无细胞胎儿DNA筛查主要三体在不典型情况下对孕早期母亲血清筛查的有效性和可靠性

背景

HCG和/或ppap - a值不典型的患者染色体异常和妊娠血管并发症的风险较高。cfDNA在这一特定人群中的表现尚未得到评估。

目标

主要目的是评估cfDNA在筛查HCG < 0.25倍中位数(MoM)、HCG > 5.0 MoM和/或pap - a < 0.25 MoM、pap - a > 2.5 MoM的21、18和13三体患者中的有用性和可靠性。次要目的是评估cfDNA检测对预测妊娠血管并发症的贡献。

方法

在2016年6月至2017年7月期间，我们在一项回顾性、观察性和多中心研究中分析了来自法国各地的一组女性，她们至少有一个妊娠早期血清生物标志物超出正常范围。单次妊娠、正常妊娠早期超声检查的患者，无论联合妊娠早期筛查试验结果如何，都被纳入研究范围。采用大规模并行测序技术对cfDNA进行分析。通过敏感性和特异性计算评价cfDNA检测的准确性，并采用多因素回归分析寻找妊娠血管并发症的预测因素。

结果

在498例接受cfDNA检测的患者中，有21例(4.2%)因随访失败而被排除在外。在477例患者中，最初有4例患者出现试验失败，重划后减少到2例(0.4%)。CfDNA阳性21三体19例，阳性18三体6例，阳性13三体1例，阴性449例。cfDNA法筛查21三体的敏感性为100% (19/19)(IC 95% 82.4 ~ 100)，特异性为100% (458/458)(IC 95% 99.2 ~ 100)。纳入血管并发症预测的447例患者中，妊娠高血压4例，先兆子痫10例，未发现其预测因素。第5百分位以下子宫内生长受限(n = 44, 9.8%)与低胎分数显著相关(OR = 0.87, IC 95% 0.79-0.96, p = 0.006)。

结论

cfDNA检测是一种有效和可靠的工具，妇女与非典型的前三个月血清生物标志物。

细胞游离胎儿DNA (cfDNA)测试已广泛证明其在高危人群和一般人群中筛查21、18和13三体的性能[1，2］．近年来，由于其良好的敏感性和特异性，加上其非侵入性，在临床实践中的应用不断增加。主要是因为它的成本高，目前很少被用作一级筛查测试，评估哪些患者从这种工具中受益最多似乎很重要。

当孕早期血清生化指标[游离β人绒毛膜促性腺激素(HCG)和妊娠相关血浆蛋白-a (pap -a)]的结果与一般人群的平均值相差很大时，计算风险的软件程序无法考虑实际值，因为它们不足以拟合计算公式[3.］．因此，该软件采用截断模型，并使用可用的最极端值而不是实数。这可能导致对计算风险的低估，因此有报道称，这些HCG或ppap - a值异常高或低的患者核型异常的风险更高[3.］．在联合检查后，这些非典型值可有助于将患者归入高风险组，但如果其他标准在正常范围内(年龄和妊娠早期超声检查的颈部半透明)则不一定。因此，无论联合测试结果如何，我们选择研究妊娠早期筛查试验的非典型特征(HCG和ppap - a率高或低)的女性。在这一人群中，妊娠期血管并发症的风险也较高，如子痫前期(PE)和子宫内生长受限(IUGR) [4，5，6，7］．事实上，一些作者提出，这些血管风险与胎儿cfDNA片段之间可能存在关联[8，9，10，11，12］．众所周知，这种较高的血管并发症风险主要涉及高HCG和低pap - a的患者，但由于没有关于cfDNA检测与这些血清生化非典型值之间联系的数据，我们选择将低HCG和高pap - a的患者也纳入分析。

本研究的主要目的是评估cfDNA检测在筛查21、18和13三体的有效性和可靠性，这些三体是在妊娠早期母体血清筛查非典型特征的患者中进行的。第二个目的是评估cfDNA检测在预测妊娠血管并发症中的作用。

研究设计

所有cfDNA检测均在临床环境下进行。我们进行了一项回顾性、多中心和全国性的研究，包括来自法国各地的女性，她们接受了cfDNA检测，并被送往CERBA实验室(因为该实验室是法国少数获准进行该检测的实验室之一，并与来自全国各地的医疗保健从业者合作)，并且至少有一项非典型生化标志物的妊娠早期筛查试验。纳入标准为18岁或以上，单胎妊娠，根据法国国家推荐的正常妊娠早期超声检查[13](特别是低于95百分位胎龄的颈透明)，妊娠11至13.6周(WG)之间进行的妊娠早期筛选试验，cfDNA检测，以及至少一项非典型值的妊娠早期血清检测(游离ß HCG < 0.25倍中位数(MoM)， HCG > 5.0 MoM和/或pap - a < 0.25 MoM, pap - a > 2.5 MoM)。为这些值选择的截止值是根据文献中发现的最常见和临床相关的值来决定的[3.］．未在11 - 13.6 WG之间进行妊娠早期超声检查的患者以及妊娠中期筛查试验的患者不包括在内。在早期超声波中描述的双胞胎消失的患者不包括在内，因为众所周知，这可能会影响HCG和ppap - a测定的水平，以及cfDNA测定的结果[14］．

妊娠性高血压(妊高征)定义为血压高于140和/或90 mmHg的女性，没有任何慢性高血压病史。PE定义为伴蛋白尿0.3 g/24 h以上的妊高征。早期PE定义为37周前分娩的妊高征。根据Audipog生长曲线，子宫内生长受限(IUGR)定义为出生体重低于第10百分位[15］．如果出生体重低于第5百分位，则被认为是严重的。

我们收集了所选患者的所有可用的计算机数据，并通过普通邮件或电子邮件向每一位开出cfDNA检测处方的保健医生发送了一份调查，以收集所有妊娠结果。在没有回应或缺乏信息的情况下，通过电话询问医疗保健从业人员或患者本人。所有数据都被去识别，以确保患者的隐私和机密性。根据法国有关产前诊断的规定，所有患者均获得书面知情同意。CERBA实验室由区域卫生局授权进行这些筛选试验。这项研究得到了法国CEROG伦理审查委员会的批准(提交号CEROG 2018-OBST-0103)。

母体血浆游离DNA分析

在2例cfDNA BCT stack中采集母体血液^®试管(每个10ml)，并在+ 4°C下送往临床实验室，在双离心程序收集血浆后4天内分离血浆，如果不立即处理，则在≤- 70°C下冷冻保存。通过使用全基因组方法进行大规模并行测序来分析母体血浆中的CfDNA，或采用先前所述的自酿分析[16]或使用CE-IVD标记的VeriSeq NIPT检测(Illumina^®自2017年5月起，由于法国法规的修改。在每次实验中，没有模板对照、来自整倍体孕妇的血浆，或由非孕妇血浆和三体13、18或21库混合制备的低阳性对照与患者样本同时运行。最后，使用Bowtie版本2将序列读取映射到UCSC hg19版本的人类基因组;计算目标染色体13、18和21的z得分。当实验满足以下度量标准时，结果表示为“阳性”或“阴性”:文库浓度≥7.5 nM，对齐序列总数≥900万，无扩增偏置。从孕妇血浆中估计胎儿DNA分数可单独使用序列读取计数(称为SeqFF) [17]或结合片段大小分布和基于Y染色体的方法(VeriSeq NIPT)。

统计分析

描述性结果报告为分类变量的百分比和数量变量的中位数和范围。该测试的特点是特异性和阳性预测值。精确的95%置信区间采用二项分布计算。百分比比较采用Chi平方检验或Fisher精确检验。Mann-Whitney U检验用于比较中位数。

以受孕方式(体外受精或自然受孕)、种族、多胎为分类变量，以母体年龄(年)、体重(kg)、试验时胎龄(孕周)、HCG和ppap - a水平、胎儿细胞游离DNA分数为连续数值变量，采用单因素分析探讨血管性妊娠并发症是否与不同因素相关。随后进行多元逻辑回归分析，以确定这些变量的显著独立贡献，在单因素分析中得到p < 0.1。进行亚组分析，以确定某一组患者是否有血管并发症的风险(ppap -A和HCG均升高组，两种生物标志物均低组，或混合组)。

数据使用统计软件MedCalc, version 15.11.4 (Mariarkerke^®(比利时)和Excel 15.0版本(微软^®华盛顿州雷德蒙德)。双侧p值小于0.05被认为有统计学意义。

2016年6月至2017年7月，498例非典型妊娠早期血清筛查患者符合纳入标准。我们排除了21例(4.1%)未获得妊娠结局的患者。我们的研究流程图如图所示。1．产妇平均年龄32.8岁，平均体重63 kg。cfDNA抽血时的平均胎龄为15.2 WG(范围11.4-34.1 WG)。平均胎率为11.0%(范围1.0 ~ 31.8%)。表格1恢复患者的主要特征。在我们的研究队列中，391例(82%)患者在妊娠早期筛查后的综合风险高于1/1000。

筛选21、18、13三体的试验性能

在分析的477例患者中，最初有4例患者出现“未呼叫”结果，重新抽取后减少到2例患者(0.4%)。对于这两例患者，由于胎儿分数低，结果未被报道。其中一人在正常妊娠随访后产下表型正常的新生儿，另一人在严重胎儿生长迟缓的情况下被诊断为19 WG死产，核型正常，胎盘血管异常。477例患者中，26例cfDNA检测阳性。羊膜穿刺术后胎儿核型证实22例。其余4例患者，羊膜穿刺术发现核型正常，妊娠随访正常。其中3例在出生后被证实为局限性胎盘镶嵌(最后一例未进行胎盘分析)。在这组26例cfDNA阳性试验中，25例(96.2%)患者在妊娠早期筛查试验后综合风险优于1/1000。

在449例cfDNA检测阴性的患者中，445例因其他原因在怀孕期间核型正常或出生时表型正常。出生后未发现21、18、13三体。在四例病例中，在怀孕期间发现了不同的染色体异常(1例特纳综合征，2例triploïdy和1例Di-George综合征)，这得益于在妊娠中期和晚期进行的系统常规超声检查，这是法国对所有孕妇的推荐。总的来说，在我们的研究人群中，cfDNA检测对21三体的特异性为100% (CI 95%， 99.2-100.0)，对18三体的特异性为99.4% (CI 95% 98.2-99.9)，对13三体的特异性为99.8% (CI 95% 98.9-100.0)。特异性和敏感性计算详见表2．

筛查血管并发症的试验性能

在本分析中，我们排除了所有染色体异常的患者(所有cfDNA检测阳性和其他染色体异常的4例患者)。事实上，这些患者更容易出现IUGR，因为它通常是胎儿病理的一部分，而不是胎盘功能障碍的反映。除此之外，该组患者大多要求终止妊娠，根据法国规定，这种情况多发生在怀孕早期。

在剩余的447例患者中，报告了4例(0.9%)的PIH, 10例(2.2%)的PE和5例(1.1%)的早期PE。对于这些事件，在单变量或多变量分析中没有发现预测因素。在亚组分析中，PE与pap - a和HCG低水平亚组相比，与pap - a和HCG均升高或混合组存在相关性趋势，但未达到统计学意义(图2)。3.）.

IUGR 65例(14.5%)，与产妇年龄(OR 1.08, CI 95% 1.02 ~ 1.16, p = 0.015)、pap - a水平(OR 0.37, CI 95% 0.24 ~ 0.57, p < 0.0001)、辅助生育(OR 4.26, CI 95% 1.54 ~ 11.75, p = 0.005)有统计学相关性。与cfDNA检测计算的胎儿分数无相关性(OR 0.95, CI 95% 0.87-1.02, p = 0.18)。另一方面，第5百分位以下的严重IUGR (n = 44, 9.8%)除cfDNA试验时的胎龄(OR = 1.12, CI 95% 1.02-1.25, p = 0.019)、ppap - a水平(OR 0.31, CI 95% 0.17-0.59, p = 0.0003)和医学辅助生育(OR = 3.75, CI 95% 1.18-11.90, p = 0.025)外，cfDNA试验中胎儿分数低(OR = 0.87, ICI 95% 0.79-0.96, p = 0.006)均显著相关。这些发现详见表3.,无花果。2而且3.．

本研究的主要发现

我们的研究表明，在单胎妊娠早期超声检查正常且早期血清检测值不典型的情况下，即HCG < 0.25 MoM, HCG > 5.0 MoM和/或pap - a < 0.25 MoM, pap - a > 2.5 MoM, cfDNA检测在筛查严重三体方面具有较低的失败率和良好的性能。因此，CfDNA可以用于这一特定人群的筛选测试。此外，我们没有发现非典型生化标志物与PE发生之间的显著相关性，但在胎龄第5百分位以下的胎儿分数水平与出生体重之间存在相关性。

与以往研究结果比较

非典型早期妊娠筛查血清结果的患者染色体异常的风险高于一般人群[3.］．我们的目的是探索cfDNA检测是否对这一特定人群有意义。事实上，我们发现这种测试对于筛查严重三体症有很好的敏感性和特异性，并鼓励我们对这些患者使用这种测试。据我们所知，这是第一个探索cfDNA在非典型血清结果患者中的有效性和可靠性的研究。

围绕cfDNA广泛使用的担忧之一是忽略了21、18和13三体以外的其他染色体异常，因为胎儿核型侵入性手术的数量减少了。2014年，Petersen等人报道了一项基于丹麦19.3万名患者的国家数据库的广泛观察性研究，显示在核型染色体异常的患者中，有23%的人会被cfDNA遗漏，但所有人都通过超声随访进行了筛查[18］．Lindquist等人也报道了一系列病例，当对合并风险高、HCG或ppap - a结果低于0.2 MoM或任何超声异常的患者进行侵入性手术时，丢失另一个染色体异常的风险降低了90% [19］．我们的结果倾向于强化这样的观点，即使用cfDNA不会增加丢失其他染色体异常的风险，即使在这个特定的人群中，因为只有4例患者被关注，所有患者都是通过超声随访诊断的。

由于其出色的性能率，有人建议简单地取消前三个月的联合风险计算，直接向所有孕妇提供cfDNA检测[20.］．然而，正如Dukhovny等人所示，通过应用这种策略，我们可能会错过一些关于怀孕风险的信息，包括血管并发症。[21］．事实上，有研究表明，ppap - a水平低的患者暴露于PE和PIH的更高风险[12，22，23，24]，以及IUGR [22，23］．低水平的HCG也可能与IUGR的高风险有关[22，25，26］．

虽然关于这一主题的文献丰富，但大量研究表明，预测和预防PE发生的最佳策略是基于一个模型，该模型考虑了母亲的特征、物理和生化标志物，包括测量胎盘生长因子，而不是ppap - a或HCG [27，28，29，30.，31，32］．

一些作者探索了cfDNA检测与血管并发症之间的可能联系，特别是研究了为每个患者计算的胎儿cfDNA分数。这一联系背后的主要生理病理假设是PE可能引起氧化应激，从而增加胎盘凋亡[33和cfDNA的传播。因此，这些患者的母体血液中胎盘DNA水平应升高[11，34，35，36］．研究表明，胎儿分数的这种变化在血管并发症首次临床症状出现前3周就已出现[11］．虽然这一理论似乎合乎逻辑，但文献中的临床发现是不同的，因为一些作者发现这些患者的胎儿分数率较低[37，38，39］．其他作者只发现胎儿分数与早期PE之间的联系[9，36］．在我们的研究中，胎儿分数与妊高征或妊高征的发生之间没有显著相关性，因为这些母亲血管事件的发生率非常低，因此缺乏统计学说服力。

关于胎儿生长受限，我们发现与低胎儿分数显著相关。先前的作者已经证明了低胎儿分数与IUGR < 37周之间的相关性[38］．

对临床实践的启示

CfDNA最初被推广为基于常规筛查测试的二线检测，用于检测已经存在严重三体高风险的孕妇[40］．CfDNA现在被认为是一种可接受的一线筛查测试，一些国家，如比利时，将其引入到所有有背景风险的孕妇中，但生物化学测试不再使用，因为它不能与CfDNA的使用一起累积偿还。这种策略可能有2个问题:第一，cfDNA在非典型生化结果患者中的表现;第二，在非典型生化后通过诊断测试发现的非典型染色体异常的检测减少的风险。我们的研究排除了这些担忧，结果表明，在妊娠前三个月筛查严重三体时，可以不再使用任何ppap - a和HCG。

优势与局限性

我们研究的优势在于，这是一项多中心研究，涉及来自全国各地的患者，这使得我们的队列代表了法国总人口，并使我们认为这些结果可以外推。此外，由于全法国医疗保健从业者的广泛响应，我们成功地获得了很大比例的妊娠结局，只有4.2%的妊娠结局丢失。

我们研究的一个局限性是，PIH和PE的低发生率使我们无法获得足够的统计力来得出血管事件与cfDNA中胎儿分数之间的联系。另一方面，我们的研究主要不是为了研究这种关联，如果将所有生物化学结果正常的病例也纳入本研究，则会更好。在这一点上的另一个限制是，我们的队列仅包含HCG和/或ppap - a非典型结果的患者，没有任何对照组。然而，我们研究的目的并不是要证明该组血管并发症的风险高于对照组，这在文献中已被广泛证实，而是要说明cfDNA在本课题中的潜在贡献。

在一组非典型妊娠早期筛查血清结果的患者中，cfDNA检测21三体的表现似乎与一般人群中报道的结果相似。目前，18和13三体病例的数量太少，无法准确评估cfDNA检测在这一特定人群中的预测性能。在未来几年，我们可能会看到cfDNA分析的价格下降，特别是随着新的负担得起的技术的引入，这些技术可能会与生化测试的价格竞争[41］．在许多发达国家，这可能是pap - a和HCG在妊娠前三个月筛查严重三体症的终结。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

AMP:

辅助医疗生育

cfDNA:

游离DNA

置信区间:

置信区间

促:

人类绒毛膜促性腺激素

IUGR:

子宫内生长受限

妈妈:

中位数的倍数

NIPT:

无创产前检查

或者:

奇怪的比例

PAPP-A:

妊娠相关血浆蛋白a

体育:

子痫前期

PIH:

妊娠性高血压

工作组:

怀孕周

作者感谢Martine Olivi, Sandrine Moukoury和Ramdane Mallek的技术支持，以及David Marsh的语言编辑。

作者声明他们没有这项研究的资金来源。

作者及隶属关系

1. Service de Gynécologie-Obstétrique, Hôpital Antoine Béclère, AP-HP, 157 Rue de la Porte de Trivaux, 92140，法国Clamart

   Julie Carrara, Alexandre Vivanti, Adèle Demain & Alexandra Benachi

2. Université Paris Saclay, 91190, Saint-Aubin，法国

   Julie Carrara, Alexandre Vivanti和Alexandra Benachi

3. 布鲁格曼大学医院妇产科，Université布鲁塞尔自由城，比利时布鲁塞尔

   贾尼

4. CERBA实验室，圣图昂'Aumône，法国

   jean - marc科斯塔

贡献

JC、AV、AD、AB收集、分析、解释患者资料。JC是撰写手稿的主要贡献者。AB协调团队工作，是撰写手稿的主要贡献者。JMC执行并解释了cfDNA测试，并修改了手稿。JCJ分析和解释患者资料，进行所有的统计分析，并修改手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到朱莉·卡拉拉．

伦理批准并同意参与

根据法国有关产前诊断的规定，所有患者均获得书面知情同意。CERBA实验室由区域卫生局授权进行cfDNA筛选测试。这项研究得到了法国CEROG伦理审查委员会的批准(提交号CEROG 2018-OBST-0103)。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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