糖尿病患者细胞外囊泡诱导内皮细胞形态和迁移的改变gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

炎症相关的动脉粥样硬化性周围血管疾病是糖尿病的主要终末器官并发症，导致严重的发病率和死亡率。细胞外囊泡(EVs)是纳米大小的颗粒，含有分子货物并在血液中循环。在这里，我们检测了来自糖尿病患者的EV蛋白，以及这些EV是否会导致内皮细胞的功能改变。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

我们量化了来自正常血糖和糖尿病患者纵向队列的血浆源EVs中的炎症蛋白水平，并使用体外内皮细胞生物学检测来评估这些来自横断面队列样本的EVs的功能影响。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现EV炎症蛋白水平与糖尿病状态之间存在一些显著相关性。在我们的纵向队列中，血管生成因子，血管内皮生长因子A (VEGF-A)与糖尿病相关。与正常血糖者相比，糖尿病患者的EV VEGF-A水平更高。此外，VEGF-A的EV水平与胰岛素抵抗(HOMA-IR)和β细胞功能(HOMA-B)的稳态模型评估显著相关。为了测试不同炎症载体的ev是否对内皮细胞有不同的影响，我们进行了细胞迁移和免疫荧光分析。我们观察到，与正常血糖患者的ev相比，糖尿病患者的ev增加了细胞板足底的形成和迁移。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在糖尿病个体的ev中发现了更高水平的炎症蛋白。我们的数据表明，EVs在糖尿病患者发生的周围血管疾病中起着重要作用，并提示EVs可能作为糖尿病的信息诊断工具。gydF4y2Ba

在美国，有近3030万人患有2型糖尿病，占总人口的9.4% [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．2型糖尿病是一种复杂的、与年龄相关的代谢疾病，以低度慢性炎症为特征[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]、高胰岛素血症[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，胰岛素抵抗和β细胞功能障碍。它还增加了许多与血管相关的合并症的风险，包括终末期肾病[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，心血管[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]、脑血管[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]、冠状动脉[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，周围血管[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]、慢性肾[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，以及眼科疾病[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在过去几十年里，糖尿病患者合并心血管疾病(CVD)的人数有所增加，这反映了糖尿病的流行[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．心血管疾病是导致死亡的主要原因，在糖尿病患者的医疗费用中所占比例最高[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．除老年人口外，糖尿病还在美国少数族裔群体中造成不成比例的发病率和死亡率，包括非洲裔美国人、西班牙裔美国人和美洲原住民[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．为了创造出有益于广泛人群的诊断工具和治疗方法，需要对糖尿病中血管疾病的驱动机制有更多的了解。gydF4y2Ba

许多与糖尿病相关的心血管疾病都可归因于内皮功能障碍，而内皮功能障碍可导致动脉粥样硬化[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．在糖尿病中，由于内皮源性因子失衡，血管不能正常舒张，就会发生内皮功能障碍[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．氧化应激和炎症可导致血管功能障碍[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．此外，内皮功能障碍与胰岛素抵抗有关[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]和β细胞功能受损[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．然而，找到一种靶向炎症以改善血管内皮健康的方法仍然是临床试验中的一个挑战[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

最近的数据表明，细胞外囊泡(EVs)是一种来源于膜的颗粒，在各种疾病过程中促进细胞间通信[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．ev的尺寸从30 ~ 400纳米不等，可以在细胞间运送分子货物，包括脂质、核酸和蛋白质。根据其生物发生模式，ev可分为(a)外泌体，其由多囊泡体与质膜融合后分泌，(b)微囊泡，其从质膜的细胞外表面挤压，以及(c)凋亡小体，其在细胞凋亡过程中从质膜脱落[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．最近，在微分超离心过程中分离的部分被称为小型ev (sev)和中型ev，而不是分别称为外泌体和微囊泡[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

从血液样本中分离出的ev可能会导致新的和改进的诊断工具和治疗方法[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]治疗多种疾病，包括糖尿病[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．在过去的几十年里，大量的注意力集中在被称为微粒的较大ev在2型糖尿病中的作用上。最近一项对34项研究的荟萃分析表明，与非糖尿病对照组相比，2型糖尿病患者的总循环微粒水平以及来自血小板、单核细胞和内皮细胞的微粒水平更高[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．最近的技术进步已经允许分析比微粒更小的ev (~ 30-400 nm)。根据我们小组先前的纵向和横断面研究，糖尿病患者血浆中EVs的循环水平高于正常血糖对照组[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．此外，我们发现胰岛素抵抗增加了EV的分泌，而来自糖尿病个体的EV增加了单核细胞的细胞因子分泌。这些发现与其他人类研究一致，表明ev在促进胰岛素抵抗和炎症方面具有重要作用[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ev可通过传递分子货物对靶细胞产生功能效应，包括病理效应[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在糖尿病研究中尚未广泛探讨ev可能导致内皮功能障碍，从而导致心血管疾病的进展。最近的一项研究验证了这一想法，该研究发现，用来自糖尿病小鼠的含精氨酸酶1的血清来源ev治疗，可以诱导非糖尿病小鼠的内皮功能障碍[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了研究可能导致糖尿病炎症、胰岛素抵抗和内皮功能障碍的分子负载，我们在糖尿病和正常血糖人群的纵向队列中分析了EVs的炎症蛋白含量。然后，我们通过测试糖尿病人的ev对肌动蛋白细胞骨架结构和人主动脉内皮细胞迁移行为的影响进一步探索了我们的数据。gydF4y2Ba

临床研究参与者gydF4y2Ba

正常血糖和糖尿病患者的纵向和横断面队列是从美国国立卫生研究院(NIH)国家老龄化研究所(NIA)校内研究项目的“跨寿命多样性社区健康老龄化”(HANDLS)研究中选择的[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．HANDLS是一项跟踪社区居住参与者的纵向研究，目的是更好地了解与种族和社会经济地位有关的年龄相关疾病。如果个人报告已接受医疗保健提供者的诊断，正在服用糖尿病药物或空腹血糖为> 125 mg/dL，则将其归类为糖尿病人。在禁食一晚后采集血浆样本[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

以前，我们在纵向队列中检查了EV特征[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．该队列根据身体质量指数(BMI)类别进行匹配，包括在两次访问期间收集血液样本的参与者，时间间隔约为5年(4.95±0.23)。参与者包括19名在两次就诊时血糖正常的患者，19名在第一次就诊时血糖正常，第二次就诊时糖尿病患者，20名在第一次就诊时糖尿病前期，第二次就诊时糖尿病患者gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．横断面队列匹配BMI，包括9名正常血糖患者和9名糖尿病患者gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．BMI分为体重不足/正常(< 25 kg/m)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，超重(25 ~ < 30 kg/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)， I类肥胖(30 ~ < 35 kg/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)、II/III类肥胖(≥35 kg/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)．基于空腹血糖和胰岛素水平计算胰岛素抵抗(HOMA- ir)和β细胞功能(HOMA- b)的稳态模型评估(HOMA) [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．对HOMA-IR和HOMA-B进行自然对数变换后进行统计分析。gydF4y2Ba

ExoQuick EV隔离gydF4y2Ba

如前所述，采集空腹血浆样本[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．如先前报道，对于两个队列，ev都是分离的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，从0.5 mL血浆中使用ExoQuick外泌体沉淀溶液(System Biosciences)。ExoQuick提供了最可重复的结果，以及最容易隔离的大型人类队列[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．从ExoQuick分离的样品用于蛋白质组学实验。gydF4y2Ba

差动超离心EV隔离gydF4y2Ba

利用差速超离心从血浆中分离EVs。血浆加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)，然后在500度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba温度2500，持续10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟，1万次gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟，对于10000人来说gydF4y2BaggydF4y2Ba旋转时，贝克曼库尔特超离心机与SW 55钛转子(K = 48)用于分离颗粒用于免疫印迹和电子显微镜，SW 32钛转子(K = 204)用于其余的实验。然后，样品在12万温度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba使用SW 55 Ti转子(K = 48)分离2小时，用于免疫印迹和电子显微镜，并使用SW 32 Ti转子(K = 204)进行其他实验。收集每个样品中的颗粒，然后在最后旋转12万之前在PBS中重新悬浮gydF4y2BaggydF4y2Ba2小时(SW 55 Ti转子)。来自10000的颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba(1万)和12万gydF4y2BaggydF4y2Ba(120K)旋重悬于无菌PBS中。对于涉及囊泡计数的实验，10K部分经历了前面提到的另一次旋转[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．用于免疫印迹，EV颗粒直接在50µL的哺乳动物蛋白提取试剂(M-PER)中与磷酸酶和蛋白酶抑制剂裂解。在电子显微镜下，EV微球在无菌的4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液中在生理pH下重悬。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

将CEM (T淋巴母细胞)细胞裂解液和等量的裂解EV在SDS-PAGE凝胶上运行，然后用已知EV蛋白标记物进行免疫印迹，包括Alix (sc-271975;Santa Cruz Biotechnology)， Flotillin 1;Abcam)， CD81 (EXOAB-CD81A-1;System Biosciences)、EV纯度标记物GM130 (ab52649;Abcam)。gydF4y2Ba

电子显微镜gydF4y2Ba

电子显微镜图像由约翰霍普金斯大学神经学显微镜核心使用Veleta相机(奥林巴斯)拍摄，如前所述[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．网格在120kv(蔡司)的天秤座120 TEM上观察。gydF4y2Ba

纳米颗粒跟踪分析gydF4y2Ba

从差速超离心分离的ev在无菌PBS中稀释至1:50。使用Nanosight NS500 (Malvern Instruments)上的纳米颗粒跟踪分析(NTA)确定样品的浓度和尺寸分布。在摄像机级别为14和检测级别为3的情况下，每个样本记录5个20秒的视频。使用NanoSight Software NTA 3.2 Build 3.2.16进行分析。为了准确起见，每个队列或实验的样本都是在相同的时间段、使用相同的仪器、由相同的操作员测量的。血浆中EV总浓度的计算如前文所述[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多重接近扩展分析gydF4y2Ba

纵向队列中个体的血浆来源ev在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的M-PER中裂解。使用Bradford法定量蛋白质含量，并在所有样品中调整到相同的水平。按照Olink的建议，使用等量的蛋白质gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba蛋白质组学，由于蛋白量并不总是与EV制剂中的颗粒计数相关[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．每个EV裂解液20 μl (f.c. 1.1 μg/μl)，取22 μg蛋白加入96孔板，用Olink分析gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba蛋白质组学生物标志物炎症小组使用接近扩展检测(PEA)技术(OlinkgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba蛋白质组学)。PEA允许多种蛋白质的敏感和特异性检测。实验不考虑群体状态。每个步骤都使用了内部控制，包括考虑背景水平的负控制和考虑不同板的板间控制。蛋白质数据归一化到分析间和分析内对照，并在日志上表示为归一化蛋白质表达(NPX)单位gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba规模。Olink共测试了92种蛋白质gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba炎症面板。我们在样本中发现了66种可检测到的蛋白质。在66种蛋白质中，33种蛋白质在检测下限时满足了我们的阈值，即低于30%，这意味着这些蛋白质中的每一种都存在于所有EV样本的70%以上。使用线性混合模型回归分析其余蛋白质的纵向数据。CCL4、CXCL6和FGF-21都表现出正偏态分布，因此这些蛋白质的数据是自然对数转换的。gydF4y2Ba

内皮细胞培养gydF4y2Ba

人主动脉内皮细胞(HAECs;cc - 2535;Lonza)在EBM-2内皮细胞生长基础培养基-2 (CC-3156;EGM-2 Endothelial SingleQuots Kit (CC-4176;Lonza)。为迁移实验做准备，将HAECs在无血清EBM-2培养基中孵育2小时。用胰蛋白酶将HAECs从培养皿中分离，然后加入中和液和HEPES缓冲液。然后在实验前将细胞离心并重悬在无血清EBM-2培养基中。gydF4y2Ba

迁移分析gydF4y2Ba

Transwell聚碳酸酯嵌件底部(孔隙8.0 μm;3422;用胶原蛋白(30µg/mL)在37℃下包被1小时，然后在37℃下用1% BSA在PBS中堵塞1小时。使用差速超离心分离ev，并使用来自10K或120K颗粒的馏分。对于每个试验组，来自横断面队列的3个个体的ev被合并，并以~ 1.8 × 10的剂量添加gydF4y2Ba^8gydF4y2Baev到含有500 μ L无血清EBM-2介质的井底室。以VEGF-A (0.05 μg)为阳性对照。血清饥饿的HAECs，剂量为~ 2.5 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2BasEV (120K)法和~ 1.2 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba将用于中型(10K) EV测定的细胞添加到转井中，在37°C下迁移3小时。然后用PBS清洗过滤器。转井顶部剩余的haec被移除。用3.7%的甲醛在PBS中固定haec 15分钟，用0.5%的Triton在TBS中渗透3分钟。用PBS洗涤细胞，用4 '，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI;32670;Sigma)，然后再进行PBS冲洗。然后将滤光片从转井上切割下来，安装在带有抗褪色介质的载玻片上。使用蔡司Axio Observer D1倒置荧光显微镜和AxioCam1Cc1相机在40倍物镜下获取图像。计数各野dapi染色核。gydF4y2Ba

免疫荧光gydF4y2Ba

HAECs(约15,000个细胞)在EBM-2培养基中用5%外泌体耗尽胎牛血清(A2720803;在另外24小时，HAECs与从横断面队列中个体的10K部分血浆中分离出来的ev孵育，并使用先前报道的每个细胞约1000个囊泡剂量[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．对正常血糖组和糖尿病组各进行3次重复实验。用PBS清洗两次，在3.7%甲醛/PBS中固定15分钟，然后用0.5% Triton X-100渗透3分钟。在用罗丹明Phalloidin进行肌动蛋白染色之前，用1X TBS清洗两次HAECs (R415;赛默飞世尔科学公司)。用TBS冲洗haec，用DAPI染色细胞核。用抗褪色介质清洗封面并安装在载玻片上。图像采集使用相同的显微镜和物镜用于迁移分析。gydF4y2Ba

肌动蛋白皱褶的定量研究gydF4y2Ba

如果每个细胞至少有一个厚的、卷曲的、富含肌动蛋白的结构，与先前描述的定量相似，则细胞为板足底/褶边阳性评分[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．只计算小于一个细胞边界的细胞。细胞数量以dapi染色细胞核总数的百分比进行量化。每个实验计算大约50个细胞，并计算三个不同实验的平均值。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba对于纵向队列，使用单向方差分析分析连续变量，对于横断面队列，使用学生的方差分析gydF4y2BatgydF4y2Ba使用Test。在纵向队列中使用χ对分类变量进行分析gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba拟合优度检验，在横断面队列中使用Fisher精确检验。PEA分析数据使用R, version 3.3.2 [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．纵向队列分析采用线性混合模型，考虑年龄、性别、种族、BMI组之间的匹配和重复测量。对于EV浓度和大小，使用Mann-Whitney检验分析差异。细胞迁移和形态学数据采用单向方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验进行分析。gydF4y2Ba

EV蛋白水平与糖尿病的关系gydF4y2Ba

先前的数据显示，糖尿病患者的ev可能导致炎症加剧[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．因此，我们检测了从糖尿病个体和正常血糖对照组分离的ev之间炎症蛋白含量是否不同。在此之前，我们构建了一个纵向队列，其中包括在大约5年的时间内(4.95±0.23)患糖尿病的个体。个体要么处于正常血糖状态，要么处于糖尿病前期，然后变成糖尿病，要么在两个时间点都处于正常血糖状态(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们之前报道过，在这段时间内患糖尿病的个体血浆ev浓度高于正常血糖对照组[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．这一群体的人口统计信息列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba之前描述了该队列ev的进一步特征[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．描述队列设计的流程图如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了分析来自该队列的ev的炎症蛋白含量，使用多重PEA裂解并分析ev。该方法使用敏感和特异性检测方法定量EVs中的炎症蛋白[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．如表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在我们的纵向队列中，发现EV炎症蛋白水平与糖尿病的获得之间存在许多显著相关性。有显著相关性的蛋白包括CCL28、CD40、CD5、STAMBP、TWEAK和VEGF-A，见表。我们还对纵向队列第2期的炎症蛋白水平进行了横断面分析，其中发现EV炎症蛋白水平与糖尿病状态之间存在额外的显著相关性。具有显著相关性的蛋白质包括CD5、MCP-1和VEGF-A。一些蛋白质只与一个糖尿病诊断组显著相关。然而，这些组有不同的起始条件(即非糖尿病或糖尿病前期)，这可能影响了变化的幅度和与EV蛋白水平相关的强度。gydF4y2Ba

稳态模型评估是衡量胰岛素抵抗和β细胞功能的数学模型[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．许多临床和流行病学研究采用HOMA模型来衡量个体糖尿病的严重程度[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．我们想要检查各种炎症蛋白与糖尿病不同的定量评估。在我们的蛋白质组学分析中，在我们的纵向分析和时间2的横断面分析中，我们发现EV炎症蛋白水平与HOMA-B和HOMA-IR显著相关。经纵向分析，与HOMA-B显著相关的蛋白包括IL-10RB、IL-18R1、SCF和VEGF-A，与HOMA-IR显著相关的蛋白包括DNER、HGF、IL-10RB、IL-18R1和VEGF-A。在第2时间的纵向队列横断面分析中，与HOMA-B显著相关的蛋白包括SCF和uPA，与HOMA-IR显著相关的蛋白包括DNER、HGF、IL-18R1和VEGF-A。gydF4y2Ba

在所有检测的蛋白质中，ev相关血管内皮生长因子A (VEGF-A)水平与大多数分析变量显示出显著相关性(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在我们对时间和时间2的纵向队列分析中，ev中的VEGF-A水平与糖尿病状况显著相关。在时间点1处于糖尿病前期或正常血糖状态，在时间点2被诊断为糖尿病的个体，其ev中VEGF-A水平明显高于在两个时间点都处于正常血糖状态的个体(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba可视化线性混合模型回归的预测值，显示患有糖尿病的个体随着时间的推移有更高水平的EV VEGF-A。这个分析包括每个人的两个时间点，因此我们在图中用年龄来描述时间。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示了三个不同糖尿病诊断组中EV VEGF-A水平随年龄的变化。此外，在我们的纵向分析中，EV VEGF-A水平与HOMA-B和HOMA-IR水平显著相关，在时间2的横断面分析中，HOMA-IR水平显著相关。VEGF-A是一种广为人知的血管生成因子，它与包括VEGFR-1和VEGFR-2在内的受体结合，调节血管生成[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．VEGF-A通过刺激包括内皮细胞迁移在内的多种过程，在血管系统的形成中发挥重要作用[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

来自糖尿病患者的ev增加细胞迁移gydF4y2Ba

鉴于我们发现EV炎症蛋白含量与糖尿病状态之间的关联，我们检测了来自糖尿病患者的EV是否会影响体外细胞行为。已知糖尿病与血管疾病风险增加有关，血管疾病可能由循环ev与内皮细胞相互作用引起[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．因此，我们使用内皮细胞来观察糖尿病个体的ev是否能诱导功能影响。gydF4y2Ba

在这些研究中，横断面队列的血浆ev是使用差速超离心分离的(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们之所以选择使用这种分离方法，是因为沉淀试剂中含有聚乙二醇，这可能会混淆细胞迁移测定的结果[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．在描述和验证分离ev存在时遵循了国际细胞外囊泡学会的指南[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．通过微分超离心根据大小分离ev，其中10,000gydF4y2BaggydF4y2Ba(1万)和12万gydF4y2BaggydF4y2Ba(120K)馏分分别包含中型和sev [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．10K和120K部分显示已知EV标记物的信号，而EV纯度标记物没有信号(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).用电子显微镜拍摄的图像显示，10K和120K样品均有完整的圆形囊泡(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, c)。使用NTA对10K和120K组分的尺寸分布进行量化(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad). 120K部分产生的ev具有典型的等离子体ev尺寸分布，在约200 nm处出现峰值。相比之下，来自10K组分的ev分布更广，颗粒浓度明显更低(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad, e)。EV均值和模式大小的比较表明，从10K馏分中分离出的EV明显大于从120K馏分中分离出的EV(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf, g)。因此，我们从差速超离心分离的样品表现出ev的大小和形态特征。gydF4y2Ba

基于我们的蛋白质组学分析显示EV炎症蛋白水平与糖尿病状态显著相关，我们想看看不同分子负载的EV是否也有不同的功能影响。使用Boyden transwell试验，我们允许HAECs迁移到我们横断面队列中分离的ev或VEGF-A。微分超离心120K和10K自旋的ev分别被分类为sev和中型ev [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．我们的结果显示，内皮细胞向从正常血糖或糖尿病个体中分离的sev (120K部分)的迁移没有差异，两组内皮细胞的迁移与未处理的内皮细胞相似(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).相反，我们随后对中型ev (10K分数)的测试显示，与正常血糖对照组相比，来自糖尿病个体的ev的细胞迁移更大(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

ev在糖尿病中改变细胞形态gydF4y2Ba

由于内皮细胞的迁移是由肌动蛋白细胞骨架动员的[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，我们测试了来自糖尿病患者的中型ev (10K分数)是否会导致靶细胞的结构改变。将HAECs与糖尿病或正常血糖患者的ev孵育后，我们对细胞的肌动蛋白骨架进行染色。我们的研究结果表明，当使用糖尿病患者的ev而不是正常血糖患者的ev处理时，HAECs显示出明显更多的富肌动蛋白，膜突出和褶皱，称为薄片足，并且来自后者的ev导致的形态与未处理的细胞相似(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在所有类别中，细胞大小没有显著变化(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

我们之前对人类队列的研究表明，糖尿病人的血浆ev水平升高，并提示ev可能参与糖尿病的炎症途径[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．在本研究中，我们检测了糖尿病人体内ev的炎症负荷。通过我们的纵向队列分析，我们发现EV炎症蛋白水平与糖尿病状态之间存在显著相关性。此外，我们发现，与正常血糖对照组相比，糖尿病患者的EVs改变了人类主动脉内皮细胞的迁移和形态。gydF4y2Ba

炎症是内皮功能障碍的一个因素[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，从而导致糖尿病的血管并发症。因此，我们试图通过研究参与炎症的ev相关因素来阐明ev在这些共病进展中的作用。先前关于糖尿病炎症中的ev的研究检测了脂肪组织中的ev，并表征了这些囊泡中的microRNA含量[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．我们在这项研究中的工作重点是来自糖尿病患者循环的EV，并通过测试大量炎症生物标志物来分析EV蛋白含量。gydF4y2Ba

值得注意的是，在纵向队列中，EV VEGF-A水平与糖尿病状况、HOMA-B和HOMA-IR水平相关，在时间2时糖尿病状况和HOMA-IR水平的横断面分析中也是如此。我们的结果证实了之前的一项横断面研究，即在糖尿病患者血小板不足的血浆ev中观察到较高水平的VEGF [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．我们的纵向研究扩展了这些发现，表明随着时间的推移，患有糖尿病的个体在其循环ev中会获得更高水平的VEGF-A。gydF4y2Ba

在这里，我们报道，与来自正常血糖人群的EVs相比，来自糖尿病患者的EVs增加了内皮细胞的迁移。考虑到细胞迁移和VEGF含量之间的联系，我们的发现将与同样检查EV和细胞迁移但观察EV VEGF- a水平对癌症血管生成影响的研究一致。大量研究表明，从癌细胞中分离含ev的VEGF可促进内皮细胞的迁移和体外血管生成[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．这些研究指出，EVs中的VEGF是肿瘤血管生成的有效诱导因子。gydF4y2Ba

ev中的VEGF-A含量很重要，因为VEGF-A水平与个体糖尿病的潜在严重程度之间有很强的联系。在一项对正常血糖和糖尿病患者的临床研究中，研究人员发现糖化血红蛋白(HbA1c)水平与血浆VEGF水平呈正相关[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．与这一发现相一致的是，另一项研究发现，在控制良好的糖尿病患者和健康个体的血清样本中，VEGF-A及其受体1和2水平的浓度相似[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．这一结果具有重要意义，因为糖尿病控制良好的个体没有出现血管相关并发症的迹象。因此，在ev中量化VEGF-A可能是衡量糖尿病进展的有价值的工具。我们的队列研究提供了这样的信息，除了各种其他炎症生物标志物的数据。gydF4y2Ba

然而，同样重要的是要注意VEGF水平与糖尿病进展之间的复杂关系。血浆VEGF水平不一定反映细胞内器官VEGF水平[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．此外，采用抗VEGF干预措施来应对VEGF水平的升高可能会干扰全身的基本过程，包括伤口愈合和侧支血管发育[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．因此，在EVs被认为是糖尿病强有力的生物标志物和治疗靶点之前，有必要进一步探索EVs在穿梭VEGF中的作用。gydF4y2Ba

我们的数据表明，糖尿病患者的ev含有影响细胞形态和迁移的物质。在Transwell Boyden实验中，我们观察到，与正常血糖个体的ev培养的细胞相比，来自糖尿病个体的中等大小ev (10K分数)增强了细胞迁移。因此，我们的发现表明，来自糖尿病人的ev比来自正常血糖人的ev携带更大的趋化剂。我们的研究结果与另一份报告一致，该报告显示，糖尿病患者的中型ev中VEGF水平较高，其中ev是从差动超离心10K旋转中分离出来的[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．鉴于VEGF-A水平在糖尿病个体的ev中更丰富，我们期望这些ev的趋化剂诱导靶细胞的促血管生成行为。该假设与免疫荧光实验一致，实验表明，与正常血糖对照组的EVs培养的细胞相比，用中等大小的EVs (10K分数)培养的糖尿病内皮细胞表现出更多的富肌动蛋白、膜突出和褶皱。众所周知，板ellipodia通过肌动蛋白聚合和重组来促进细胞的迁移，从而推动细胞前缘的突出[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．因此，我们的研究结果表明，来自糖尿病患者的ev携带促进内皮细胞迁移的货物，从而促进血管生成。gydF4y2Ba

蛋白质组学和体外研究的结果与某些糖尿病共病(包括糖尿病视网膜病变)中发生的过度血管生成一致[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．相反，我们的研究结果也可能反映了涉及血管生成缺陷和内皮功能障碍的共病的代偿机制，包括心脏病和中风[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．血管生成因子在血管疾病和糖尿病中的作用是多方面的，需要进一步研究，因为目前对血管生成疗法的尝试存在缺陷，包括无法进行靶向递送[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．这些问题有可能通过工程ev作为血管生成和抗血管生成因子的新型载体到体内选定的器官来解决。gydF4y2Ba

除了VEGF-A，我们还发现了多种EV炎症蛋白，这可能会进一步深入了解糖尿病的病理生理学，包括CD40。已知CD40与其相应配体CD40L之间的相互作用可诱导血小板活化，从而导致炎症和动脉粥样硬化[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．在一项对没有血管并发症史的人的研究中，与对照组相比，2型糖尿病患者的可溶性CD40L水平更高，这与心血管事件的风险增加有关[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．在我们的纵向研究中，EV的CD40水平与从正常血糖诊断过渡到糖尿病诊断的个体的状态显著相关。因此，EVs中CD40的含量可能有助于预测糖尿病的血管疾病。gydF4y2Ba

肝细胞生长因子(HGF)是另一种可能与血管疾病相关的ev相关炎症蛋白。在我们的队列纵向分析和时间2的横断面分析中，ev中的HGF水平与HOMA-IR水平显著相关。据报道，HGF可能通过促进糖尿病β细胞再生而对胰岛素抵抗具有保护作用[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．此外，在小鼠模型中发现HGF可调节抗炎反应[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．因此，检测EV HGF含量可以提供更多关于对抗胰岛素抵抗的生物学机制的知识，并阐明EV在糖尿病患者中发挥的复杂作用。gydF4y2Ba

与HGF类似，在我们的纵向分析和时间2的横断面分析中，IL-18受体IL-18R1的EV水平与HOMA-IR显著相关。已发现血浆IL-18水平与HOMA-IR显著相关，且这种关系与肥胖和糖尿病状况无关[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．反过来，ev可以作为糖尿病胰岛素抵抗的有用评估。gydF4y2Ba

在这里，我们分析了EV炎症蛋白的水平。许多细胞因子可以被包裹在ev中，并已被证明具有生物活性[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．有趣的是，可溶性和ev包裹部分中的细胞因子不同，可能取决于生物系统和刺激[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．这将是有趣的，在未来的研究可溶性的炎症特征与ev相关的部分。这一探索途径将建立在先前文献的基础上，这些文献表明，正常糖耐量个体和糖尿病个体之间，富含evs的血清部分中的microRNA谱不同，但血清可溶性部分中的microRNA没有差异[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．因此，在2型糖尿病中，生物物质可能被区分为可溶性和ev相关的部分。gydF4y2Ba

最后，我们的功能分析结果表明，含有中等大小ev的10K部分导致受体内皮细胞发生改变。直到最近才认识到，来自10K和100K组分的ev可能携带不同的分子负载，因此可能引发不同的生物学功能[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．一般来说，大多数研究在检查ev对内皮细胞的影响时都集中在一部分ev上。事实上，以往很多研究都省略了差速超离心的10K步，从而同时收集了中型和sev [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．从100K部分获得的sev已被证明对内皮细胞功能有影响[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．其他无区别收集小型和中型EV的EV分离技术也已用于研究内皮细胞迁移的分析[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．在这里，我们的发现有助于关于从差异超离心10k部分分离的EVs在内皮细胞迁移和血管生成中的作用的更有限的文献[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．中等大小的ev在内皮细胞迁移中的作用可能与这些囊泡在介导内皮功能障碍和心血管疾病中的重要性有关[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．我们有证据表明中型ev (10 K分数)的促血管生成作用，这可能有助于糖尿病的血管并发症。因此，这些结果可能会进一步加深我们对在病理条件下区分中型电动汽车与其他类型电动汽车的特性和功能的理解。gydF4y2Ba

我们的结果表明，EV炎症蛋白谱因糖尿病状态而异。我们也有初步证据表明，糖尿病患者ev中的炎症蛋白可以在功能上改变内皮细胞，包括改变细胞形态和迁移行为。使用目标器官组织的后续研究可能有助于更好地理解ev如何损害或促进血管健康。反过来，电动汽车可能成为糖尿病的宝贵诊断工具，这将使我们能够解决这一令人担忧的流行病，并帮助受到不成比例影响的人群。gydF4y2Ba

在当前研究期间生成和分析的数据集可以通过HANDLS网站从通讯作者那里获得，gydF4y2Bahttps://handls.nih.gov/gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

电动汽车:gydF4y2Ba

细胞外囊泡gydF4y2Ba

VEGF:gydF4y2Ba

血管内皮生长因子gydF4y2Ba

5:gydF4y2Ba

稳态模型评估gydF4y2Ba

IL-18R1:gydF4y2Ba

白细胞介素18受体1gydF4y2Ba

红外光谱:gydF4y2Ba

胰岛素抵抗gydF4y2Ba

B:gydF4y2Ba

β细胞功能gydF4y2Ba

心血管疾病:gydF4y2Ba

心血管病gydF4y2Ba

塞:gydF4y2Ba

小的胞外囊泡gydF4y2Ba

HANDLS:gydF4y2Ba

多样性社区的健康老龄化gydF4y2Ba

NIA:gydF4y2Ba

国家老龄化研究所gydF4y2Ba

国家卫生研究院:gydF4y2Ba

美国国立卫生研究院gydF4y2Ba

体重指数:gydF4y2Ba

身体质量指数gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

玫瑰:gydF4y2Ba

(4) - 2-Hydroxyethyl piperazine-1-ethanesulfonic酸gydF4y2Ba

米/:gydF4y2Ba

哺乳动物蛋白提取试剂gydF4y2Ba

NTA:gydF4y2Ba

纳米颗粒跟踪分析gydF4y2Ba

豌豆:gydF4y2Ba

接近扩展试验gydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

HAEC:gydF4y2Ba

人主动脉内皮细胞gydF4y2Ba

DAPI:gydF4y2Ba

4, 6-Diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba

CD40:gydF4y2Ba

分化簇40gydF4y2Ba

HGF:gydF4y2Ba

肝细胞生长因子gydF4y2Ba

我们要感谢HANDLS的参与者，HANDLS的医务人员，Althaf Lohani提供的技术援助，以及Dimitrios Kapogiannis使用NanoSight和超离心机。gydF4y2Ba

本研究由美国国立卫生研究院老龄研究所内部研究计划(项目编号:AG000519)支持。资助者在研究设计、数据收集、数据分析和解释、手稿准备或发表决定中没有任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 大卫·w·弗里曼gydF4y2Ba

   现居地:美国犹他大学盐湖城医学院gydF4y2Ba

2. Sharon F. Wu和Nicole Noren Hooten对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 流行病学和人口科学实验室，国家老龄化研究所，国家卫生研究院，巴尔的摩，马里兰州，21224，美国gydF4y2Ba

   Sharon F. Wu, Nicole Noren Hooten, David W. Freeman, Nicolle A. Mode, Alan B. Zonderman和Michele K. EvansgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SFW、DWF和NNH进行实验。NAM进行了统计分析。ABZ和MKE是HANDLS的共同主要研究人员。所有作者都参与了这项研究的设计。SFW和NNH根据所有作者的意见撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba米歇尔·埃文斯gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

国家环境卫生科学研究所的机构审查委员会批准了HANDLS研究。该研究的所有参与者都提供了书面知情同意书。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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