偏头痛患者外周血单个核细胞中疾病和头痛特异性microRNA特征及其预测的mRNA靶点:炎症信号和氧化应激的作用

背景

偏头痛是一种具有遗传易感性的原发性头痛，但其病理生理机制尚不清楚，仍然是一种未被满足的医疗需求。早些时候，我们证实了偏头痛患者外周血单个核细胞(pmcs)转录组的显著差异，这表明神经炎症和线粒体功能障碍的作用。转录后基因表达由miRNA (microRNA)调控，microRNA是一组短的非编码rna，是新兴的生物标志物、药物靶标或药物。MiRNAs是新兴的生物标志物和治疗手段;然而，我们对偏头痛中的miRNA转录组知之甚少，迄今为止还没有对偏头痛患者进行系统的比较分析。

方法

与年龄和性别匹配的健康志愿者相比，我们测定了偏头痛患者发作期和发作间隙头痛期间PBMC的miRNA表达。小RNA测序从PBMC进行，miRNAtarget.com™使用网络理论方法预测miRNAs的mRNA靶点。通过基因本体富集分析研究预测的miRNA靶标，并通过比较网络指标与差异表达的mRNA数据进行验证。

结果

在间歇期PBMC样本中，与健康对照组相比，31个miRNAs差异表达(DE)，包括hsa-miR-5189-3p, hsa-miR-96-5p, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-99a-3p, hsa-miR-542-3p。在头痛发作期间，与自我控制样本相比，在间歇期的顶级DE miRNAs是hsa-miR-3202、hsa-miR-7855-5p、hsa-miR-6770-3p、hsa-miR-1538和hsa-miR-409-5p。MiRNA-mRNA靶点预测和通路分析表明，有几种mRNA与免疫和炎症反应(toll样受体和细胞因子受体信号转导)、神经炎症和氧化应激相关，mRNA转录组学也证实了这一点。

结论

我们在这里提供了偏头痛患者PBMC中疾病和头痛特异性miRNA签名的第一个证据，这可能有助于确定预防和攻击治疗的新靶点。

偏头痛是一种常见的原发性头痛疾病，其病理生理机制复杂。这种神经血管紊乱包括脑膜血管扩张、水肿形成、三叉神经疼痛通路的激活和致敏[1］．免疫激活和促炎细胞因子和神经肽的释放，如CGRP(降钙素基因相关肽)和PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活多肽)，似乎是关键因素[2，3.，4，5，6］．除了遗传因素外，环境也对偏头痛易感性有影响[7］．尽管进行了广泛的努力，但在偏头痛的有效个性化预防或急性治疗方面尚未取得突破。由于该病的异质性，它仍然是一种未得到满足的医疗需求。因此，用无偏组学的方法来探讨其病理生理机制的复杂性是十分必要的。含有淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)和单核细胞的PBMCs，由于微创取样和相对简单的分离，在临床实践中已成为有吸引力的血液标志物候选。它们的潜在价值在于反映各种疾病中中枢神经系统的病理生理变化。因此，可以使用pbmc以特定的方式研究神经炎症过程[8，9，10］．我们最近利用外周血单个核细胞(PBMC)的转录组学提供了偏头痛中免疫细胞活性增加、氧化应激和线粒体功能障碍的证据[11］．MicroRNAs (miRNAs)是短的非编码rna，调节转录后基因表达，从而控制细胞间通信和多个细胞过程。［12，13，14］．由于miRNAs可以反映环境对基因表达调控的影响[15]，它们在临床前研究和临床应用中的相关性正在迅速增长。循环miRNAs是稳定的、易于测量的组织特异性分子[13，16];因此，它们作为各种病理过程的组织特异性生物标志物、耐药调节剂和新型药物靶点受到越来越多的关注。一些临床研究表明，特定的miRNAs是疾病进展的指标，如糖尿病、冠心病、乳腺癌、癫痫、抑郁症、中风等。[16］．有趣的是，miRNAs可以干扰免疫、血管和神经元活动[17，18，19］．因此，它们可能在神经-免疫-血管相互作用和改变中有价值，如神经性疼痛、阿尔茨海默病和帕金森病、多发性硬化症和偏头痛[20.］．它们与慢性疼痛的相关性，如复杂区域疼痛综合征、肠易激综合征和纤维肌痛，也已被研究[21，22］．

由于miRNA的细胞含量低，体积小，且miRNA家族序列相似，因此在分子研究和诊断中检测miRNA是基本的，也是具有挑战性的。不断的发展已经产生了从传统技术如微阵列和PCR(聚合酶链式反应)到最近的下一代测序的检测方法。MicroRNA微阵列是一种miRNA分析技术，利用目标miRNA和它们在固体表面上的相应互补探针之间的杂交，并最终检测杂交探针的信号强度。它具有高通量，但灵敏度和选择性较低。另一方面，PCR对mirna的灵敏度高，范围广，但特异性差，而且通量有限。RNA-seq代表了最后一种广泛的miRNA分析方法。其工作流程包括RNA的分离，然后是cDNA(互补DNA)文库的构建和测序。选择Small RNA-Seq进行我们的研究是基于其具有非靶向性和高度敏感性的主要优势[23，24］．

mirna在偏头痛诊断和治疗中的潜在作用最近已被综述，但结果的临床相关性需要澄清和确认[25，26］．很少有针对特定miRNAs的研究[16，17，18，19]和基于微阵列的miRNA轮廓描述，结果存在争议[27，28，29］．一项研究使用高含量血清microRNA PCR阵列描述了偏头痛患者发作期和无痛期的血清miRNA变化[27］．相反，在一项会议摘要中，与5个无头痛对照组相比，20名混合性别偏头痛患者PBMC样本的miRNA谱没有变化。29］．这项初步研究的扩展(MicroMIG)在将不同的偏头痛患者亚组与对照组进行比较时，证明了一些DE mirna，但它们没有被指定[30.］．对15例无先兆的女性偏头痛患者与13例健康对照的血液样本中分离出的外泌体进行双样本芯片分析，发现22种循环miRNAs异常，其中4种通过qPCR验证。MiR-22和let-7b在PBMC样本中被证实下调[28］．PBMCs是一种容易获得的生物材料，可以反映大脑的病理生理变化并表征神经炎症过程[8，9］．因此，我们在这里从PBMC样本中测定mirna，以收集更多关于偏头痛患者疾病和头痛相关机制的信息，因为它们的转录组改变被证明是偏头痛相关过程的特异性和敏感指标[11］．据我们所知，这是第一个对偏头痛患者发作间期和发作期样本中分离的pbmc进行小RNA测序的研究，与健康对照组进行比较。结合网络理论mirna靶点预测和已经分析的mRNA数据集，为发现偏头痛潜在的新型生物标志物和/或药物靶点提供了一个独特而有价值的平台。

研究设计

这项研究得到了人力资源部国家公共卫生中心的批准(28324-5/2019 /EÜIG)。在《赫尔辛基宣言》之后，获得了每位与会者的知情书面同意。

16例发作性偏头痛患者(n= 1)或无气场(n= 15)和12名健康对照组，年龄在23至59岁之间。在16名偏头痛患者中，有8名患者在头痛发作期间申请了抽血(1名患者申请了两次)。因此，进一步研究了9个ictal(自我对照配对)样本。从2018年9月至2019年12月收集的队列中，共选取了28名参与者的37个样本。纳入标准为女性，年龄20-60岁，根据《国际头痛疾病分类》第三版诊断为有或无先兆偏头痛[31］．排除标准为慢性炎症疾病和抑郁症。一份详细的调查问卷用于评估头痛的以下特征:采样前预防性或发作性药物、前一个月发作次数、最后一次发作时间、当前发作开始时间、其他已知疾病、应用药物和避孕药具、偏头痛发作与月经周期的关系、是否存在异位性疼痛、发作频率、持续时间、发作时疼痛严重程度(用视觉模拟量表测量)、与其他慢性疾病的共病、偏头痛的家族表现、如前所述，记录定期的体育活动和最后一餐的时间[11］．此外，患者采用汉密尔顿抑郁量表进行检查，以排除有抑郁症评估的参与者。对食物和饮料的摄入量没有限制。研究人员分别从偏头痛患者无发作期和发作期采集了血液样本。健康对照组筛查未报告/未治疗的头痛，并匹配所有人口统计学特征。

样品收集

采集受试者血液样本，1小时内开始处理。使用含有抗凝血剂EDTA(乙二胺四乙酸)的试管采集样本。如前所述，根据制造商说明，使用Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare, Budapest, Hungary)隔离pbmc [11］．去除液相后，细胞用1ml TRI试剂(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)重悬，并在-80°C保存，直到进一步研究。

RNA提取及质量控制

采用基于苯酚-氯仿的TRI试剂程序(美国俄亥俄州辛辛那提分子研究中心)提取总RNA，然后使用Direct-zol RNA MiniPrep试剂盒(zyymo Research, Irvine, CA, USA)提取纯化。如前所述，遵循制造商的方案，包括可选的柱上DNase消化[11，32］．RNA浓度用Qubit 3.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)测量，质量用RNA ScreenTape (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)在TapeStation 4200上检查。高质量(RIN > 8) RNA样本进一步用于文库制备。

小RNA文库制备及测序

使用SmallRNA-Seq文库准备试剂盒(Lexogen, Vienna, Austria)生成小RNA文库。简单地说，使用200 ng总RNA作为输入，连接3 '和5 '接头，然后进行柱纯化。随后，对结扎产物进行逆转录，并将输入RNA(两侧有5 '和3 '适配器)转化为cDNA。最后，利用16个PCR循环对文库进行扩增和条形码。在TapeStation 4200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上对所有文库进行评估，以检查在PCR过程中是否形成了适配器二聚体。这些文库在Illumina NextSeq550平台上测序，产生75 bp的单端reads。本研究所生成的所有RNA-Seq数据集将在欧洲核苷酸档案(https://www.ebi.ac.uk/ena)，注册编号为PRJEB46142。共有37份血样用于PBMC小RNA测序。

生物信息学- miRNA- seq, miRNA靶点预测，miRNA- mrna靶点网络分析

测序读数与智人参考基因组(GRCh37 Ensembl release)与STAR v2.5.3a [33］．对齐后，将reads与已知的蛋白质编码基因相关联，使用Rsubread包v2.0.0计算每个基因中对齐的reads数量[34］．基因计数数据采用edgeR R/Bioconductor包(v3.28, R v3.6.0, Bioconductor v3.9)的TMM (M值修剪平均值)归一化方法[35］．使用voom方法对数据进行进一步的日志转换[36]在limma包中[37]进行统计测试。标准化计数表示为TPM(每百万的转录数)值。由线性建模过程得出的比较组间的FC(折叠变化)值和修正的t检验p值由limma包产生。采用Benjamini-Hochberg方法控制FDR (False Discovery Rate)，通过limma计算调整后的p值。在配对发作期和间歇期样本的情况下，来自同一患者的样本之间的相关性被考虑使用duplicateCorrelationlimma的功能。

在每个比较(|FC|> 1.2和p< 0.05)， DIANA-miRPath v3.0 web工具[38]进行GO(基因本体论)和KEGG(京都基因与基因组百科全书)富集分析(p< 0.01)使用microTCDS预测的DE miRNA列表的目标，与2021年11月12日访问的默认设置进行每次比较。BP(生物过程)本体GO结果使用Revigo进一步筛选冗余项[39]，默认设置在2021年11月14日访问。为了突出特定的术语，我们考虑了频率值小于0.15的GO BP术语，其中频率定义为所选GO术语在欧洲生物信息研究所人类基因本体注释数据库中注释的基因产物的比例。频率值越高，术语越一般，频率值越低，术语越具体。

网络理论miRNAtarget.com™软件(mirnatarget.com；使用Pharmahungary, Szeged, Hungary)根据DE miRNAs列表预测靶基因及其预期表达变化。对于本分析，与之前的工作类似[18，19，40，41，42，43]，数据来自人工策划、实验验证的miRTarBase [44] (v7.0)，预测miRDB [45] (v5.0评分> 80.0)和microRNA.org [46](2010年8月发布，mirSVR评分< -1.2)，mirna -靶标相互作用数据库由miRNAtarget集成。将网络中预测的与上调和下调mirna相互作用的正边权值(1，-1)和负边权值(1，-1)相加，计算节点强度值，估算预测靶标表达变化的程度。为了实现我们网络信息内容的充分可视化表示，我们使用了EntOptLayout插件[47](2.1版)，用于细胞景观[48](3.7.2版本)软件，并通过图形化突出显示节点强度值进一步改进了可视化。为了阐明预测的靶基因在生物过程中的作用，氧化石墨烯富集分析[49，50]，分别对上调和下调的目标进行比较。在线PANTHER过度表现测试([51，版本于7月28日发布^th， 2020)与默认设置一起使用(费雪精确测试与FDR计算)。来自GO本体数据库([52，版本于10月9日发布^th, 2020)智人使用“GO生物过程完整”注释数据集进行分析。

基于RNA测序数据的mRNA水平预测的验证

为了在mRNA水平上验证基于小RNA测序的mirna靶标预测，我们使用了之前研究中的mRNA- seq数据[11］．我们在本研究中纳入了上述同一队列的样本，并进行了最小程度的改变，以确保患者群体更加同质。我们通过将本研究中预测的mRNA与我们之前研究中引用的差异表达mRNA相匹配，在mRNA水平上验证了硅内预测的mirna -靶标相互作用。我们将预测的节点强度值与FC值的mRNA二进制对数相对于变化方向进行比较。我们认为那些表达变化与预测一致的基因是被验证的。

统计分析

研究人群的人口学和临床特征见表1．数值数据以其算术平均值和95%置信区间进行汇总。用夏皮罗-威尔克试验和目视检查连续参数是否正常。使用Levene检验研究了组间方差的同质性。如果这两个检验得出的p值小于0.05的显著性水平，则响应变量采用非参数检验。使用非参数Kruskal-Wallis秩和检验或方差分析(ANOVA)检验每个参数的平均值及其在研究人群(偏头痛患者和健康人群)中的分布之间的差异，如果适用，随后进行Benjamini-Hochberg多重检验校正。为了比较偏头痛组及其发作间期和发作期的参数，使用配对样本Wilcoxon检验(或配对t检验，如果适用)。所有双侧检验均设置为0.05为统计学显著性水平。数据采用R版本4.0.2进行分析。

患者群体的临床特征

表中列出了总共28名参与者的患者的人口学特征和主要临床特征1．间歇期组由16名偏头痛患者组成，在无头痛期间进行抽血。取其中8例患者的Ictal样本进行自制比较。12个对照样本由健康志愿者组成。各子组的人口统计学特征相似。在比较不同亚组的人口统计学和临床特征(如年龄、发作频率、疼痛严重程度等)时，未发现明显变化。发作间期组和发作间期组之间的唯一显著差异是前一个月的发作次数和采样前最后一次发作的日期(表1)．

PBMC样本的microRNA特征

当将间歇期PBMC样本与健康样本进行比较时，31个mirna为DE，当对折叠变化阈值1.2和p值阈值0.05进行显著性检验时。14个mirna上调，17个mirna下调。根据fold change和p-value rank(平均rank)的平均值，hsa-miR-5189-3p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-542-3p位于DE miRNA列表的顶部(表5)2；详情见表S1)．

在发作期与间歇期比较中，25个mirna为DE(对fold change 1.2和p-value: 0.05进行显著性检验)，15个mirna上调，10个mirna下调。排名前5位的mirna依次为:hsa-miR-3202、hsa-miR-7855-5p、hsa-miR-6770-3p、hsa-miR-1538、hsa-miR-409-5p(表2 -1)3.；详情见表S2)．

与健康组相比，在ictal样本中，31个miRNAs是DE(倍数变化:1.2，p-value: 0.05)， 22个表达上调，9个表达下调，hsa-miR-1277-5p表达最高(表S3.)．

DE mirna在热图上可见(图2)。1而且2)，并根据相关性对样本进行聚类。他们被划分为主要的组，大部分与原始患者组重叠。发作期与健康相互作用的DE mirna在图S的热图上表示1．

对DE mirna进行功能富集分析(DE list enrichment)。进行GO和KEGG分析，将信息与生物系统的功能和效用联系起来(表4而且5)．与健康样本相比，间歇期样本显示与几种GO类别(途径和过程)有关，包括几种toll样受体信号通路、血小板脱颗粒、细胞对胰高血糖素刺激的反应和α -亚麻酸代谢过程。

在发作期PBMC样本中，与间歇期组相比，凋亡信号通路中的几种toll样受体信号通路和蛋白插入线粒体膜的正向调控发生了改变。有趣的是，视紫红质介导的信号通路和光转导的调节受到显著影响。

KEGG通路作图揭示了ECM(细胞外基质)-受体相互作用和gaba能突触的参与，表征了与对照样品相比的间歇期样品。tgf - β)转化生长因子β和ErbB(表皮生长因子受体)信号通路在发作期与健康期以及发作期与间歇期比较中出现。

在间歇期与健康期比较中，具有最高绝对节点强度值的预测目标

在将interictal与健康对照样品进行比较时，预测了31个DE mirna的7012个mRNA靶点。具有最高绝对节点强度值的预测目标列在表中6．预测靶点与DE mrna在S4的交叉。与对照组相比，CADM2(细胞粘附分子2)、PLEKHM3(含pleckstrin同源结构域M3)、MEF2C(肌细胞增强因子2C)、BBX(含BBX高迁移率基盒结构域)、核糖体修饰蛋白RIMKLB(含rimK样家族成员B)和HACE1(含E3泛素蛋白连接酶1的HECT结构域和锚蛋白重复序列)等靶点明显下调。相比之下，CCN T2(周期蛋白T2)和KLHL15 (kelch样家族成员15)在间歇期组显示显著上调(表25)．DE miRNAs及其预测的相互作用如图所示。3.．

在发作期与间歇期比较中，具有最高绝对节点强度值的预测靶点

在发作期PBMC样本中，与发作间期亚组相比，预测有5665个mrna被25个显著的DE miRNAs调控。在结点绝对强度值最高的靶标中，NR3C1(核受体亚家族3C组成员1)出现强度值为7,GRIA2(谷氨酸离子受体AMPA型亚基2)和MLLT3 (MLLT3超伸长复合体亚基)出现强度值为6。在发病-间期比较中检测到32个节点强度为-2的上调靶点，如FN1 (Fibronectin 1)和CBX5 (Chromobox 5)6；预测靶点与DE mrna在S5中的交叉)。DE miRNAs及其预测的相互作用如图所示。4．

此外，在ictal与健康比较中6781个预测靶点31个DE miRNAs数据与DE mrna的交叉列于表S6．在发作期与健康期相互作用中，DE miRNAs及其预测相互作用的可视化可以在图S中找到2．

预测mrna的基因本体富集分析

为了探索偏头痛在无头痛(间歇期)和头痛(发作期)期间所改变的生物学过程，对所有预测的mrna进行了氧化石墨烯富集分析。GO富集分析结果显示，与健康样本相比，间隔期组DE mirna靶向mrna与几种代谢调控过程和血小板激活负调控显著相关。此外，核转录的mRNA分解代谢过程、神经元发育和神经元分化的调节似乎受到偏头痛的影响(表2)7)．

基于mRNA测序数据验证预测的mRNA靶向miRNAs

与健康样本相比，在间断期PBMC样本中，在7012个预测靶点中，也可以在DE mRNA数据中找到54个。在这一比较中，31个靶点显示了预测方向的表达变化，如TNF(肿瘤坏死因子)，SOCS3(细胞因子信号传导抑制因子3)，许多趋化因子如IL6(白细胞介素-6)和SOD2(超氧化物歧化酶2)，在氧化磷酸化中起作用(表2)8)．在5665个预测靶点中，有26个也可以在脉间期分析的DE mRNA数据中找到。在本次沉降中，有12个靶标出现了预测方向的表达变化，如RAB3B。(ras相关蛋白rabb - 3b)， LRRTM2(富亮氨酸重复跨膜神经元2)(表9)．

目前从一项自我对照研究设计中获得的结果为偏头痛患者PBMC中的疾病和头痛特异性miRNA模式提供了第一个证据。我们的发现可以帮助识别病理生理途径的关键因素，确定潜在的新型诊断和预后生物标志物和药物靶点。小非编码rna的发现[25]，再加上使用公营管理公司，为这方面提供了新的机会[10］．

在间歇期PBMC样本中，与健康对照组相比，31个mirna是DE的，包括hsa-miR-5189-3p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-542-3p。hsa-miR-5189-3p与脊髓损伤密切相关，是一组转录本的一部分，被提议在疾病分类中发挥作用[85］．miR-96及其miR-183家族已被观察到在啮齿动物不同慢性疼痛条件下的体感痛觉通路的不同区域受到调控[86］．miR-183在感觉器官中明显富集。它可能通过协调调节多个不同的痛觉感受基因来影响与慢性疼痛状况的发展和维持相关的神经元变化[87］．意外后严重轴痛患者循环hsa-miR-3613-5p升高[88]而子宫内膜异位症的发病率则降低[89，90］．血清hsa-miR-542-3p被发现是诊断子宫内膜异位症的miRNA特征的一部分[91］．烧伤口综合征患者唾液外泌体miRNAs中hsa-miR-99a-3p下调[92］．

我们的结果显示，与健康对照组相比，偏头痛患者发作间期和发作期样本中gaba能突触的变化。偏头痛病理生理学中gaba能信号的异常已在文献中得到广泛研究[93］．血清miRNA结果也表明靶向GABA系统可能具有治疗意义[27］．有趣的是，但并不令人惊讶的是，视紫红质介导的信号通路和光转导参与了攻击特异性改变(脉间期比较)。恐光症是一种由光引起的现象，与偏头痛和剧烈头痛有关[94］．虽然偏头痛研究主要集中在受影响的黑视素相关途径上[95]，很明显，这些患者存在异常的光处理。然而，这些变化在外周血样本中的反映可能是进一步研究中一个令人兴奋的问题。

与我们的PBMC结果相似，在偏头痛患者发作期和间歇期的血清样本中，与内皮功能相关的miR-155和let-7 g水平的差异表达[96］．let-7家族的另一个成员let-7b在偏头痛患者的PBMC样本中被发现下调[28］．

与自我控制间歇期样本相比，头痛发作期间的顶级DE miRNAs如下:hsa-miR-3202, hsa-miR-7855-5p, hsa-miR-6770-3p, hsa-miR-1538, hsa-miR-409-5p。在外泌体miRNAs中，hsa-miR-3202在轻度创伤性脑疾病中表达异常[97]， hsa-miR-409-5p为复杂区域疼痛综合征的DE [98］．最新的在挫伤性脊髓损伤后下调，而其过表达可促进恢复[91］．已知hsa-miR-7855-5p对缺氧敏感[99]，提示与氧化应激有关，hsa-miR-1538修饰细胞对氧化应激的反应[One hundred.］．hsa-miR-6770-3p作为潜在的生物标志物在慢性牙周炎中降低[92］

在这两个比较中，具有最高绝对节点强度值的顶级预测靶点列表由一些与偏头痛病理生理机制相关的mrna组成。GRIA2和NR3C1分别参与谷氨酸和糖皮质激素信号传递，在我们的数据集中似乎是特定于头痛阶段的。我们的结果得到了三叉血管激活和中枢敏化中谷氨酸能神经传递变化的证明的支持[101，102］．然而，一项病例对照研究并未发现偏头痛与GRIA2多态性之间的关联[103］．NR3C1基因的DNA甲基化是表观遗传学文献的焦点[104，105］．GWAS研究将转录因子MEF2(在我们的研究中被下调)与神经炎症过程联系起来[106]、癫痫[107]、心理及代谢特征[108，109］．

信号通路分析表明TLR (toll样受体)信号通路参与无头痛状态和头痛。TLRs是跨膜受体，在先天免疫反应和炎症反应中起着至关重要的作用，它激活NF-κB和干扰素调节因子，导致促炎细胞因子如TNFα， IL1, IL6和IL12的产生。偏头痛中白细胞介素和TNFα水平的改变已在文献中得到证实[110，111，112］．我们的miRNA靶点预测结果与这些数据一致。IL-6和TNFα通过与我们之前论文中所演示的mRNA水平进行比较而得到验证[11］．尽管有人提出TLR4信号通路参与了小鼠偏头痛样行为的启动和维持以及大鼠痛觉过敏的诱导[113，114，115，116，117]，这是第一个将TLR通路专门与偏头痛联系起来的研究。此外，有证据表明TLR-4/miRNA之间存在强烈的相互作用，这可能是现代免疫治疗的一个可能靶点[118］．

在描述无发作期偏头痛疾病的有效靶点中，EGR1(早期生长反应基因1)被征调，它可以调节突触可塑性的多个方面[119] [120］．一些经过验证的靶点可以作为免疫系统和炎症途径的调节者和参与者，如NFKBIA (NFKB抑制剂α)和IER3(早期反应3)[121，122］．TNFAIP6 (TNF α诱导蛋白6)可能是具有抗炎特性的潜在miRNA靶点[59］．NR4A2 (Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 2)通过调控多种信号，抑制促炎介质的表达，发挥神经保护作用[63］．EGR3(早期生长反应3)对于控制炎症和抗原诱导的免疫细胞增殖至关重要[123];它抑制SOCS1, SOCS3(细胞因子信号-1和3)，调节细胞因子或激素信号。由SAT1(亚精胺/精胺n1 -乙酰转移酶1)基因编码的酶催化亚精胺和精胺的乙酰化，从而介导多胺代谢。该数据强调了我们之前的发现[11]，我们描述了偏头痛患者血浆样本中精蛋白和亚精胺代谢物的变化。氧化应激和线粒体功能障碍在偏头痛易感性和头痛产生中的作用也在我们最近的工作中得到了证明[11］．Sgk(血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶)[124]和超氧化物歧化酶[125]与对照组相比，间歇期样本中增加了，强调了这些途径的重要性。此外，发作期与间歇期比较发现跨膜信号酶NOX5 (NADPH氧化酶5)下调[119］．

我们在这里提供了偏头痛患者在无头痛期和发作期间与健康对照组相比的第一个miRNA谱，提示潜在的疾病和疼痛特异性病理生理机制。转录组学分析证实并验证了预测的差异表达miRNAs的mRNA靶点，揭示了炎症和免疫机制、细胞因子和趋化因子信号通路以及氧化应激的参与。

作为本研究的一部分，所有RNA-Seq数据集将在欧洲核苷酸档案(https://www.ebi.ac.uk/ena)，注册编号为PRJEB46142。

方差分析:

方差分析

BMI身体:

质量指数

CGRP怎样:

降钙素基因相关肽

德:

差异表达

EDTA:

乙二胺四乙酸

舰队指挥官:

褶皱变化

罗斯福:

错误发现率

走:

基因本体论

GWAS:

全基因组关联研究

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

PACAP:

垂体腺苷酸环化酶激活多肽

PBMC:

外周血单个核细胞

肿瘤坏死因子:

肿瘤坏死因子

血管:

视觉模拟量表

不适用

由Pécs大学提供的开放获取资金。本研究得到国家脑科学计划2017-1.2.1-NKP-2017-00002 (NAP-2;慢性疼痛研究小组)，Gazdaságfejlesztési és Innovációs Operatív计划(经济发展和创新运作计划)(GINOP) -2.3.2-15-2016-00050(健康和疾病中的肽能信号;PEPSYS)， GINOP 2.3.2-15-2016-0034, Emberi Erőforrás Operatív计划(人力资源操作计划)3.6.2-16-2017-00008 (2017-2019)，EFOP-3.6.1 -16 -2016 - 00004, TUDFO/ 47138-1/2019-ITM和匈牙利国家研究发展和创新办公室(NKFIA)资助OTKA FK132587, OTKA- 13825 - k和NVKP-16-1-2016-0017国家心脏计划。这项研究也得到了匈牙利创新和技术部的主题卓越计划(2020 - 4.1.1 - tkp2020)的资助，在塞梅尔维斯大学的治疗开发和生物成像主题计划的框架内。A.G.和J.K.得到了赠款GINOP-2.3.4-15-2020-00010、GINOP-2.3.1-20-2020-00001和教育未来专家:培养欧洲生物医学学生的生物信息学和生物统计学能力(BECOMING, 2019-1-HU01-KA203-061251)的支持。文学士学位由国家研发创新基金(ÚNKP-20-4-I-SE-7， ÚNKP-21-4-II-SE-18)资助，由创新技术部国家新卓越计划资助。生物信息学基础设施由ELIXIR匈牙利(http://elixir-hungary.org/)．

作者指出

1. Timea Aczél, Bettina Benczik, József Kun和Zsuzsanna Helyes对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 匈牙利Pécs大学神经科学中心分子药理学研究组，医学院药理学与药物治疗系，Szentágothai研究中心，Pécs

   tima Aczél, Kata Bölcskei, József Kun & Zsuzsanna Helyes

2. 心脏代谢和MTA-SE系统药理学研究小组，塞梅尔维斯大学药理学和药物治疗系，布达佩斯，匈牙利

   Bettina Benczik, Bence Ágg & Péter费迪南迪

3. Pharmahungary集团，塞格德，匈牙利

   Bettina Benczik, Bence Ágg & Péter费迪南迪

4. MTA-SZTE神经科学研究小组，塞格德大学，匈牙利

   Tamás Körtési，伯纳德特·图卡和László Vécsei

5. 塞格德大学健康科学和社会研究学院，匈牙利塞格德

   Tamás Körtési &伯纳德特·图卡

6. Szentágothai研究中心，生物信息学研究组，基因组学和生物信息学核心设施，Pécs大学，Pécs，匈牙利

   Péter Urbán, Witold Bauer, Attila Gyenesei & József Kun

7. 阿尔伯特医学院神经内科Szent-Györgyi匈牙利塞格德大学临床中心

   János Tajti & László Vécsei

8. PharmInVivo有限公司，Pécs，匈牙利

   Zsuzsanna Helyes

9. 匈牙利Pécs大学医学院药理学和药物治疗系，斯齐盖蒂út 12, 7624, Pécs

   Zsuzsanna Helyes

贡献

范本:Z.H K.B。,j.k., A.G, L.V, j.t.,功率因数正式分析:j.k.文学士学位反方向,焊接连接的阀盖,A.G.调查:“逼进墙角,学士，T.K., J.K., B.T., U.P. Resources: L.V, J.T., A.G., K.B., Z.H. Writing – Original Draft Preparation: A.T., B.B., Á.B., J.K., U.P., W.B., K.B., Z.H. Writing – Review and Editing: A.T., T.K., J.K., P.U., W.B., A.G., B.T., J.T., P.F., L.V., P.F., K.B., Z.H. Visualization: A.T., B.B., Á.B., J.K. Supervision: Z.H., K.B., A.G, P.F., L.V., J.T. Funding Acquisition: Z.H., K.B., A.G., P.F., L.V., J.T. The author(s) read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到Zsuzsanna Helyes．

伦理批准并同意参与

这项研究得到了全国公众的认可。

匈牙利人力资源部卫生中心(28324-5/2019 /EÜIG)。所有的研究。

参与者根据《赫尔辛基宣言》提交了书面知情同意书。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者没有披露任何利益冲突。

出版商的注意

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