癌症异质性:将局限性转化为生物信息的来源

对人类癌症空间和时间遗传异质性的分析表明，大多数癌症的体细胞癌进化不是一个简单的线性过程，由几个连续的突变获取和克隆扩增步骤组成。平行进化已在许多早期人类癌症中观察到，导致遗传异质性和多谱系进展。此外，非整倍体以及结构染色体畸变似乎是以非线性、间断模式获得的，其中大多数畸变发生在体细胞癌进化的早期阶段。在后期，癌症基因组似乎得到稳定，只获得少量额外的重排。虽然平行进化表明在体细胞癌进化的早期阶段驱动突变的正向选择，但在晚期结构畸变的稳定表明，当癌细胞逐渐失去对额外突变获取的耐受性时，负向选择起作用。癌症样本中遗传异质性亚克隆的混合降低了突变检测的敏感性。此外，仅在一小部分癌细胞中出现的驱动突变更有可能被误认为乘客突变。因此，遗传异质性可能被认为是一个限制负面影响检测敏感性的驱动突变。另一方面，在人类癌症中鉴定亚克隆和亚克隆谱系可能会导致更深刻地理解在人类癌症中形成体细胞癌进化的选择力量。通过分析空间异质性识别平行进化可能提示驱动突变，这些驱动突变可能代表单克隆状态下除了驱动突变之外的其他治疗靶点。 Likewise, stabilization of cancer genomes which can be identified by analyzing temporal genetic heterogeneity might hint to genes and pathways which have become essential for survival of cancer cell lineages at later stages of cancer evolution. These genes and pathways might also constitute patient specific therapeutic targets.

恶性肿瘤可表现出高度的时空遗传异质性[1，2］．遗传异质性是基因不稳定的癌细胞多系体细胞进化的结果，被认为是经典细胞毒药物和现代靶向治疗失败的主要原因[2］．在这篇综述中，我们想为这样一种假设提供证据，即分析空间和时间遗传异质性可以提高分子癌症分析的信息含量，这是确定合适的患者特异性治疗靶点的关键。

突变负荷不随癌症进展线性增加

在结肠癌中仅鉴定出少数特定的突变，这表明恶性进展是随着有限数量的致癌突变的持续积累而进行的，随后是突变亚克隆的克隆扩增，从而导致癌症进化的线性多步骤过程[3.］．分析个体患者原发肿瘤和转移的躯体癌演化后续研究[4，5]，单一癌症的复杂染色体重排事件[1，6，7，8]或一个恶性肿瘤内有多个单细胞[1，2，9，10，11)无法证实这一假设。相比之下，大多数数据表明结构和数值染色体畸变以及基因突变的非线性累积。这被称为间断进化[10］．

非整倍体、更复杂的染色体重排以及丰富的基因拷贝数变异等染色体畸变可在恶性进展的早期发现，这些结构突变似乎在体细胞癌发展和临床进展的后期得到稳定。这已在许多肿瘤中得到证实，如恶性黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌[1，2，4，5，6，7，8，9，10，11］．

点突变似乎更稳定地获得，但至少在黑色素瘤中，更晚期的肿瘤并不总是显示更高的突变负荷[12，13］．

这种对体细胞癌进化的洞察提出了两个主要问题:

• 为什么癌细胞在癌症发生的早期阶段获得大多数结构突变(非整倍体、重排、易位、基因拷贝数变异)和可能大多数驱动点突变，与转移癌细胞相比，基因组不稳定的分子和组织学迹象(如非典型性有丝分裂)不那么明显?

• 是什么机制导致恶性进展后期癌症基因组的明显稳定?

非整倍体在恒定的选择压力下是伪稳定的

非整倍体吸引了几代病理学家，因为非典型有丝分裂是导致染色体不平等分布的关键过程，在显微镜下可见于癌症样本[14］．此外，非整倍性可以直接可见，如存在巨大的核、多核细胞以及大小变化很大的癌细胞核。关于非整倍体是致癌的一个驱动因素还是唯一驱动因素，人们争论已久[15但大多数科学家同意，在癌症发生和癌症进展作为一个进化过程的概念下，非整倍体代表了一种加速体细胞癌症进化的遗传不稳定形式。非整倍体的一个固有特征是癌细胞分裂过程中的一次错分离事件会导致数千个基因的复制或丢失，从而深刻地改变了祖细胞的遗传组成[15，16，17］．据推测，这种非整倍体的特征使癌细胞对环境变化的反应比获得点突变要快得多。必须指出的是，非整倍体并不是通过一次重排事件导致多个基因剂量变化的唯一机制。染色体或染色体部分的其他复杂结构重排也可达到同样的效果，如染色体偏色和染色体丛[5，18，19］．可以预期，非整倍体癌细胞不断改变其染色体组成，但非整倍体癌症的基因组在癌症进展的后期仍保持非常稳定[11］．非整倍体细胞的这种行为已在细胞培养中得到复制。可以证明，非整倍体癌细胞系的染色体组成本身并不稳定，但它可以在主要核型周围的许多传代中振荡[16］．

平行(趋同)体细胞进化在人类癌症中很常见

对不同癌症体细胞癌进化过程中亚克隆命运的分析可以证明，亚克隆可能通过独立的突变进化，但针对相同的基因、染色体区域或相同的分子途径[4，5，20.，21，22，23，24，25］．这种平行的和多谱系的体细胞癌进化已经通过趋同的表型肿瘤进化来解释[20.］．有人建议使用术语“平行进化”来描述这类具有单一单克隆起源的同靶点独立突变，并使用术语“趋同进化”来描述起源于独立癌症起始细胞的亚克隆中的平行突变获得[24］．平行肿瘤进化表明，在已经克隆扩增的细胞克隆上，对额外突变有很强的选择压力。几项研究表明，平行肿瘤进化以经典癌基因和肿瘤抑制基因为目标[4，22，23，24，25］．这表明，细胞自主和增殖潜能的选择压力在癌症进化的这一阶段起着重要作用。

体细胞癌进化的非线性可以解释为从外部选择压力到内部癌症基因组介导的选择压力的转变

假设癌症发生和癌症进展是一个进化过程，那么在一个癌症亚克隆谱系中，基因突变和结构突变的持续积累是可以预期的。在缺乏强选择的情况下，祖细胞中的突变负荷应根据突变率成比例地增加。由于癌细胞在有丝分裂过程中DNA复制的保真度以及染色体均匀分布的保真度会降低，与DNA修复、DNA复制和有丝分裂有关的基因损伤会增加，因此在癌症进展过程中，结构突变和基因突变的突变率都会增加[17］．因此，人们可以预期大多数基因突变和结构突变发生在癌症进展的后期。由于这一假设不能被验证，那么不存在或弱选择的前提一定是错误的。

在大多数癌症中，可以检测到存在于所有癌细胞中的特定突变，从而确定了癌症的单克隆起源。通常，这种突变是细胞类型特异性的，针对癌基因或使肿瘤抑制基因的两个副本失活，诱导增殖，从而导致初始克隆扩增。这种初始和积极的选择是由微环境和细胞的分化状态介导的，它们共同允许特定的突变导致细胞增殖。在大多数情况下，这种扩展的细胞克隆必须积累进一步的突变，导致序列或平行的亚克隆形成完全恶性转化。第二阶段的平行进化表明，选择确实在癌症进化中起着重要作用。

在达尔文进化中，亚无性系中的突变获得产生了亚无性系的异质性，然后通过对最适合的亚无性系的正向选择和对适应度较低或致命突变的无性系的负向选择来减少这种异质性。因此，可检测的遗传异质性和突变负荷都受到选择压力的影响。高度的遗传异质性、早期癌症中已经显著的突变负荷以及突变基因的选择表明，初始克隆扩增是由微环境的要求和遗传不稳定性的优势所积极选择的。在大多数人类癌症中，遗传不稳定以染色体不稳定的形式存在;少数癌症是通过核苷酸水平的遗传不稳定性进化而来的。基因不稳定性已经可以在早期癌症甚至癌症前兆中检测到。在晚期，两种形式的遗传不稳定可能同时出现在癌细胞或亚克隆中[4］．基因不稳定的早期表现可以通过观察到大多数癌症需要多次突变才能完全恶性转化来解释。只有具有降低遗传稳定性缺陷的亚克隆才能在生物体的短暂生命和癌前细胞有限的增殖潜力中获得必要的突变集。

染色体不稳定性的早期选择将导致结构畸变的早期获得，这赋予了适应度优势。当增殖接近海弗利克极限和端粒缩短阻碍有丝分裂过程中正常的染色体分布时，可能会发生额外的结构畸变。克服海弗利克极限可能导致端粒驱动的染色体不稳定，很可能代表了导致癌症基因组深度重排的另一个非线性事件。

由于基因不稳定的癌细胞不太可能通过提高基因和染色体修复机制在后期稳定其基因组，因此必须假设，随着基因中突变负荷的积累和染色体畸变的增加，癌细胞逐渐失去对额外突变获取的耐受性。额外突变的负选择足以解释在进化背景下，在癌症进展的后期观察到的癌症基因组的稳定。拉斯尼克在2002年假设存在一个最大的基因组紊乱点，它仍然维持着生命[26］．一个类似的假设指出，在体细胞癌进化过程中，基因组结构对谱系选择的限制性作用是通过减少功能基因组冗余来介导的，这是由于染色体不稳定导致遗传物质的显著损失和致残性突变导致基因的渐进式失活[27］．染色体不稳定基因组的计算机模拟进一步支持了由重排的癌症基因组介导的癌症进化的负面限制的假设[27，28］．最近一项关于甲基化模式的研究表明，表观基因组重编程而不是额外的突变可能是导致体细胞癌症进化后期癌症亚克隆表型异质性的原因[29］．对恶性黑色素瘤免疫治疗耐药机制的分析也表明，与特定基因突变不直接相关的基因表达变化可能会增强表型变异性[30.］．因此，表观基因组重编程可能构成一种替代或额外的机制，负责在癌症进展的后期明显稳定癌症基因组。

并不是所有的染色体重排都会导致消极的约束。基因加倍，特别是全基因组加倍导致四倍体似乎缓解了染色体不稳定性的负面限制[31］．在癌症进展的所有阶段都可以检测到基因组加倍。早期事件可诱导染色体不稳定，从而加速癌变，而晚期事件可通过增强对染色体不稳定和基因丢失的耐受性来增强癌细胞群的生存能力[31］．这一解释与基因组结构对谱系选择的限制性作用假设相一致，因为基因加倍增加了功能基因组的冗余。

数字1描述了早期癌发生和体细胞癌进化主要是由遗传不稳定背景下的正外部选择压力驱动的概念，这导致了遗传异质性，而由于癌症基因组的限制而导致的负选择在后期癌症进化中普遍存在，从而稳定了在亚克隆谱系中检测到的初始染色体重排。这一概念的演绎是，在癌症早期进化过程中分析不同的亚克隆，可以揭示哪些突变、基因和途径在癌症中被积极选择，而在癌症晚期进化过程中分析亚克隆，可以揭示哪些基因和途径对进展中的癌细胞的生存至关重要。

平行多系进化和非整倍体降低了驱动突变的检测阈值

在体细胞癌的早期进化过程中，不同亚克隆谱系中的致癌途径可能通过个体激活突变而独立靶向。在单克隆状态下，半合子活化突变可能足以进行克隆扩增。如果两个不同的突变在两个大小相似的亚克隆中针对相同的途径，每个突变可能只代表不到25%的检测到的DNA序列，因为所有癌症样本中都含有正常细胞的混合物。随着额外的亚克隆的形成，驱动突变可能进一步稀释，从而逃避检测。当只有一小部分亚克隆存在时，检测半合子或纯合子缺失的肿瘤抑制基因可能变得更加困难[25］．

空间和时间异质性的分析允许识别进化途径和假定的新治疗靶点

对原发肿瘤的多个区域进行遗传分析将减少亚克隆的混杂(如果存在的话)，从而提高检测驱动突变和检测基因缺失的敏感性(图。2)．它还将允许识别平行进化，从而识别癌症标本中积极选择的进化途径。个体患者中积极选择的进化途径的知识提供了双重信息:一方面，针对在已确定的癌症亚克隆中积极选择的激活或灭活的信号转导途径，也可能对同一患者尚未确定的癌症亚克隆有效。另一方面，识别具有激活或灭活信号转导通路强选择的平行进化可能表明，在同一通路的不同基因中存在不同的亚克隆突变，这降低了治疗靶向显性突变的临床疗效。

如果假设癌症基因组通过负选择在癌症进展的后期稳定，那么对一个转移的多个区域的遗传分析可能无法提供额外的信息。相比之下，分析一个患者的不同转移将允许区分个体亚克隆谱系，因为转移应该代表起源于一个谱系的单个细胞的单克隆增殖(图。2)．

通过对原发肿瘤及其转移灶取样，或通过分析治疗前后的转移灶，分析体细胞癌进展过程中的时间异质性，也可以区分个体亚克隆谱系(图2)。2)．此外，这种方法可能会识别癌症基因组中的变化，这些变化代表了对治疗诱导的选择压力的适应，并可能揭示在体细胞癌症进化过程中，尽管不断获得突变，但哪些突变、未突变的基因和途径被保守。在治疗过程中进化的突变和在进展过程中保守的基因和通路可能是除了已知的驱动突变之外的额外治疗靶点。

从分析癌症样本的遗传异质性中可以推断出的生物学信息的数量取决于应用的分子技术。用于分子分析的方法在其空间分辨率、能够传递的并行信息的数量以及对输入组织的要求方面有显著差异。因此，通过分析多个癌症标本或多个单细胞获得的生物学信息的增益也取决于所使用的技术(表1)．

比较基因组杂交(CGH)将检测由非整倍体或复杂结构重排引起的遗传内容的不平衡。由于CGH覆盖整个基因组，它能够提供多个染色体位点遗传物质存在、扩增或丢失的信息[32］．当分析一个患者的多个癌症样本时，这种并行信息可以区分亚克隆以及在癌症进展过程中识别保守的结构突变，但CGH无法区分非整倍体癌细胞中两个常染色体中的哪一个丢失或扩增。非整倍体癌细胞的平行进化可能涉及常染色体的独立丢失或扩增，这可能无法通过CGH解决[4］．因此，体细胞癌细胞进化过程中结构重排的确切性质和顺序可能很难仅通过CGH来确定。此外，检测到的损失或扩增必须跨越基因组的大区域才能被检测到，当输入DNA的数量低于阈值时，CGH可能会产生假阳性结果。

单核苷酸多态性(SNP)阵列和杂合性缺失(LOH)微卫星分析技术能够在多个遗传位点平行量化基因拷贝数改变，但也允许将等位基因分配到自体染色体。因此，与CGH相比，这两种技术都可以更敏感地检测并行进化，并更好地解决底层结构重排的问题。当分析多个遗传区域时，snp -阵列和LOH分析仍然需要大量的输入DNA。

结构重排的单细胞分析可以通过荧光原位杂交(FISH)实现，但这种技术只能提供有限数量的遗传位点的信息，这降低了其在多个亚克隆之间区分的能力。

通过Sanger测序检测基因突变对于识别致癌基因的驱动突变或肿瘤抑制基因的失活突变具有很高的敏感性。桑格测序可以在单细胞上进行，但输入DNA的数量随着分析基因的数量而增加。只有对原发肿瘤的多个区域或原发肿瘤及其转移进行分析，才能通过单个突变识别亚克隆。具有相同驱动突变集但具有不同染色体重排的亚克隆可能不能仅通过桑格测序加以区分。尽管总体突变负荷很高，但癌症仅包含少量驱动突变，与CGH或snp阵列相比，癌基因或肿瘤抑制基因的Sanger测序只能提供有限的遗传异质性信息，并且它不能提供结构重排信息，而结构重排是识别癌症进展过程中保守的结构突变或保守的必要基因所必需的。

由于每种技术都有其特定的局限性，人们提倡将不同的技术结合起来重建体细胞癌细胞的进化和检测遗传异质性，但这种方法进一步提高了输入DNA的数量，从而降低了其空间分辨率[27］．

下一代测序(next generation sequencing, NGS)在分析遗传异质性和结构重排方面取得了突破[1，2，5，6］．当NGS用于选定的基因时，可以使用非常少的输入DNA并行分析多个基因，即使在单细胞水平上也能解决遗传异质性。当NGS涉及全基因组测序时，提供了最重要的信息增益，因为这种方法进一步允许检测缺失、插入以及染色体断裂和融合。这些可用于检测复杂的染色体重排，以及重建体细胞癌进化过程中结构重排的系统发育[33，34］．因此，整个外显子组或全基因组测序应该能够识别体细胞癌症进化过程中的保守突变，保守的非突变基因和保守的通路，这可能是额外的治疗靶点。

癌症的突变也可以在患者的血清中检测到(=液体活检)，因为肿瘤以游离DNA的形式通过坏死或凋亡释放其DNA到血液中。虽然液体活检检测到的DNA应该是亚克隆的混合物，但在不同时间点以及治疗前后对游离细胞DNA的取样应该能够识别亚克隆以及赋予治疗耐药性的适应性突变[35］．

遗传异质性已被认为是对经典疗法和靶向疗法的原发性和继发性耐药的原因[36］．很难区分耐药细胞克隆是在治疗前就已经存在，还是在治疗诱导的选择压力下进化，因为耐药细胞克隆可能只代表整个肿瘤质量的一小部分，因此可能会逃避分子检测。一个重要的概念进展是，假设驱动突变的早期平行进化可能会对治疗产生原发性耐药性，并且早期平行进化更有可能发生在由只提供少量适应度增加的突变所积极选择的癌症中。相比之下，突变使适应度大幅增加，将癌细胞谱系置于适应度峰值，从而仅在治疗下促进线性进化和耐药亚克隆的选择[36］．BRAF突变黑素瘤的耐药机制已被广泛研究，可以证明从BRAF基因扩增到替代驱动基因突变的各种遗传机制可能介导BRAF抑制剂耐药[37］．在恶性黑色素瘤中也发现了对检查点抑制剂新型免疫疗法的耐药分子机制[30.］．然而，遗传异质性分析尚未进入临床常规，主要原因是缺乏特异性突变对肿瘤异质性影响临床结局的对照研究。

目前，传统的方法是在开始靶向治疗之前，通过Sanger测序或NGS筛选一个癌症样本的可药物突变，并在耐药情况下对复发的肿瘤样本重复遗传分析。在这种情况下，复发中检测到的de-novo突变是导致耐药的原因，可能代表额外的治疗靶点。一种可能在未来变得重要的方法是在靶向治疗或免疫治疗期间监测肿瘤蛋白向血清的释放，并在血清肿瘤标志物升高时作为液体活检对细胞游离DNA进行遗传分析，表明由于治疗耐药导致肿瘤增殖增强(图。3.)．这种方法是基于循环恶性肿瘤由于细胞凋亡或坏死导致显著死亡而不断向血清中丢失肿瘤蛋白和肿瘤DNA的假设。恶性肿瘤的细胞损失因子估计在50%至90%以上，使肿瘤蛋白或DNA向血清的释放成为体内癌细胞增殖的有效替代标记物[35，38］．在治疗期间通过液体活检反复进行遗传分析，不仅可以将遗传变化与出现的耐药性联系起来，而且还可以确定治疗癌症的亚克隆组成。

体细胞癌进化过程中突变获取的非线性以及癌症亚克隆的平行进化已在许多人类癌症中被描述，并被冠以不同的形容词。一些作者关注了非整倍体在癌发生中的主要作用;其他人强调了染色体结构重排的复杂性，而一些人则确定了癌症结构对体细胞进化的限制或允许作用。它们的共同点是，癌症基因组是由选择性压力形成的，并且在体细胞癌症进化的早期阶段就变得非常复杂。在早期癌症中发现的大多数结构和数字染色体畸变往往在后期持续存在，尽管遗传不稳定。不稳定的癌症基因组的明显稳定可以用负选择来解释。

阳性选择在癌发生的早期阶段很容易被识别，它通过识别癌基因和肿瘤抑制基因中有限数量的驱动突变来反映。对癌症驱动突变的识别导致了靶向疗法的发展，这大大增加了对抗这种致命疾病的装备。不幸的是，尽管使用了靶向治疗，许多患者仍然死于癌症。部分由平行进化引起的遗传异质性被认为是罪魁祸首之一。有人提出，负选择可能在癌症进展的后期发挥重要作用。在癌症中发现的绝大多数突变并不针对经典的致癌基因或肿瘤抑制基因。人们很容易认为，这些突变中的一些(如果不是大多数的话)并不是无害的，而是通过减少功能基因组冗余来调节癌症进展后期假定的负选择效应。这些突变或剩余的非突变途径可能代表额外的治疗靶点。挑战将是在旁观者突变的背景下识别它们。

癌症进化的主要范式是遗传不稳定性导致遗传异质性，导致表型多样化的癌症亚克隆池，选择可以在此基础上发挥作用。癌症进化过程中选择的识别已经并将继续导致治疗靶点的识别。阳性或阴性选择不能在临床标本中直接评估，但可以通过分析癌症进化过程中的遗传异质性来推断。因此，在恶性肿瘤的分析中纳入遗传异质性将大大提高癌症基因组分子分析的信息含量，并有助于确定患者特异性的治疗靶点。

全息:

比较基因组杂交

SNP:

单核苷酸多态性

门店:

下一代测序

LOH:

杂合度丧失

AR和AA构思并撰写了论文。两位作者都阅读并批准了最终的手稿。

确认

不适用。

相互竞争的利益

AR拥有美国专利申请US20150072865 A1。AA声明没有竞争利益。

数据和材料的可用性

不适用。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

如图所示。3.由亚琛工业大学当地伦理委员会批准的一项正在进行的非介入性生物标志物研究(EK 153/12)获得。

资金

这项审查还没有得到资助。

出版商的注意

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作者及隶属关系

1. 亚琛工业大学附属医院皮肤病科，eurego皮肤癌中心，德国亚琛

   艾伯特Rubben

2. 美国佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所综合数学肿瘤科

   阿图罗·阿

相应的作者

对应到艾伯特Rubben．

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