基于pcr的斑马鱼模型用于头颈部癌症的个性化治疗gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

目前，个体化癌症药物体内模型试验具有挑战性。近年来，斑马鱼幼虫异种移植模型已被应用于癌症研究，特别是用于药物测试，在针对患者来源的肿瘤异种移植的药物测试中显示出有希望的结果。目前，这些异种移植模型应用成像技术来衡量药物疗效。然而，这种方法有一些局限性，包括及时成像，从而减少了测试鱼和药物的可用数量。在这里，我们提出了一种基于pcr的快速检测方法来评估斑马鱼幼虫异种移植模型的药物疗效。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

我们使用斑马鱼幼虫异种移植模型测试了两种原发性和相应的转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系和患者来源的舌癌样本。采用成像技术检测顺铂疗效，并与基于pcr的方法进行比较。利用PCR对细胞株和患者样本进行了8种化合物的药物筛选。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在直接比较中，三种技术(成像、定量PCR和液滴数字PCR)在顺铂治疗后对癌细胞生长的抑制作用相似。利用定量PCR方法，我们证实了HNSCC细胞对顺铂的剂量依赖性反应。四种HNSCC细胞系和患者样本的药物筛选结果显示，被测癌细胞之间的药物疗效不同。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们介绍了一种新的、简单、快速和经济有效的基于pcr的体内斑马鱼幼虫检测方法，用于检测细胞系和临床肿瘤样本对抗癌药物的反应。该方法与常用的成像分析方法同时使用。gydF4y2Ba

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第八大常见恶性肿瘤[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]，其特点是早期转移和生存率差。目前，HNSCC患者的主要治疗包括手术和(化疗)放疗单独或联合[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．其他方法，如靶向治疗和免疫治疗，也代表了已批准的模式，尽管它们并不始终作为治疗HNSCC患者的一线方法。然而，考虑到HNSCC患者的5年生存率约为50%，这些治疗的疗效仍然有限[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．一旦肿瘤对放疗和化疗产生耐药性，患者可接受各种辅助治疗，如西妥昔单抗和派姆单抗，以提高生存率[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．这种策略导致了一些问题，包括不必要的副作用、高昂的成本和无效的治疗。因此，对癌症患者，特别是HNSCC患者进行个性化治疗仍然是必要的。不幸的是，到目前为止，还没有实际的体内系统可以在患者样本中测试癌症药物的疗效。gydF4y2Ba

近年来，斑马鱼幼虫异种移植物已被用作癌症研究中有前途的体内模型[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．该模型具有子代数量多、体积小(可装在96孔板中)、实验持续时间短、成本低和完成高通量测试的可能性等优点。所有这些因素都促使研究人员转向在实验中使用斑马鱼幼虫。直到最近，斑马鱼幼虫模型主要被用于研究癌细胞增殖、转移、肿瘤血管生成和药物测试[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．有趣的是，两项研究报告了其作为使用患者来源的异种移植进行个性化结肠癌和胃癌药物测试的模型的应用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．尽管有这些积极的发现，但这个模型仍然存在一些缺陷，包括药物反应的评估技术。目前，成像是评估肿瘤大小和转移的唯一可用方法。这种方法耗时长，而且每次试验的鱼数量受到限制，难以用于高通量筛选。目前，所有已发表的关于斑马鱼幼体药物测试的报告都仅限于三到四种药物。为了解决这个问题，在这里，我们介绍了一种简单、快速和低成本的基于pcr的检测方法来评估癌细胞系和患者来源的异种移植对抗癌药物的反应。我们还将该分析的结果与已经建立的成像分析进行比较。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

在这项研究中，我们使用了两种原代和两种转移性HNSCC细胞系(由Reidar Grenman博士的实验室提供，图尔库大学，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。细胞在75 cm内培养gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba含有Dulbecco 's改良Eagle 's培养基(DMEM)/F-12 (Gibco, Paisley, UK)的烧瓶，含10%热灭活胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、250 ng/ml真菌素和50 μg/ml抗坏血酸。所有细胞系均为无支原体，使用PCR支原体检测试剂盒I/C (PromoKine, Heidelberg, Germany)进行检测。为了制备用于注射的细胞悬液，使用胰蛋白酶/EDTA将细胞从烧瓶中分离，并以5 × 10的浓度悬浮在培养基中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba/µl。为了成像目的，根据制造商的说明使用CellTrace Far Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)对细胞进行染色。gydF4y2Ba

患者样本gydF4y2Ba

我们的机构研究伦理委员会(14.03.2016 Eettmk 84)批准了该研究设置。患者参与是自愿的，需要知情同意。患者有转移性口舌癌(附加档案gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。手术切除肿瘤及转移淋巴结后，患者接受放化疗(原发肿瘤区66/2 Gy +淋巴结有效剂量50/2 Gy，顺铂输注40 mg/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba每周坚持6周)。3个月后，CT扫描显示无复发或转移迹象。gydF4y2Ba

围手术期获得新鲜组织样本，并将其置于50ml falcon管中，其中含有冰冷的汉克斯平衡盐溶液(HBSS;青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，真菌素250 ng/ml)。组织样本被保存在冰中，直到进一步处理。每个样本都被放置在培养皿中，并保存在含有HBSS的冰块上。坏死组织用手术刀切除。将重要组织块放入含有HBSS的新培养皿中，用手术刀切碎成小块(1-2毫米)。将组织块转移至15 ml falcon管中，以1000 rpm (200× 11)离心5 mingydF4y2BaggydF4y2Ba) 4°C。离心后，丢弃上清液，加入新的HBSS缓冲液，再进行下一轮离心。丢弃上清液，将组织片颗粒悬浮在含有1mg /ml组织溶解梭菌(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA) I型胶原酶的5ml HBSS缓冲液中，并置于37°C的摇床上。孵育2小时后，将试管离心，丢弃上清液，用新鲜HBSS缓冲液替代，再进行另一轮离心。消化样品悬浮在HBSS缓冲液中，使用100 μm细胞过滤器(Falcon™细胞过滤器，Fisher Scientific, NH, USA)过滤，收集流过的样品(单细胞)并进行离心。丢弃上清液，将细胞颗粒悬浮在浓度为5 × 10的DMEM/F-12中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/µl。gydF4y2Ba

斑马鱼幼体显微注射及给药gydF4y2Ba

实验在赫尔辛基大学斑马鱼研究中心进行，并获得了该地区国家行政机构的伦理许可(ESAVI/13139/04.10.05/2017)。如前所述，AB品系的野生型斑马鱼得以维持[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]在实验室鱼多机架系统。幼虫在28.5℃的胚胎培养基(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl)中生长gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0.33 mM MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba；Sigma-Aldrich)。将2日龄的鱼去壳，用0.04%三卡因麻醉，并将2 nl细胞悬液(1000个细胞)微量注射到卵黄周围间隙。将幼虫转移到24孔板中的新鲜胚胎培养基中，在34°C下保存72小时，然后收集用于RNA分离或固定用于成像。用1-苯基2-硫脲(PTU)处理斑马鱼幼虫成像，以避免色素沉着。我们选择了8种药物(一种化疗药物和7种靶向治疗药物)用于该试验。药物浓度的选择是基于我们之前的体外药物测试以及斑马鱼幼体的细胞毒性测试(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。在胚胎培养基中稀释药物，DMSO作为阴性对照。将鱼饲养在24孔板中(每孔5条鱼，1毫升胚胎培养基)。每种药物使用20条鱼，其中10条鱼聚集在一起，以在PCR扩增期间提供足够的信号。该方法符合arrival指南。gydF4y2Ba

异种移植成像gydF4y2Ba

使用蔡司Axio成像仪(Carl Zeiss AG, Oberkochen，德国)和徕卡TCS SP8 MP CARS(徕卡微系统，Wetzlar，德国;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:视频S1)，使用Matlab (MathWorks, Natick, MA, USA)测量肿瘤面积。gydF4y2Ba

定量和液滴数字PCRgydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Düsseldorf，德国)从鱼中提取RNA。总共使用了400 ng RNA，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)进行cDNA合成。定量PCR时，在2 μl cDNA样品中加入10 μl iQ SYBR绿、7 μl水和1 μl 250 nM引物溶液。以斑马鱼甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为管家基因。gydF4y2Ba

滴式数字PCR (ddPCR): QX200™EvaGreen 10 μlgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba将ddPCR™Supermix (Bio-Rad Laboratories)和1 μl 900 nM引物加入到2 μl cDNA样本中。除用于EvaGreen的液滴生成油(70 μl)外，样品装入DG8墨盒中，并放入QX200™液滴发生器(Bio-Rad Laboratories)中进行单个液滴生成。将液滴(40 μl)转移到96孔PCR板上，在PX1-PCR板密封仪(Bio-Rad)中用提供的箔密封，放入T100 Thermal Cycler(退火温度= 60°C)中。接下来，将密封板转移到QX200™液滴数字PCR系统(Bio-Rad Laboratories)，以检测液滴中完成的PCR反应。我们使用QuantaSoft软件，版本1.7.4.0917 (Bio-Rad Laboratories)进行数据分析。额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3总结了引物序列。gydF4y2Ba

我们首先将已经建立的成像技术与定量PCR和ddPCR进行了逐个实验。在定量PCR中，我们使用人GAPDH来评估注射的斑马鱼幼虫中的人细胞数量。由于信号低于检测水平，我们无法在定量PCR中使用特异性的上皮细胞角蛋白标记。因此，我们采用ddPCR，成功检测到细胞角蛋白17mrna。所有三种技术均显示顺铂对肿瘤生长有明显的抑制作用。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．对100条鱼进行定量PCR所需的时间为4.6小时，比成像试验少了大约5倍(21.3小时，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。基于这些结果，我们继续使用定量PCR进行药物测试，因为它在大多数研究实验室中都很方便和广泛可用。gydF4y2Ba

接下来，我们评估了顺铂的剂量依赖性反应。曲线显示顺铂剂量与人GAPDH信号呈完美的负相关(r =−0.96，图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在这些技术验证程序之后，我们开始使用8种药物和4种癌细胞株进行药物筛选。顺铂在几乎所有细胞系中都是最有效的药物，而阿法替尼在任何测试的细胞系中都没有表现出活性(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S5)。其他药物显示不同水平的功效取决于测试的细胞系(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S5)。gydF4y2Ba

对于患者来源的(异种移植)肿瘤细胞，顺铂产生了适度的效果(减少46%)，靶向治疗(EGFR和mTOR抑制剂)显示出强烈的效果(减少80-90%，图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S5)。有趣的是，与转移性癌细胞(UT-SCC-24B和UT-SCC-42A)相比，所有原发癌细胞(UT-SCC-24A、UT-SCC-42A和舌癌患者样本)对顺铂的反应都较低。gydF4y2Ba

在这里，我们介绍了一种简单、快速和低成本的基于pcr的体内检测方法，以测试患者来源的肿瘤样本中的抗癌药物反应。将斑马鱼幼体用于肿瘤学药物测试和个性化药物特别显示出有希望的结果，特别是在模拟真实患者反应方面[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．在这项工作中，我们进一步发展了基于pcr的检测技术，这比成像检测更容易和更快。基于pcr的方法允许使用更多数量的鱼并测试更多数量的药物。gydF4y2Ba

我们同时使用了定量PCR和ddPCR，前者简单易行，几乎所有研究和医院实验室都可以使用，后者更准确，可以检测到表达水平非常低的mRNA [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在定量PCR中，我们使用了人类GAPDH，一种高表达分子，通常用作管家基因来评估人类肿瘤细胞的数量。遗憾的是，在定量PCR中，我们无法检测到任何上皮细胞标志物，如细胞角蛋白，因为其低表达水平。在本实验中，我们使用斑马鱼GAPDH作为管家基因，该基因在组间保持稳定。使用更灵敏的ddPCR方法，我们检测到细胞角蛋白17。特别是对于患者来源的肿瘤样本，我们发现使用ddPCR可以更精确地检测来自上皮癌细胞的信号。由于ddPCR的可用性有限，且其结果与定量PCR相当，我们继续使用定量PCR技术进行分析，以提供一种易于在大多数研究和临床设施中采用的分析方法。gydF4y2Ba

此处显示的剂量反应效应和对抗癌药物的不同反应增强了新测定方法的可靠性。此外，使用这种方法检测患者来源的样本似乎简单、快速，并且可以使用基本的实验室设备。更重要的是，患者样本的整个检测流程可以在1周内完成，这对于避免治疗延误至关重要。这种可能性可以为临床医生提供初步的知识，以一种高效的方式为特定的患者选择最合适和个性化的可用药物。在实践中，这种模型似乎优于小鼠异种移植，后者需要数周时间来建立药物测试。此外，在该系统中，肿瘤细胞在几小时内从患者转移到斑马鱼幼体，而不需要体外培养，这可能会改变它们的表型。另一个优点是每条鱼只需要1000个细胞，这使得该方法即使对一个小的肿瘤样本也可行。gydF4y2Ba

目前的斑马鱼异种移植试验的主要限制是宿主和原始物种(人类)之间的不同物种。这可能会影响某些癌症的药物疗效，如内分泌依赖型癌症，在评估结果时应牢记这一点[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们在这里描述了一种改进现有的斑马鱼幼虫异种移植试验应用于体内个体化癌症药物试验。我们没有使用成像技术来测量肿瘤大小，而是使用PCR来测量药物疗效。gydF4y2Ba

本研究的所有数据和结果均可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

DMEM:gydF4y2Ba

杜尔贝科改良的鹰牌中号gydF4y2Ba

的边后卫:gydF4y2Ba

胎牛血清gydF4y2Ba

GAPDH:gydF4y2Ba

甘油醛3-磷酸脱氢酶gydF4y2Ba

哈佛商学院:gydF4y2Ba

汉克斯的平衡盐溶液gydF4y2Ba

HNSCC:gydF4y2Ba

头颈部鳞状细胞癌gydF4y2Ba

PTU:gydF4y2Ba

1-phenyl 2-thioureagydF4y2Ba

我们感谢芬兰赫尔辛基大学生物医学成像部门和斑马鱼部门的协助。我们还感谢Henri Koivula先生和Ilida Suleymanova女士在斑马鱼幼体显微注射和成像分析方面提供的帮助。gydF4y2Ba

我们感谢这项研究的资助者:Sigrid Jusélius基金会，芬兰癌症协会，奥卢大学医院MRC赠款，埃米尔·阿尔托宁基金会和赫尔辛基大学中心医院研究基金。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Katja Tuomainen和Anne Kivimäki同样对这项工作做出了贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 赫尔辛基大学医学院临床口腔颌面疾病科，生物医学赫尔辛基1,C223b (Haartmaninkatu 8)，邮政信箱63,00014，芬兰赫尔辛基gydF4y2Ba

   Ahmed Al-Samadi, Katja Tuomainen, Anne Kivimäki, Abdelhakim Salem, Sakhr Al-Kubati & Aini HyytiäinengydF4y2Ba

2. 坦佩雷大学医学和卫生技术学院，坦佩雷，芬兰gydF4y2Ba

   Mataleena ParikkagydF4y2Ba

3. 坦佩雷大学医院口腔颌面科，坦佩雷，芬兰gydF4y2Ba

   Mataleena ParikkagydF4y2Ba

4. 芬兰赫尔辛基HUS赫尔辛基大学医院口腔颌面外科gydF4y2Ba

   Karri Mesimäki & Tommy WilkmangydF4y2Ba

5. 耳鼻咽喉-头颈外科，HUS赫尔辛基大学医院和赫尔辛基大学，芬兰赫尔辛基gydF4y2Ba

   Antti MakitiegydF4y2Ba

6. 瑞典斯德哥尔摩，卡罗林斯卡学院，卡罗林斯卡大学医院，临床科学、干预和技术部，耳鼻喉疾病科gydF4y2Ba

   Antti MakitiegydF4y2Ba

7. 芬兰赫尔辛基大学医学院系统肿瘤学研究项目gydF4y2Ba

   Antti MakitiegydF4y2Ba

8. 耳鼻咽喉-头颈外科，图尔库大学医院，图尔库，芬兰gydF4y2Ba

   Reidar GrenmangydF4y2Ba

9. 芬兰奥卢大学癌症和转化医学研究单位gydF4y2Ba

   Tuula萨罗城gydF4y2Ba

10. 芬兰奥卢大学医院医学研究中心gydF4y2Ba

    Tuula萨罗城gydF4y2Ba

11. 赫尔辛基大学医院，芬兰赫尔辛基gydF4y2Ba

    Tuula萨罗城gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

研究概念:AA, TS, KM, TW, AM, RG, MP。研究设计:AA, TS, KM, TW, AM, RG。数据采集:AA、KT、AK、SA、AH、MP、AS。数据和算法的质量控制:AA, KT, AK。数据分析与解释:AA, AK, AS, SA, AH, MP。统计分析:AA。稿件准备:AA。稿件编辑评审:所有作者。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba艾哈迈德Al-SamadigydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

我们的机构研究伦理委员会(14.03.2016 Eettmk 84)批准了该研究设置。患者参与是自愿的，需要知情同意。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

在研究开始前获得每位患者的知情同意。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba