白质(包括gydF4y2Ba循环流化床gydF4y2Ba，gydF4y2BaCFHgydF4y2Ba，gydF4y2BaC1QgydF4y2Ba,gydF4y2BaC3AR1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba79gydF4y2Ba])。我们怀疑补体替代途径可能是中性粒细胞被激活的一种机制，因为它可以通过正反馈机制放大激活[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．除了补充成员，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba节点也与gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba它是一种细胞表面糖蛋白，在炎症过程中对中性粒细胞募集至关重要。因为中性粒细胞相互作用gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba，gydF4y2BaPSGL-1gydF4y2Ba,gydF4y2Bae -选择素配体1gydF4y2Ba当中性粒细胞沿着被激活的内皮细胞滚动时，这一结果可能反映了中性粒细胞转移到发炎的内皮细胞[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．我们的数据显示gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba也可能与转录因子相互作用gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba这是一个与许多分子相连的节点，其中许多分子表达下降。gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba在炎症中发挥多种作用，如作用于NF- κB通路[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．NF- κB是IA发病机制中的关键转录因子，它控制着血管壁的炎症反应[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．NF-κB的活化导致κ b蛋白的上调gydF4y2BaMCP-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaVCAMgydF4y2Ba其功能是将单核细胞招募到IA腔内，在那里它们变成巨噬细胞并分泌MMP-2和MMP-9以降解细胞外基质[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．总的来说，我们对LASSO选择的基因进行了生物信息学分析，而与edgeR选择的差异表达基因在整个数据集中没有很大的重叠(除了gydF4y2BaC1QL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRP15gydF4y2Ba)，表明中性粒细胞激活和炎症反应的生物学是由IA预测模型基因面板捕获的。gydF4y2Ba

除了中性粒细胞激活和炎症信号增强外，我们还观察到IA中未特征性的其他异常中性粒细胞功能，包括我们之前的研究[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在edgeR在整个数据集中识别的基因中，基因本体富集分析显示IA中表达降低的差异表达基因具有与钠通道活性、离子通道活性和门控通道活性相关的功能，以及膜电位过程的信号通路和调控功能(gydF4y2BaASIC2gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRIK3gydF4y2Ba，gydF4y2BaSCN5AgydF4y2Ba)．gydF4y2BaGRIK3gydF4y2Ba尤其有趣的是，谷氨酸是中性粒细胞损伤或感染后的趋化因子[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba］．谷氨酸与其受体结合可触发细胞因子和基质金属蛋白酶的释放，并可激活免疫反应，这些都是IA的关键过程[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．未来的研究需要更好地了解这些通道活动如何影响IA发病机制。gydF4y2Ba

使用LASSO在训练数据集中识别的基因也捕获了新的本体。利用IA中低表达的LASSO基因，我们发现了凋亡的调控异常，因为基因本体富集分析既报道了凋亡执行阶段的负调控，也报道了凋亡执行阶段的调控。这些都与gydF4y2BaRFFLgydF4y2Ba，这已被证明与gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba信号(gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．本体论也与gydF4y2BaMTRNR2L1 (mtrnr2 like 1)gydF4y2Ba其功能可能与Humanin相似(gydF4y2BaMTRNR2gydF4y2Ba)，通过抑制几种凋亡途径来防止细胞死亡。一些研究表明，通过这种方式，Humanin可能是一种神经保护因子，可以影响阿尔茨海默病和其他血管病变相关的神经退行性疾病[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．也许在我们的研究中，是失调gydF4y2BaMTRNR2L1gydF4y2Ba表达(as well as。gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba，亦会诱导细胞凋亡)[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]可能是增加中性粒细胞寿命的原因，这将进一步证明中性粒细胞在IA中活化。这些结果与Jin等人发表的IA的血液分析研究相呼应。[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．他们报道了IA血清中上调的miRNA hsa-miR-21通过细胞外信号诱导细胞凋亡，可能引发更多的凋亡反应，以促进内侧变薄和破坏性重塑，这是IA发病的一个标志[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba，gydF4y2Ba96gydF4y2Ba，gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．总的来说，我们怀疑捕获IA中涉及的中性粒细胞激活和炎症反应是37基因小组能够检测到IA的原因。gydF4y2Ba

限制gydF4y2Ba

在本研究中，我们通过在之前分析的40个样本中增加94个样本来增加样本量。然而，这两个批次使用了不同版本的Illumina试剂盒来制备文库，这就需要实施批量效应校正，这可能会导致我们的数据集出现偏差或倾斜[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．其次，对RIN值范围较大的样品进行RNA测序。虽然我们证明RIN不是差异表达的显著协变，但在未来的方法中，如Xiong等人开发的DegNorm。[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]可以用来纠正RNA降解差异引起的表达变化，并可能产生更准确的结果。第三，所有的样本都是从单一中心接受脑成像的患者中招募的，这可能会产生选择偏差。未来的研究需要使用来自多个中心的更广泛的患者群体来验证我们的预测模型。第四，IA以外的炎症或血管疾病会影响模型预测。需要对患有其他血管和炎症疾病的多个对照组进行更大规模的研究来完善我们的模型。最后，需要使用更有效的探针(引物)对模型基因进行更严格的qPCR，以将该基因面板转化为可以在技术重复中显示输出线性和可重复性的分析。gydF4y2Ba

通过在大型数据集中使用LASSO进行特征选择和强大的机器学习技术，我们提高了循环中性粒细胞转录本的IA预测模型性能。随机森林算法表现最好，测试AUC为0.99。所有134个样本的生物信息学研究表明炎症贯穿始终gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba中性粒细胞激活是IA的关键过程。使用37个lasso选择的基因的IPA网络也反映了这些增加的炎症和信号通路。合并症和人口统计学对IA的预测没有显著影响。需要进一步的研究来验证这些预测模型。gydF4y2Ba

本研究中使用的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

AUC:gydF4y2Ba

ROC曲线下面积gydF4y2Ba

BAM:gydF4y2Ba

二进制对齐图gydF4y2Ba

基类库:gydF4y2Ba

每个周期base-callgydF4y2Ba

CTA:gydF4y2Ba

计算机断层血管造影术gydF4y2Ba

DSA:gydF4y2Ba

数字减影血管造影术gydF4y2Ba

ECM:gydF4y2Ba

细胞外基质gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

大猩猩:gydF4y2Ba

基因本体丰富分析与可视化gydF4y2Ba

仿人智能控制:gydF4y2Ba

希尔伯特-施密特独立准则gydF4y2Ba

IA:gydF4y2Ba

颅内动脉瘤gydF4y2Ba

异丙醇:gydF4y2Ba

匠心路径分析gydF4y2Ba

套索:gydF4y2Ba

最小绝对收缩和选择算子gydF4y2Ba

厕所:gydF4y2Ba

离开一出gydF4y2Ba

MPO:gydF4y2Ba

髓过氧物酶gydF4y2Ba

查看:gydF4y2Ba

磁共振血管造影gydF4y2Ba

核磁共振成像:gydF4y2Ba

磁共振成像gydF4y2Ba

NGAL:gydF4y2Ba

中性粒细胞明胶酶相关脂脂素gydF4y2Ba

净现值:gydF4y2Ba

负预测值gydF4y2Ba

主成分分析:gydF4y2Ba

主成分分析gydF4y2Ba

PPV:gydF4y2Ba

阳性预测值gydF4y2Ba

qPCR:gydF4y2Ba

定量聚合酶链反应gydF4y2Ba

RIN:gydF4y2Ba

RNA的完整性gydF4y2Ba

中华民国:gydF4y2Ba

Receiver-operating-characteristicgydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

实时定量聚合酶链式反应gydF4y2Ba

TPM:gydF4y2Ba

百万分转录率gydF4y2Ba

我们感谢参与本研究的患者，Jonathan Bard MA和Brandon Marzullo MS为RNA测序数据分析提供帮助，Jennifer L. Gay CCRP为研究方案管理提供帮助。这项工作部分是在纽约州生物信息学和生命科学卓越中心的基因组学和生物信息学核心进行的。gydF4y2Ba

这项工作由国家科学基金会1746694号奖资助，由神经血管诊断公司、脑动脉瘤基金会、纽约州大数据和健康科学先进技术中心和卡明斯基金会资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Kerry E. Poppenberg和Vincent M. Tutino对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 佳能中风和血管研究中心，临床和转化研究中心，埃利科特街875号，布法罗，NY, 14214，美国gydF4y2Ba

   Kerry E. Poppenberg, Vincent M. Tutino, Kenneth V. Snyder, Elad I. Levy, Adnan H. Siddiqui, John Kolega & Hui孟gydF4y2Ba

2. 美国布法罗大学生物医学工程系gydF4y2Ba

   Vincent M. Tutino & Hui孟gydF4y2Ba

3. 美国布法罗大学计算机科学与工程系gydF4y2Ba

   李陆gydF4y2Ba

4. 美国布法罗雅各布斯医学与生物医学学院神经外科gydF4y2Ba

   Kerry E. Poppenberg, Vincent M. Tutino, Muhammad Waqas, Kenneth V. Snyder, Elad I. Levy, Adnan H. Siddiqui & Hui孟gydF4y2Ba

5. 美国布法罗雅各布斯医学和生物医学科学学院遗传学、基因组学和生物信息学项目gydF4y2Ba

   蒋开宇，詹姆斯·n·贾维斯，孙怡君gydF4y2Ba

6. 美国布法罗雅各布斯医学和生物医学学院儿科学系gydF4y2Ba

   詹姆斯·n·贾维斯gydF4y2Ba

7. 美国布法罗雅各布斯医学与生物医学学院微生物学与免疫学系gydF4y2Ba

   我的太阳gydF4y2Ba

8. 美国布法罗雅各布斯医学与生物医学学院放射科gydF4y2Ba

   Kenneth V. Snyder, Elad I. Levy和Adnan H. SiddiquigydF4y2Ba

9. 美国布法罗雅各布斯医学与生物医学学院神经学系gydF4y2Ba

   Muhammad Waqas & Kenneth V. SnydergydF4y2Ba

10. 美国布法罗雅各布斯医学与生物医学学院病理解剖科学系gydF4y2Ba

    文森特·m·图蒂诺，阿蒙德·琼和约翰·科勒加gydF4y2Ba

11. 布法罗大学机械与航空航天工程系，布法罗，纽约，美国gydF4y2Ba

    回族孟gydF4y2Ba

12. 美国布法罗雅各布斯医学和生物医学学院内科gydF4y2Ba

    李查维斯gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

研究构想与设计:KEP、VMT、JNJ、JK、HM。数据采集:KEP、VMT、MW、AJ、LC、KVS、EIL、AHS。数据分析与解释:KEP, VMT, LL, LC, KJ, JNJ, YS, JK, HM。稿件起草:KEP, VMT, LL, JNJ, YS, JK, HM。关键修订:KEP, VMT, LL, MW, AJ, LC, KJ, JNJ, YS, KVS, EIL, AHS, KJ, HM。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba回族孟gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

这项研究得到了布法罗大学健康科学机构审查委员会的批准(研究编号:;030 - 474433)。所有方法均按照批准的方案进行，并获得所有受试者的知情同意。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

手稿中没有给出具体的患者信息或图像。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

KEP, LL, MW, AJ, LC, KJ, YS, JK-None。VMT -首席研究员:国家科学基金会奖编号1746694，脑动脉瘤基金会拨款，先进技术中心拨款，以及上面提到的卡明斯基金会拨款。联合创始人:神经血管诊断公司jnj -首席研究员:NIH授权R01-AR-060604。kvs -为佳能医疗系统公司、半影公司、美敦力公司和雅各布斯研究所提供咨询和教学服务。联合创始人:神经血管诊断公司EIL-Intratech Medical Ltd.， NeXtGen Biologics。首席研究员:美敦力美国SWIFT PRIME试验。Honoraria-Medtronic。Consultant-Pulsar血管。 Advisory Board-Stryker, NeXtGen Biologics, MEDX. Cognition Medical. Other financial support—Abbott Vascular for carotid training sessions. AHS—Financial Interest/Investor/Stock Options/Ownership: Amnis Therapeutics, Apama Medi- cal, BlinkTBI, Inc, Buffalo Technology Partners, Inc., Cardinal Health, Cerebrotech Medical Systems, Inc, Claret Medical, Cognition Medical, Endostream Medical, Ltd, Imperative Care, International Medical Distribution Partners, Rebound Therapeutics Corp., Silk Road Medical, StimMed, Synchron, Three Rivers Medi- cal, Inc., Viseon Spine, Inc. Consultant/Advisory Board: Amnis Therapeutics, Boston Scientific, Canon Medical Systems USA, Inc., Cerebrotech Medical Systems, Inc., Cerenovus, Claret Medical, Corindus, Inc., Endostream Medical, Ltd, Guidepoint Global Consulting, Imperative Care, Integra, Medtronic, Micro- Vention, Northwest University—DSMB Chair for HEAT Trial, Penumbra, Rapid Medical, Rebound Therapeutics Corp., Silk Road Medical, StimMed, Stryker, Three Rivers Medical, Inc., VasSol, W.L. Gore & Associates. National PI/Steering Committees: Cerenovus LARGE Trial and ARISE II Trial, Medtronic SWIFT PRIME and SWIFT DIRECT Trials, MicroVention FRED Trial & CONFIDENCE Study, MUSC POSITIVE Trial, Penumbra 3D Separator Trial, COMPASS Trial, INVEST Trial. HM— Principal investigator: NIH Grants R01-NS-091075 and R01-NS-064592. Grant support: Canon Medical Systems. Co-founder: Neurovascular Diagnostics, Inc.

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba