从富含蛋白质的废弃生物质中有效分离角蛋白:减少对环境的影响并使废弃生物质稳定的实用方法

在各种含蛋白质的生物质废物中，废弃的动物羊毛、家禽羽毛和人的头发被认为是角蛋白最重要的可再生来源之一。动物羊毛和人的头发被用来生产几种产品。然而，大量不适合纺丝和无法使用的短纤维被丢弃为废物，导致严重的环境问题，因为它们在水体中积聚，导致水道阻塞和其他相关问题。同样，家禽废物，特别是废鸡毛(WCF)在某些应用中被倾倒或焚烧或用作低价值肥料。本研究的目的是开发一种从各种废弃物中提取可回收角蛋白的高效方法，并在提取过程中有效利用废溶剂。在此研究了季铵盐水溶液四甲基氢氧化铵(TMAOH, 25% w/w在水中)溶解这些蛋白质废物并从中提取角蛋白的适用性。该溶剂可溶解39 ~ 44% w/w的废动物毛(WAW)、19 ~ 25%的废人毛(WHH)和55 ~ 60%的WCF。从WAW、WHH和WCF中分别分离出约19 ~ 20%、35 ~ 37%和69 ~ 74%的粗角蛋白。由此分离得到的角蛋白的化学性质和结构稳定性得到了证实。回收的TMAOH、不溶性WAW和WCF对土壤微生物无毒。 The recovered TMAOH thus generated after isolation of keratin was used for green gram (豇豆属辐射动物)种子处理后，植株高度(4-12%)和重量(9-58%)显著增加。将生物质废物作为高价值化合物的来源处理可以通过减少废物负荷来最大限度地减少对环境的影响。

由于在材料化学和工程的各种应用中使用生物基原料的需求不断增加，对这些材料资源的需求正受到各种研究人员的重新关注。为了满足任何制备材料的经济性和可持续性，起始材料的低成本采购是至关重要的。角蛋白就是其中一种蛋白质，是哺乳动物、爬行动物和鸟类中含量最多的蛋白质，也是毛发、羽毛、指甲和角的主要成分，很容易从生物量中提取[1，2，3.，4］．它的生物降解性、生物相容性、高极性、高化学反应性和与细胞的亲和性使其具有各种应用的吸引力[5，6］．角蛋白的应用领域包括组织工程、生物医学应用、纺织工业等。[7，8，9，10，11］．以角蛋白为基底的多种功能材料已被设计出来，如薄膜、纤维、涂层和复合膜[12，13，14，15］．角蛋白很容易获得，但从生物质中提取角蛋白具有挑战性，因为多肽链之间存在强烈的氢键和二硫键，很难分离蛋白质α-螺旋和β-薄片[3.，4，16，17］．虽然一些传统的方法，如还原、再氧化、酸碱、酶促和亚砜解被用于从各种生物质资源中提取和溶解角蛋白[18，19，20.，21]，毒性与几种溶剂和化学物质有关[22]造成环境和健康问题[16］．目前报道的角蛋白提取的一种改进方法是以l -半胱氨酸为还原剂提取羊毛角蛋白[23］．

为使农业实践具有可持续性，现正进行多项改革，包括使用更优质的种子、采用改良的种子收割和播种技术等，以提高生产力，以满足世界人口不断增长的粮食需求[24，25，26］．种子处理被认为是农业中最重要的操作之一，可确保提高作物产量、质量和生产力[27］．然而，越来越多的人使用农药进行种子处理，这造成了令人担忧的情况，即种子中存在农药残留，有害分子进一步运输到水果和花卉，影响人类健康。因此，在这一领域经常寻求和研究替代种子处理方案。

季铵电解质(qae)正成为一种非常好的溶解生物聚合物(如纤维素和某些农业废物)的溶剂体系[28，29］．它们被认为解决了纤维素溶解面临的高粘度、多重操作和高温使用等并发症[30.］．在qes中，阴离子在溶解过程中起着非常关键的作用。由于生物聚合物(由于内部氢键而具有不可接近的羟基)与具有阴离子(如氯化物和溴化物)的qes之间的不良相互作用，鼓励使用具有羟基的qes作为阴离子进行有效和高效的溶解过程[30.］．在其中一次尝试中，我们将废弃的人类头发溶解在40%的四丁基氢氧化铵(TBAOH)水溶液中，并分离出角蛋白和黑色素[31］．

本研究的目的是开发一种从各种废弃物中提取角蛋白的有效方法，并在提取过程中有效利用废溶剂。在此，我们证明了季铵盐碱，即四甲基氢氧化铵(TMAOH, 25% w/w在水中)，对废动物羊毛(WAW)，废人类头发，废鸡毛的溶解和分离角蛋白的适用性。我们进一步证明了回收溶剂用于种子处理的适用性，类似于我们最近建立的方法[32］．在先前的研究中[31]，我们认为40%的TBAOH水溶液为离子液体，但由于水蒸发后不可能得到熔盐，因此我们将该溶液称为季铵基溶液而不是离子液体。此外，经过长期的研究发现TBAOH对土壤微生物有一定的毒性，因此我们现在使用对土壤微生物无毒的TMAOH进行种子处理。

材料

TMAOH [N (CH_3.）₄⁺哦⁻(25% w/w in H .₂O)是从印度孟买的Molychem公司购买的。合成黑色素和标准羊毛角蛋白分别从Sigma Aldrich和TCI购买。土壤样品采集于研究所花园(21.7590^o72.1443 N,^oE)，污泥收集自Bhavnagar市的食品加工工业废弃物(21.7515^o72.0971 N,^oE).随机采集样品并储存在密封容器中。所使用的所有溶剂，如丙酮、盐酸、己烷、二氯甲烷等，均为AR级，并从商业供应商处获得。

这些实验中使用的印度国产羊毛来自巴夫纳加尔当地的印度古吉拉特邦。首先，用清水清洗羊毛三次以去除灰尘颗粒。用1:1 v/v的己烷和二氯甲烷混合物在索氏萃取器中清洗和脱脂48小时。清洗后的羊毛样品在真空烤箱中70°C干燥48小时。

废弃的人类头发(WHH)是从位于巴夫纳加尔市的一家理发店收集的。人发样品(50 g)用70% (v/v)乙醇和蒸馏水清洗并彻底漂洗，然后在氯仿和甲醇(2:1 v/v)的混合物中浸泡24小时，去脂并风干。

废弃鸡毛(WCF)是从巴夫纳加尔市的当地家禽农场收集的。收集的羽毛用足够的水煮沸(70°C)，清洗材料3小时，每一小时换一次水，风干。干燥的羽毛用石油醚(40-60)[1:20]处理24小时以去除羽毛脂质。将脱脂粉化的羽毛制成粉末，用作起始材料。

P9072 (Karnal)收获品种的绿克种子来自德里的印度农业研究所。

WAW, WHH和WCF在TMAOH水溶液中的溶解

将羊毛纤维(10至400 mg)逐渐添加到含有1.0 mL TMAOH水溶液的小瓶中，在65°C(优化温度)下，在氮气气氛下持续搅拌6小时(优化时间)，在玻璃瓶中持续搅拌，直到纤维明显溶解，如表所示1．此外，通过观察溶液中的任何光散射，使用激光束来识别小颗粒的存在。在某些情况下，特别是在羊毛含量高的情况下，羊毛的溶解速度明显下降，这可能是由于溶液粘度增加的缘故。因此，我们将这些最终的观察结果描述为极限溶解度，以表明这些是动力学上的限制值，而不是热力学上的溶解度。6 h后，在TMAOH中观察到羊毛纤维的部分溶解，在100倍光学显微镜下观察不溶部分纤维的存在。不溶性部分用离心机(8000 rpm, 10分钟)分离。在溶液中加入乙酸和丙酮(1:4)的混合物，析出淡黄色粗羊毛角蛋白，如方案所示1．离心分离角蛋白，用丙酮(× 5)洗涤去除溶剂残留，置于干燥器中得到角蛋白干粉。这样得到的角蛋白在使用前密封并保存在4°C。在角蛋白分离后的溶剂混合物中存在丙酮，蒸发后得到粘性溶液(r-TMAOH)。

将脱脂后的毛纤维(10 ~ 200 mg)在室温氮气气氛下逐步加入到含有1ml TMAOH的小瓶中，持续搅拌(至9小时)，9小时后观察WHH完全溶解，在光学显微镜(100倍)下观察不溶性WHH纤维的不存在。经HCl处理后分离得到黑色粗黑色素，然后在溶液中加入乙酸和丙酮的混合物(1:4)，形成浅棕色的沉淀物(粗角蛋白)。用丙酮洗涤后离心分离角蛋白，置于干燥器中得到干燥的粗角蛋白粉。

将精化的鸡毛(10 ~ 600 mg)逐渐加入含有1.0 mL TMAOH的小瓶中，室温下氮气气氛下6小时(优化时间)，在玻璃瓶中不断搅拌，直到肉眼观察到纤维完全溶解。此外，通过观察溶液中的任何光散射，使用激光束来识别小颗粒的存在。在某些情况下，特别是在羽毛含量高的情况下，羽毛溶解的速度明显下降，这可能是由于溶液粘度的增加。6 h后，观察到鸡毛纤维的部分溶解，在100倍光学显微镜下观察等分物，确认了不溶部分的存在。不溶部分用9000 rpm离心分离10 min。在溶液中加入乙酸和丙酮(1:4)的混合物，析出浅白色粗羽毛角蛋白。

青克杯实验

在进行萌发实验前，用2%次氯酸钠溶液和无菌milliq水(× 2)彻底清洗绿革兰种子。本研究采用阶乘、完全随机设计。实验包括处理该品种的绿克在溶液(r-TMAOH)中浸泡11分钟(优化时间)。简单地说，每个种子都浸泡在10毫升不同的r-TMAOH溶液中，浸泡在消毒的试管中，用棉塞通风，然后在一个杯子里播种。以4 d为间隔，监测植株生长30 d。用水浸泡种子，称为对照实验。

微生物总数测定

在羊毛溶解后得到的残渣TMAOH中监测微生物的生长情况，并在分离角蛋白(r-TMAOH)后回收TMAOH，以确定样品的微生物毒性，从而确定样品的土壤相容性。所使用的微生物是从研究所花园地区收集的土壤样本和从巴夫纳加尔市收集的工业污泥样本中分离出来的。在一个典型实验中，加入500 μL的样品，用琼脂培养基镀。污泥被稀释到10¹和1克土壤，加入10毫升磷酸盐缓冲盐水(pH值7)，稀释至10²．取稀释后的100 μL涂于Trypticase大豆琼脂平板(重复)，30°C孵育5 d, 5 d后监测CFU中总菌落的发育情况。

描述

使用Philips X'pert MPD系统在25°C下获得粉末X射线衍射(XRD)模式。在每个XRD实验中，在40 kV和30 mA条件下产生Cu Kα1辐射(λ = 1.540 Å)。数据是在braga - brentano (θ/2θ)水平几何中收集的，使用2θ-范围为5至80.0°，步长为0.02°，伴随扫描速度为0.1°s⁻¹．红外光谱(FTIR)使用Perkin Elmer, G-FTIR光谱仪(Spectrum GX, GSA)进行。元素分析采用CHNS分析仪(Elementar, Vario Micro Cube)。¹³C核磁共振波谱记录在400 MHz的布鲁克先兆-400光谱仪上。的¹³用10khz的旋压速率获得了样品的C CP MAS NMR谱。在CP MAS实验中，接触时间为2.4 ms，循环延迟为1 s，连续波解耦。扫描次数为∼9万到10万。使用100倍放大的光学显微镜(精细视觉显微镜，印度)监测完全溶解的显微图像。

溶解和萃取

研究了水相TMAOH溶解动物毛、人毛、鸡毛等生物质废弃物的适宜性和角蛋白的分离。我们之前证明了WHH在TBAOH中的溶解度(水中25% w/w)以及角蛋白和黑色素的分离[31］．此外，我们还假设回收的TBAOH可以作为缺氮有机肥的氮强化剂。然而，进一步的分析表明，TBAOH抑制了土壤微生物的生长，而TMAOH则没有(补充材料，图S .)1)．因此，我们考虑研究后者对废物生物量处理的适用性，目的是将回收的溶剂用于种子处理。从表中可以看出1约39 ~ 44%的WAW、19 ~ 25%的WHH和55 ~ 60%的WCF溶于季铵基溶液。进一步指出，WHH和WCF的溶解度在25±0.5°C时实现，而WAW的溶解度在65°C时实现。溶解性是通过在光学显微镜(100X)下观察溶液的等分来确认的，如前所述(图。年代2,年代3.，和S4) [31］．以WCF产角蛋白最多，产率约70 ~ 74%，WHH次之，WAW次之。在WAW(约55-60%)和WCF(约40-45%)的溶解过程中形成了大量的不溶性物质(Scheme1)．

从WAW中获得角蛋白的低产量可能是由于已知的高温操作会降解蛋白质。此外，通过紫外-可见分光光度计鉴别出产率约为20-25%的粗黑色素(图S5)可以从人类头发中分离出来。通过CP-MAS确认了黑色素的结构(图S6) [31］．进一步研究了从WAW和WCF中获得的不溶性质量，以确定它们是否适合农业应用。在所有情况下，利用的TMAOH都得到了回收(约30-40%)，并进一步研究了土壤微生物适宜性和种子处理。

角蛋白的化学和结构稳定性

有必要研究蛋白质在任何溶剂中溶解后的化学和结构稳定性，以确保蛋白质关键功能行为的保存。通过与标准羊毛角蛋白的光谱比较，进行了FT-IR测量，以研究溶解后蛋白质功能部分的变化。光谱波段对比如图所示。1显示由于肽键(-CONH)的特征带，并确保蛋白质的化学和结构稳定性。从标准天然羊毛角蛋白的FT-IR光谱可以看出，从所有三种废生物质中分离出来的角蛋白在3350 - 3050 cm之间具有相同的特征角化纤维的宽吸收带⁻¹对应于蛋白质的N-H和O-H拉伸振动。酰胺I波段出现在1700 ~ 1600 cm范围内，属于C = O拉伸振动⁻¹［33］．在1515厘米处有吸收带⁻¹酰胺- i和酰胺-II的C = O拉伸和N-H弯曲振动对应于角蛋白的α-螺旋和β-薄片。在无花果。1，在2550-2600 cm范围内未观测到带⁻¹，表明半胱氨酸导致的S-H振动缺失。1083、1128、1161 cm为低强度振动带⁻¹(S-O不对称拉伸)进一步证实了半胱氨酸的缺失。此外，其他波段在1645,1402，和1274厘米⁻¹分别对应于一级酰胺、二级酰胺和三级酰胺。此外，在1300 ~ 1000 cm处观测到振动带⁻¹是由于角蛋白的两个α -螺旋之间形成了二硫键。该特征带与标准羊毛角蛋白所观察到的特征带相同，表明在TMAOH提取过程中蛋白质的结构完整性得以保存。

由于蛋白质的结晶度对其功能行为至关重要，因此经常受到外界环境的干扰。用粉末x射线衍射法研究了天然羊毛角蛋白和用TMAOH水溶液从三种废生物质中分离得到的角蛋白的结晶度，如图所示。2．

标准天然羊毛角蛋白在约8.7°和20.0°的衍射(2θ)峰上显示出宽的衍射峰，与蛋白质的α-螺旋和β-片状结构相对应(图1)。2) (34］．从三个废弃生物质样品中提取的所有角蛋白样品都观察到了类似的角蛋白α-螺旋和β-薄片结构的衍射模式(图2)。2罪犯)。而在WAW和WCF中提取的角蛋白样品中，这两个峰均明显强烈，表明样品中β-片结构含量较高。

¹³标准天然羊毛角蛋白和用TMAOH水溶液从所有三种废生物质中分离的角蛋白的C CP-MAS光谱如图所示。3.．由于角蛋白的酰胺羰基碳，光谱在约173ppm处显示了一个不对称峰。在130 ppm时的峰值与角蛋白中含有芳香基团的氨基酸有关。α-碳的化学位移在52 - 56 ppm之间，而在40 ppm时，在亮氨酸残基和交联半胱氨酸残基中观察到由β-碳引起的化学位移。在17.5 ppm时记录的碳峰属于丙氨酸，在22.4 ppm时记录的角蛋白峰属于亮氨酸的β碳。以25 ppm为中心的强烈峰值可归因于谷氨酸、谷氨酰胺残基、精氨酸和半胱氨酸中β-碳的存在。较低化学位移的信号是由于侧链上的烷基[13］．从WAW和WHH分离的粗角蛋白中，52-56 ppm之间的α-碳峰变宽，这可能是由于l -半胱氨酸能够破坏角蛋白中的氢键，导致多肽链的展开[13］．这将导致更大比例的β-片状结构的形成，这与前面讨论的XRD数据一致。

土壤相容性及种子处理应用

如上所述，在溶解过程中产生了大量的不溶性物质或残留物，为了将它们用于进一步的应用，对它们进行了元素分析。WAW溶解渣中N含量为3.2±0.1%，碳含量为27.4±0.2%;WCF溶解渣中N含量为8.5±0.2%，碳含量为28.5±0.2%。由于氮和碳的存在，它们可以作为良好的土壤养分，因此研究了它们的土壤微生物毒性。如图所示。年代7和S8，土壤和污泥微生物在残渣样品和TMAOH溶液中生长，表明它们适合放置在土壤中。值得注意的是，纯TMAOH对微生物也是无毒的，从由溶液组成的介质中土壤和污泥中微生物菌落的形成可以明显看出(图2)。4此外，如图所示。4C和d, 3.2 × 10⁵CFU g⁻¹土壤细菌在r-TMAOH培养基中生长，CFU为3.1 × 10^3.CFU毫升⁻¹为污泥细菌(图;4d)。

如计划所示，约有30-40%经处理的TMAOH可循环再造1．如前所述，种子处理需要一些良好的良性化学物质来提高植物发芽后的品质，而不影响人体健康。因此，本文提出使用r-TMAOH进行种子处理。为了发现回收溶剂对种子处理的适用性，每颗绿克种子在10 mL r-TMAOH/水(1:1)中浸泡11分钟，并在受控环境下播种于条件良好的土壤样品中。如图所示。年代9和S10时，株高较对照(水)提高4%。播种30 d后，WAW处理的r-TMAOH处理的重量增加了58%，而WCF处理的r-TMAOH在同一播种日后，株高和株重分别显著增加了12%和29%。此外，采用WHH处理r-TMAOH处理后，播种天数相似，株高和株重均显著提高9%。从WAW、WCF和WHH处理中获得的r-TMAOH处理后绿色革兰氏植物高度增加的代表性图像如图所示。5．

在此，提出了一种新颖而独特的充分利用动物毛、人毛和家禽羽毛等富含蛋白质的废弃物的策略。废物生物量最初溶于TMAOH水溶液(水中25% w/w)，然后分离角蛋白。据观察，39-44%的废动物羊毛，19-25%的废人类头发，55-60%的废鸡毛被溶解在溶剂中。从动物羊毛和鸡毛的溶解中获得的富氮和富碳的不溶性物质被发现与土壤相容。从废动物羊毛、人毛和鸡毛中分别分离到约19 ~ 20%、35 ~ 37%和69 ~ 74%的粗角蛋白。角蛋白在溶剂体系中化学和结构稳定性的保持表明了蛋白质结构的稳定性。通常采用高温从废弃生物质中提取蛋白质，但本文在室温下从WCF羽毛和人头发中分离出角蛋白。然而，对于废弃的动物羊毛则需要较高的温度。分离角蛋白后得到的回收溶剂被发现与土壤和污泥微生物友好相容，因此被用于绿革兰氏种子处理(豇豆属辐射动物)种子。经过处理后，植株的高度(4-12%)和重量(9-58%)显著增加。考虑到更容易分离蛋白质和最大限度地利用化学物质，所证明的工艺可被视为从废物生物质中生产角蛋白的可持续方法。

本研究过程中产生或分析的所有数据均可根据要求提供。

KP, AG和PV感谢新德里CSIR对本研究的财政支持(MLP0027)。TKM感谢CSIR和孟买联合利华工业公司的项目奖学金(HCP0019和CLP1208)， NS感谢UGC的高级研究奖学金。PBS和SS感谢科技部的财政支持。RS感谢DST的INSPIRE奖学金。该所的分析和环境科学部和中央仪器设施因提供仪器设施而受到认可。

资金来自新德里科学和工业研究委员会(CSIR) (MLP0027)。

作者及隶属关系

1. csir -中央盐和海洋化学品研究所，巴夫纳加尔，364002，印度

   Tapan Kumar Maity, Nripat Singh, Pradipkumar Vaghela, Arup Ghosh, Sanju Singh, Pramod B. Shinde, Rosy Alphons Sequeira和Kamalesh Prasad

2. 印度科学与创新研究院，加济阿巴德，201002

   Tapan Kumar Maity, Nripat Singh, Pradipkumar Vaghela, Arup Ghosh, Sanju Singh, Pramod B. Shinde, Rosy Alphons Sequeira和Kamalesh Prasad

贡献

KP负责构思，整体协调，工作规划，稿件撰写，稿件沟通。TKM开展了所有的实验工作，并进行了文献调查。NS进行了与从废弃头发中分离的角蛋白纯化相关的实验工作。PV开展了种子处理和绿克杯实验相关的实验工作。AG协调和计划了种子处理和绿克杯实验相关的实验工作。SS开展了与土壤微生物分离及其与废溶剂相容性相关的实验工作。PBS协调并计划了与土壤微生物分离及其与废溶剂相容性相关的实验工作。RAS进行了文献调查，并帮助解释了核磁共振数据。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到Kamalesh普拉萨德．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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