颅内动脉瘤破裂的全身反应涉及特定基因亚型的表达

背景

颅内动脉瘤(IA)破裂引起全身反应，包括免疫/炎症反应。我们之前的研究发现IA破裂后，T淋巴细胞相关基因下调，单核细胞和中性粒细胞相关基因上调。目前尚不清楚这是否源于转录或细胞计数的改变。我们试图通过分析外周血细胞中的转录物表达谱来描述IA破裂的全身反应。我们还研究了IA破裂对外周血单个核细胞组成的影响。

方法

我们纳入19例IA破裂急性期患者(RAA，前72小时)，20例慢性期患者(RAC, 3-15个月)和20例对照组。利用深度转录组测序，我们分析了蛋白质编码rna和非编码rna的表达。研究了调控转录本的表达水平、转录本生物型、选择性剪接和其他特征。进行功能分析以确定基因表达谱中代表过多的本体论组。流式细胞术用于分析单核白细胞亚群水平的变化。

结果

比较RAA和对照，我们鉴定出491个差异表达的转录本(在RAA中303个下调，188个上调)。结果表明，IA破裂反应的分子变化发生在个体转录本水平。功能分析显示，受影响最大的生物学过程与淋巴细胞活化和toll样受体信号通路的调控有关。RAC和对照组之间的差异不太明显。白细胞亚群分析显示，与对照组相比，RAA患者CD4+淋巴细胞数量显著减少，经典和中间单核细胞数量显著增加。

结论

急性期IA破裂强烈影响外周血细胞的转录谱以及单个核细胞的组成。发现了一种特定的基因表达改变模式，提示淋巴细胞反应的抑制和单核细胞活性的增强。

颅内动脉瘤(IA)破裂导致蛛网膜下腔出血(SAH)，死亡率高，致残率高[1，2］．这种不良预后是由IA破裂的直接神经系统后遗症和卧床不起的患者状态和感染引起的全身并发症所驱动的。后者与中枢神经系统急性损伤相关的免疫抑制有关[3.，4］．SAH全身性反应的分子机制仍不清楚。据报道，不同分子水平、血细胞计数及其在外周血中的功能发生了一系列变化[5，6，7］．

使用微阵列方法，我们先前证明IA破裂影响外周血细胞的转录谱，这些变化的模式表明，随着单核细胞和中性粒细胞活性的增强，淋巴细胞反应降低[8］．在预后较差的患者中，细胞相关转录本水平的差异更为显著。然而，观察到的基因转录的变化是否反映了血细胞计数的变化，细胞激活水平或两者都有变化。越来越多的证据表明SAH与淋巴细胞亚群失调有关[9，10，11特别是在患有sah相关并发症的患者中，淋巴细胞和单核细胞计数和功能有显著变化[5］．对缺血性卒中的研究也表明，其对单核细胞和淋巴细胞亚类的数量和活性及其与临床病程的相关性有很强的影响[12，13］．

在目前的研究中，我们试图通过深度转录组测序分析外周血细胞中的基因表达谱来研究动脉瘤性SAH的全身影响。我们对SAH调控的蛋白质编码和非编码基因变异进行了全球分析。我们还研究了特定基因变异的表达，这些基因变异可能导致功能不同的蛋白质异构体的产生，并影响IA破裂的系统反应。此外，我们还分析了IA破裂后外周血中单核白细胞的亚群。这些sah相关的变化在急性期和慢性期都进行了评估，并与对照组的变化进行了比较。

病人

2014年和2015年在克拉科夫大学医院前瞻性招募了连续的动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者。有头部外伤、血管炎、动静脉畸形、血液学疾病和已知恶性肿瘤的患者被排除在外。分析了两组独立患者:急性(IA破裂后72小时)和慢性(SAH后3-15个月)。对照组(C)从患有头痛的患者中招募。所有受试者都是白种人。获得所有参与者(或其监护人)的知情同意。当地伦理委员会批准了这项研究。组间比较采用χ²Fisher精确检验法或Mann-Whitney检验法U在适当的情况下，p < 0.05被认为有统计学意义。

血液采集和RNA提取

在神经外科手术或血管内干预前，在PAXgene血液RNA管(PreAnalytiX, GmbH，瑞士)中采集静脉血。按照制造商的方案，使用PAXgene血液RNA试剂盒(PreAnalytiX)分离总RNA。RNA浓度使用NanoDrop nt -1000分光光度计(NanoDrop Technologies, Montchanin, DE)测量，RNA质量通过基于芯片的毛细管电泳检测，使用RNA 6000 Nano LabChip试剂盒和Agilent生物分析仪2100 (Agilent, Palo Alto, CA)。

Whole-transcriptome测序

在使用TrueSeq搁浅总RNA文库Prep (Illumina, San Diego, CA)生成文库之前，使用Globin-Zero Gold Removal Kit (Illumina)去除核糖体RNA。整个转录组文库在HiSeq 4000™(Illumina)上测序，参数如下:PE 150(成对末端)和45 M清洁reads，每个样本至少有13.5 Gb的原始数据。RNA-seq数据提交到NCBI序列读取档案(SRA): SRP150595。

RNA-seq数据分析和转录本分类

采用FastQC对NGS数据质量进行验证。RNA-seq读数与GRCh37对齐。p13使用Hisat2 2.0.5。使用来自Ensembl基因数据库的Cufflinks v2.2.1和GTF对转录FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript Per Million Fragments mapped)水平进行量化。对数采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学意义分析₂(1 + x)具有正态连续分布的值[14］．假发现率(FDR)采用Benjamini-Hochberg方法估计。所有统计分析均采用R软件v3.4.3进行。使用Ensembl基因数据库的BioMart界面进行转录本注释和分类。

差异表达基因的功能分类

使用基因注释工具enrichment来识别基因表达模式中代表过多的本体论组，并将基因进行功能分类[15］．过度代表的术语(Wiki Pathways 2016)被定义为根据Fisher 's精确测试至少有三份成绩单且p < 0.05。对于mRNA的细胞型富集，使用了enrichment cell types (Human Gene Atlas)模块。在基因调控区域中过度代表的转录因子结合位点(TFBSs)的鉴定是使用在Enrichment在线资源中实现的ChIP-seq数据(ChIP Enrichment Analysis, ChEA2016)模块进行的。提交基因符号列表，使用默认参数。

用定量PCR (qPCR)验证NGS结果

使用Omniscript逆转录酶(Qiagen公司)进行逆转录。qPCR反应采用异构体特异性TaqMan进行^®探针或由自定义TaqMan设计^®检测设计工具(Life Technologies)，并在CFX96实时系统(BioRad)上运行。共17次qPCR检测8个基因(HEATR1，ACBD6，CCND2，PLEKHA1，ELF2，CFLAR，TRAF1而且PPP1R16B)已被使用。包括目标转录本在内的检测清单在附加文件中列出1:表S1。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1 (HPRT1)转录本进行定量，以控制cDNA浓度的变化。每种RNA的丰度计算为2^{−(阈值周期)}．数据分析采用单因素方差分析，随后采用Tukey多重比较检验。

L / MN指数

淋巴细胞-单核细胞-中性粒细胞指数(L/MN指数)的测定如前所述[8］．基于RNAseq结果，L/MN指数计算为淋巴细胞相关基因标准化表达水平的平均折叠倍数(BCL11B，CCR7，张，CD27，CD3D，CD3E，CD8A,KLRB1)与单核细胞及中性粒细胞相关基因(ANXA3，__arg1，CD14，GYG1，FCGR1A，FCGR2A，IRAK3,MMP9)．所选基因的特定ia改变的转录变异的丰度水平被用于分析(附加文件2:表S2)。对各组患者之间的L/MN值进行韦尔奇校正t检验。

单核白细胞亚群的流式细胞术分析

入院后上午用edta管采血。临床实验室检测白细胞计数和白细胞分化。采用BD FACSCanto II和Diva软件v 6.1.2 (BD Biosciences San Jose, CA)，流式细胞术分析全血中的单核细胞和淋巴细胞亚群。血液样本用预混抗体鸡尾酒孵育15分钟，然后用BD FACS裂解液(BD Biosciences)裂解红细胞。使用以下荧光色素偶联单克隆抗体(所有抗体均为小鼠IgG1): FITC-CD14 (MφP9;BD生物科学)，PE-CD16 (3G8;Beckman Coulter，迈阿密，佛罗里达州)，PC5-CD3 (UCHT1;Beckman Coulter)， FITC-CD4 (SK3;BD生物科学(Biosciences)， PE-CD8;BD生物科学)，PC5-CD33; Beckman Coulter), and invariant natural killer T (我NKT)细胞(6B11;BD pharingen，圣何塞，加州)。抗体捕获珠(CompBeads, BD Biosciences)用于研究中使用的每种试剂的单色补偿对照。淋巴细胞和单核细胞亚群根据正向散射(FSC)和侧面散射(SSC)以及各自标记物的阳性表达进行鉴定。淋巴细胞和单核细胞亚群的绝对数量通过将总白细胞与每个细胞群的总百分比相乘来计算。首先，我们使用FSC面积与FSC高度来排除双态，只分析单态。用FSC和SSC对淋巴细胞群进行门控分析。淋巴细胞t群通过选择CD3+细胞和下一个点图- ssc vs CD3进行分析。从这个门中选择T淋巴细胞，并进一步分为:CD4+CD8−、CD4−CD8+、CD4+CD8+和CD4−CD8−淋巴细胞。此外，使用反我NKT细胞抗体，鉴定为CD3+我NKT细胞。用FSC和SSC对单核细胞群进行门控分析。接下来，从CD33+和CD14+细胞门和SSC vs CD14点图上的门中提取单核细胞群。在下一个点图(CD14 vs CD16)中，区分了三个单核细胞亚群:CD14++CD16−(经典)，CD14++CD16+(中间)和CD14+CD16++(非经典)。

IA破裂引起的转录组改变

该研究包括19名SAH急性期(RAA)患者，20名SAH慢性期(RAC)患者和20名对照组。其临床特点见表1．8例IA破裂患者采用夹持闭合，其余11例采用盘绕闭合。在RAA患者住院期间，我们注意到:1例出现症状性血管痉挛，1例出血需要外引流，1例尿路感染，1例支气管炎并发肺炎，1例肺炎合并心力衰竭，1例出现败血症和多器官功能衰竭。后两名患者死亡。在这些患者中发现的转录模式与RAA组的其他患者没有显著差异，并且从分析中排除他们(作为一个亚组或个体)没有显著影响所获得的结果。细胞亚群分析也是如此。

我们使用NGS在特定的转录单位水平上检测基因表达。我们测量了GRCm38中标注的所有转录本的FPKM。p13基因组释放使用袖扣包。在FPKM≥0.1的阈值下，共检测到94,239个转录本，对应于35,529个注释基因。

以临床状态(RAA、RAC、C)为因素，采用单因素方差分析对调控转录本进行鉴定。有491个差异表达转录本(FDR < 0.001%)。比较RAA组和C组，我们发现403个差异表达的转录本(RAA患者中177个上调，226个下调，折叠改变> 2)。RAC组和C组之间无显著差异，RAA和RAC患者之间有268个转录本差异(RAA中178个转录本上调，290个转录本下调，fold change > 2)。由于RAC患者的血液样本是在IA破裂后的不同时间点获得的，我们研究了时间推移对基因表达谱的潜在影响。我们发现SAH发病时间与转录本表达水平之间存在两个显著关系(Spearman 's rank correlation coefficient R > 0.7, p < 0.01)。这两个SLC26A8(ENST00000486155)和BASP1-AS1(ENST00000399760)在IA破裂后上调，转录本丰度水平随时间向对照水平下降(附加文件)3.:图S1)。规范成绩单的完整列表在附加文件中列出4:表S3。

规范抄本的功能注释

分层聚类揭示了外周血中与IA破裂相关的两种主要基因转录模式(任意描述为A-B;无花果。1a).这两组显示出相反的基因表达水平上调和下调模式。来自第一个簇的转录本(303个)显示对SAH应答的丰度下降。第二簇包括IA破裂后上调的基因(186个)。每个模式的基因通过GO BP术语和Wiki Pathways 2016类别进行分析。对下调基因的功能分析表明，表达最多的生物过程是与白细胞激活阳性(GO:0002694)和T细胞分化相关的生物过程(GO:0042110)。在Wiki通路中，与t细胞受体信号转导、炎症反应和核糖体蛋白相关的通路在调控基因中富集。包括聚集到这个组的转录本示例CD28，ITK而且ZAP70．在mRNA丰度升高的基因中，与toll样受体信号通路(GO:0002224)和炎症反应激活(GO:0006954)相关的转录本过多。对这种模式的分析还揭示了IL1和IL4信号通路相关基因的富集，包括IL1R1，IL1R而且IRAK3．

为了研究IA破裂对转录改变的响应机制，我们在共表达转录物的调控区域中寻找过度代表的转录因子结合位点(TFBSs)。我们利用richr在线资源中实现的模块利用可用的ChIP-seq数据(ChIP Enrichment Analysis, ChEA)。转录下调的启动子在ChIP-seq信号中对几种转录因子表现出显著的过度表达，包括STAT6(调整后的p = 7 × 10⁻⁸， ChEA:“STAT6_20620947_ChIP-Seq_CD4_POS_T_Human”)和RUNX(调整后的p = 7.3 × 10⁻⁷， ChEA: " RUNX_20019798_ChIP-Seq_JUKART_Human ")。mRNA丰度增加的基因有一组不同的假定的转录调节结合位点，包括ELF2(校正p = 0.01, ChEA: " nerf2_26677805_chip - seq_巨噬gess_mouse ")和SMRT(校正p = 0.01, ChEA: " SMRT_22465074_ChIP-Seq_MACROPHAGES_Mouse ")1b)。

以A和B模式表达基因的细胞类型鉴定参照人类基因图谱进行。在CD4+中发现了高度显著的A型转录本富集(校正p = 1.9 × 10)⁻¹³)和CD8+ t细胞(校正后p = 3.8 × 10)⁻¹²)．在全血中发现来自模式B的富集转录本(校正后p = 1.2 × 10)⁻²⁴)和CD33+髓系细胞(校正后p = 2.2 × 10⁻⁵)(图。1b).关于功能分类、TFBSs过代表、细胞类型富集等细节详见附加文件5:表S4。

转录变异的鉴定和分类

为了确定血液转录组的多样性，我们使用29种已知生物型(基于Vega注释;额外的文件4:表S3)。72.5%的调控转录本是蛋白质编码，相比之下，在基础条件下表达的转录本(FPKM > 0.5)为50.2%(图2)。2)．大多数非编码调控转录本被分类为保留内含子(10.4%)和加工转录本(5.7%)(在基础条件下分别为21.7%和12%)。因此，我们进一步研究了RAA组中改变基因的pre-mRNA水平。我们比较了与上调和下调基因的外显子或内含子对齐的reads的数量。我们发现，下调基因的外显子/内含子比值评分显著降低。

转录改变的分类表明不同类型的差异表达基因的替代表达。在基因异构体水平，替代外显子剪接和替代启动子使用的分析是通过Cuffdiff完成的。我们发现了148个特异基因亚型(注释到120个基因)在IA破裂反应中发生改变(校正p < 0.01, fold > 4)。大多数转录本在RAA和C(132)以及RAA和RAC(125)之间存在差异。只有2种转录亚型(的DEFA3而且IFI27)在RAC组和C组间呈现不同水平。在对所执行的测试数量进行校正后，我们没有发现任何有统计学意义的差异的替代剪接或替代启动子(附加文件)6:表S5)。

基因替代表达的验证

我们用qPCR对NGS的结果进行验证。从IA破裂后调控的491个转录本中，我们选择了8个亚型特异性基因表达的潜在例子(通过Ensembl Transcript ID识别)。所选基因(附加文件1表S1)的特征是特定异构体的不同调控谱，每个分析的转录本包含独特的外显子和平均mRNA丰度水平> 4 FPKM。这些变化是使用定制的TaqMan测定法来测量的，该测定法旨在检测特定的转录变异。我们发现基因亚型的表达水平显著不同HEATR1(ENST00000366582),ACBD6(ENST00000367595),CCND2(ENST00000261254),PLEKHA1(ENST00000368990),ELF2(ENST00000511184和ENST00000510408)，以及CFLAR(ENST00000342795, ENST00000425030和ENST00000309955)。同一基因的不同亚型之间的调控相反的概况被揭示HEATR1，ACBD6而且ELF2(无花果。3.)．在这种情况下PLEKHA1而且CFLAR，所有分析的变异在IA破裂反应中表现出相似的调控。为CCND2,只有一个TaqMan试验有效，结果证实了NGS检测到的下调。为TRAF1(ENST00000373887)和PPP1R16B(ENST00000299824)的突变谱与RNA-seq法得到的突变谱相似，但不具有统计学意义。IA破裂对特定基因亚型表达的影响是可重复的。

IAs破裂对外周血单个核细胞亚群的影响

在SAH急性期，我们发现与慢性期相比，总单核细胞计数显著增加(p < 0.01)。在RAA患者中，与对照组相比，经典单核细胞计数更高，与RAC相比，经典和中间单核细胞计数都更高。亚群的比例在研究组之间也有所不同:在RAA受试者中，非经典单核细胞的百分比与对照组相比较低，但与RAC患者相比，中间单核细胞的百分比较高。我们没有观察到RAC组和C组之间有显著差异(图。4a).淋巴细胞数量也有动态变化。

也就是说，SAH急性期的总计数低于对照组和晚期(p < 0.01)。CD3+ (t淋巴细胞)以及CD4+和CD8+亚群也是如此。在研究的淋巴细胞亚群中，与其余组相比，急性SAH中只有CD4+百分比显著下降。此外，与对照组相比，RAA患者CD4+/CD8+比值显著降低(分别为1.96 vs 2.66, p < 0.03)(图。4b).淋巴细胞水平的差异与患者的临床结局相关。格拉斯哥预后量表评分为4-5分和1-3分的患者的比较表明淋巴细胞减少与预后较差相关(p < 0.05)。我们没有观察到任何显著的变化我NKT细胞计数(未显示)。

为了解决观察到的转录水平变化是否只与细胞来源数量有关的问题，我们分析了细胞类型特异性转录本的变化。通过从BioGPS数据库(Human U133A/GNF1H GeneAtlas数据集)获得的mRNA丰度水平，鉴定CD4+和CD14+细胞群中特异性表达的转录本。在细胞水平上，RAA组单核细胞计数比C组增加了1.3倍，而CD14+富集的转录本在RAA组增加了1.8- 4.6倍。RAA组CD4+计数比C组低1.5倍，CD4+富集转录水平下降2倍。这可能表明，观察到的T细胞特异性转录物(至少CD4+)的变化主要由细胞数量驱动，而单核细胞转录则受到病理过程的积极调控。

L / MN指数

我们测试了先前提出的L/MN指数来评估RAA患者的预后[6］．与RAA患者相比，C患者的平均L/MN值显著升高(分别为0.78 vs 0.24;p = 2.16E⁻¹⁰)．L/MN指数也与SAH严重程度相关:入院时格拉斯哥昏迷量表评分为14-15分的RAA患者的L/MN指数显著高于评分为3-13分的RAA患者(分别为0.26 vs 0.15;p < 0.05)。当2例死亡患者与存活患者(n = 17)进行比较时，我们观察到预后最差的患者名义上L/MN指数较低。然而，差异没有统计学意义。与C相比，RAC患者的平均L/MN指数(0.88)略高。

IA破裂，特别是在急性期，会引起外周血细胞组成及其转录谱的显著变化。所提出的结果提示淋巴细胞反应的抑制和促炎单核细胞活性的增强。这些影响在IA破裂几个月后不再可检测到。同样，van 't Hof等人在IA破裂数年后调查的SAH幸存者的血细胞基因表达谱没有发现任何显著变化[16］．

转录谱分析显示，与炎症反应激活、toll样受体信号转导和先天免疫激活相关的转录本丰度增加，同时与阳性白细胞激活、t细胞分化和CD4+和CD8+淋巴细胞相关的转录本下调。这与我们之前的发现一致[8］．此外，我们证实先前提出的L/MN指数(基于淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞相关基因的表达水平)在IA破裂后早期SAH患者中明显低于对照组。在细胞水平上也观察到类似的变化方向。

在急性SAH中，总单核细胞计数的增加似乎主要是由经典单核细胞计数的增加所驱动的。心肌梗死中也有类似的变化[17］．对单核细胞亚群比例的分析表明，IA破裂早期，经典单核细胞的百分比没有明显变化，而中间单核细胞的百分比与对照组相比增加，与慢性期相比非经典单核细胞的百分比下降。这些变化与之前发表的观察结果相似[12］．关于IA破裂对单核细胞影响的现有数据是相互矛盾的。单核细胞数量的增加和活化[18]以及没有报告有任何重大变化[6］．我们的结果表明，在急性SAH中，单核细胞的数量随着经典单核细胞计数的优先增加而增加，而观察亚群比例-非经典单核细胞的减少。在急性缺血性中风中也有类似的发现[13］．在一个实验模型中，缺血性中风被证明可以通过骨髓干细胞促进单核细胞的产生[19，20.］．在人类中，全身炎症导致经典单核细胞从骨髓中释放，并随后成熟为中间细胞和非经典细胞[21］．现有的数据表明，经典的单核细胞首先对炎症反应，然后它们可以成熟为亲或抗炎细胞。本研究的结果还表明IA破裂引起了类似的影响，即经典单核细胞的释放，随后它们转变为其他亚类。

同时，我们注意到CD4+和CD8+ t淋巴细胞水平显著下降。先前报道过IA破裂24小时内CD3+细胞数量下降[12］．然而，动脉瘤性SAH患者和对照组之间CD4+和CD8+数字没有显著差异。在其他类型中风的急性期，即脑出血和脑梗死，发现总淋巴细胞计数和CD3+、CD4+和CD8+亚群计数下降[22，23］．在不同类型的中风中，t淋巴细胞数量的减少与较差的初始临床状态和较差的预后相关[5，11，22，23，24，25］．此外，TFBSs的分析指出了SAH急性期促炎反应的转变和t细胞的放松。在转录水平下调的倡导者中，我们发现在STAT6而且RUNX．在单核细胞,STAT6在抗炎基因的转录中起重要作用[26］．Runx蛋白对CD4+和CD8+淋巴细胞的分化和功能至关重要[27］．缺乏变化我缺血性中风后NKT细胞计数的研究既往有报道[28］．

SAH的系统反应显然是一个动态过程。IA破裂主要引起蛋白质编码转录本的改变。有趣的是，在急性期对差异表达基因的pre- mrna的分析显示，在下调的转录物中，外显子/内含子的比例较低。这可能意味着要尝试增强基因的表达，这些基因的总水平由于产生它们的细胞(可能是t细胞)数量的减少而下降。对于相当一部分基因，我们能够识别出交替剪接的异构体。大多数是急性SAH所特有的。类似的，在不同病因的脑出血和缺血性脑卒中中也有特异性mRNA亚型的报道[29］．这些转录改变的功能意义尚不清楚。ELF2(e74样因子2)在淋巴细胞发育中起重要作用。两个ELF2从替代启动子衍生的异构体已被证明对细胞增殖发挥相反的作用。也就是说，ELF2B对细胞周期进展和生存以及诱导凋亡有负面影响，这些负面影响依赖于n端的存在[30.］．在这里，我们发现一些ELF2与慢性期相比，急性SAH转录本的表达变化方向相反。RAA中上调的亚型由最初的7个外显子构建而成，而下调的转录本则拥有6-7个末端外显子。另一种不同亚型表达的基因是ACBD6(酰基辅酶A结合域包含成员6)。它主要在造血祖细胞中表达，对脂质稳态很重要[31，32］．在这里，只有含有锚蛋白重复基序的c端可变剪接影响的异构体在RAA中表达较低。这些重复序列介导蛋白质-蛋白质相互作用。为HEATR1(HEAT repeat-containing protein 1)，我们还发现IA破裂后不同的亚型在不同时期可能有不同的表达水平。HEATR1蛋白参与核糖体生物发生的调控[33］．HEATR1下调导致g1细胞周期阻滞[34］．这里，其中一个HEATR1转录水平在RAA患者中下调。内的突变ELF2而且HEATR1在t细胞白血病/淋巴瘤患者中被发现[35］．

提出的结果表明IA破裂引起外周血细胞转录组的多向改变。在缺血性中风中，中风诱导的免疫缺陷综合征是一种公认的现象，其涉及脾脏和胸腺中t淋巴细胞计数减少和免疫细胞凋亡增强[36，37］．总之，这些结果强烈表明，免疫系统对急性血管事件的反应是由许多共同的机制所强调的。免疫抑制的意义尚不清楚。一方面，它与更严重的脑损伤和感染风险增加有关。然而，它可以在限制大脑炎症反应和减少对脑源性自身抗原的免疫反应方面发挥积极作用[38］．有趣的是，对细胞数量和转录本水平变化的分析表明，在急性SAH中，单核细胞特异性转录本的变化受到积极调控，而与淋巴细胞相关的转录本则取决于细胞计数。

我们的研究有一些潜在的局限性。一个是样本量有限，在另一组患者中获得的结果缺乏验证。然而，在某种程度上，目前的研究是我们以前工作的延伸，结果是明显平行的。我们能够确认L/MN指数的特异性。接下来，对于转录组学，我们使用总外周白细胞。在特定细胞亚类中进行的分析将对IA破裂的系统反应提供更全面的见解。这种方法还需要大量的血液采样，关于细胞分选过程(分离细胞亚群)如何影响基因表达的问题仍然存在。此外，我们意识到我们的研究倾向于纳入临床条件相对较好的RAA患者。对于流式细胞术程序，只有在实验室工作时间内新鲜获得的血液样本是有用的。在任何与研究相关的程序开始之前，我们需要获得知情同意——几乎所有情况下，这些同意都是由患者自己给予的。 That means that patients admitted in the afternoon, in the evening, or at nights, holidays, etc. who required immediate interventions could to be included into the study.

总之，本研究结果表明IA破裂引起明显的全身反应，明显影响外周血细胞的转录谱以及单个核细胞的组成。在这里发现的基因表达改变的特定模式表明淋巴细胞反应的抑制和单核细胞活性的增强。这些改变在细胞组成和基因表达谱中都可以看到。

ACBD6:

酰基辅酶A结合域包含成员6

C:

对照组

ELF2:

e74样因子2

罗斯福:

错误发现率

HEATR1:

含热重复蛋白1

HPRT1:

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

IA:

颅内动脉瘤

iNKT细胞:

不变的自然杀手T细胞

L / MN指数:

lymphocyte-to-monocyte-and-neutrophil指数

门店:

新一代测序

qPCR:

定量聚合酶链反应

RAA:

急性破裂动脉瘤

RAC:

慢性破裂动脉瘤

长官:

蛛网膜下腔出血

TFBSs:

转录因子结合位点

白细胞:

白细胞

MK、RM和JP参与了研究设计和数据采集。MK、MP、RM、DH、SG、TD、JP参与了数据分析和稿件准备工作。所有作者都对数据解释做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

确认

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

数据和材料的可用性

RNA-seq数据提交到NCBI序列读取档案(SRA): SRP150595。在当前研究中使用和/或分析的其他数据集可根据合理要求从通信作者处获得。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

所有参与者或他们的监护人都获得了知情的书面同意，该研究得到了雅盖隆大学生物伦理委员会的批准(决定号KBET/16/B/2012)。

资金

这项工作由国家科学中心资助(批准号2014/13/B/NZ4/00148)。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

作者及隶属关系

1. 波兰科学院药理学研究所分子神经药理学部，ul。Smetna 12,31 -343, Kraków，波兰

   Michal Korostynski, Marcin Piechota, Slawomir Golda和Magdalena Zygmunt

2. 雅盖隆大学医学院神经外科和神经创伤学系。Botaniczna 3,31 -503, Kraków，波兰

   Rafal Morga & Marek Moskala

3. Intelliseq sp. z o.o.， ul。查布罗瓦12月3日，31-335,Kraków，波兰

   Dzesika Hoinkis

4. 雅盖隆大学医学院神经内科Botaniczna 3,31 -503, Kraków，波兰

   Tomasz Dziedzic, Agnieszka Slowik和Joanna Pera

相应的作者

对应到乔安娜啤梨．

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