新型CHKB变异引起的巨耳型先天性肌营养不良:一例报告及文献复习

背景

胆碱激酶β (CHKB)通过肯尼迪途径催化磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺从头生物合成的第一步。这一途径的紊乱也可能影响线粒体膜的稳态。

常染色体隐性CHKB突变会导致一种罕见的先天性肌肉营养不良症，即巨aconial先天性肌肉营养不良症(MCMD)。

案例展示

我们描述了一个由于未发表而呈现MCMD的新颖先证者CHKB突变。患者是一名6岁男孩，因认知障碍和缓慢进行性肌肉无力而引起我们的注意。他是斯里兰卡非近亲健康父母的第一个儿子。神经学检查显示四肢近端无力，骨腱反射弱，高尔斯动作和摇摆门。肌酸激酶水平轻度升高。肌电图、脑MRI正常。左股四头肌骨骼肌活检显示肌病模式，核集中和结缔组织增加。组织学和组织化学染色显示线粒体位于肌膜下，体积增大。超微结构分析证实存在增大的线粒体(“巨穗状”)。直接测序CHKB发现了两个新的缺陷:C . 1060g > C (p.Gly354Arg)取代和C .448-56_29del内含子缺失，分别从父系和母系分离。从患者肌肉RNA中提取RT-PCR扩增子的亚克隆显示，c.448-56_29del导致内含子3的部分保留(14个核苷酸)，改变了生理剪接和转录稳定性。生化研究表明，与对照组相比，患者肌肉中的线粒体裂变因子DRP1水平降低，线粒体呼吸链活性严重受损。

结论

本报告扩展了与MCMD相关的分子发现，并确认了考虑的重要性CHKB肌肉萎缩症和智力迟钝患者鉴别诊断的变异。MCMD患者的临床结局似乎受以下因素的影响CHKB分子的缺陷。肌肉活检的组织学和超微结构检查指导分子研究，并允许识别和描述内含子突变，通常逃避标准的分子检测。

巨爪型先天性肌肉营养不良症(MCMD)是一种罕见的神经肌肉疾病[1的隐性突变CHKB［2]，编码胆碱激酶β。该酶参与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺(肯尼迪途径)的从头生物合成，这是细胞膜的重要脂质成分，包括在线粒体中发现的脂质成分[3.］．

MCMD的主要临床特征包括新生儿低张力和发育迟缓，无脑畸形和神经肌肉受累，其特征为缓慢进行性近端无力。认知受累可能类似于Rett综合征[4]和早期死亡可能是心肌病累及的结果。

尽管肌肉活检常显示纤维中心线粒体异常缺失，外围线粒体增大(“巨孔状”)，但偶尔在患者中发现线粒体功能障碍的迹象[5，6］．

我们描述了一个新的病例MCMD在一个年轻的男孩呈现智力和运动迟缓。肌肉活检提示分析CHKB这是验证已识别变异的基础。蛋白质和生化研究将线粒体动力学改变与线粒体功能障碍联系起来。

临床病理特征

我们注意到一个18个月大的男孩表现出智力和运动迟缓。他是来自斯里兰卡的非近亲健康父母的第一个儿子，其产前和围产期病史一般。

在18个月大时，自发性语言缺失，而达到的最高运动里程碑是坐姿。耳鼻喉科检查正常，排除耳聋作为言语延迟的潜在原因。在临床评估中，发现café au lait斑点，但眼科和皮肤科评估正常。

其后几年运动功能略有改善:患者2岁开始独立行走，4岁神经系统检查显示四肢近端轻度无力，有Gowers动作，骨腱反射弱。脑神经正常，协调性和敏感性正常。由于患者不能说话，即使他表现出部分理解和良好的非语言沟通，认知延迟仍然很严重。

肌电图显示正常。肌酸激酶(CK)水平从正常到轻度升高(560 U/L，参考范围= 38-174 U/L)。6岁时行脑磁共振，胼胝体峡部灶性变薄，侧脑室颞角轻度不对称。

心脏评估(心电图和超声心动图)和呼吸评估正常。轻度畸形特征如轻微额前弯和宽鼻梁明显，CGH阵列显示在Yp11.2染色体上有2.5 mb缺失。这种缺失也存在于健康先证者的父亲中，排除了这一发现的致病作用。

在6岁时，认知介入没有变化，缺乏语言表达，社会互动和沟通困难，攻击性行为，重复习惯，兴趣受限，缺乏互惠。神经肌肉评估显示轻度恶化的肌肉无力，主要在下肢，摇摇摆摆的步态和从椅子上站立困难。

患者行左侧股四头肌肌肉活检。显微镜检查显示中等大小的纤维变化与数量一致的营养纤维(图。1A).然而，肌肉活检的突出特征是在一些纤维中存在异常的肌膜下线粒体，组织化学分析COX活性证实了这一特征，大的线粒体主要位于纤维的外围和中心区域，没有任何活性。由于线粒体损耗，稀有纤维完全缺乏COX活性(图。1B)。

自噬标记物的免疫荧光评估显示存在一些p62强烈阳性的纤维(图。1C)和LC3(图;1D)，提示自噬激活。

在超微结构检查中，肌原纤维结构异常与Z线流被注意到(图。1E).此外，还证实了巨型线粒体的存在。其中一些在长度和直径上都增大了(图2)。1H)，同时，我们观察到纵向切割的线粒体横跨5-6节的长度(图。1F).线粒体常含有电密球状包体(图。1G)。较小的线粒体，肿胀侧面显示嵴紊乱或破裂(图。1H)。

分子和生化研究

直接测序CHKB患者的外显子区显示杂合单核苷酸变异C . 1060g > C可能导致p.Gly354Arg，这在他的父亲中得到证实(图2)。2A).在gnomAD数据库中，在一名南亚女性受试者中报告了C . 1060g > C替代(等位基因频率为0.000004036)，但从未与疾病相关。通过多种工具(包括SIFT、Polyphen、Mutation Taster、Mutation Assessor和CADD)预测该变异为致病性(得分= 28)，并根据ACMG指南将其归类为3类变异。

为了寻找第二个等位基因上的分子缺陷，我们从患者的肌肉活检组织中提取并逆转录RNA。通过RT-PCR扩增子测序，我们检测到外显子3和4之间的重排，这与基因中一小部分内含子区域的部分保留相一致CHKB成绩单。亚克隆实验证实了14 nt的插入导致移码变异p.Ser150Leufs*8(图。2B).因此，我们对患者基因组DNA中外显子3和4之间的内含子进行测序，发现了一个杂合缺失，克隆该基因组片段后，其边界得到了确认(图4)。2C).已知的C .448-56del27微缺失预计会改变典型外显子4受体剪接位点，有利于保留14个核苷酸内含子的另一种剪接。在患者的母亲中也检测到这种变异(图2)。2A).对患者母亲血液提取RNA(未显示)的RT-PCR分析显示，在患者肌肉中检测到同样的效果，支持这种新型等位基因的致病作用。

Mitofusin 2是一种外线粒体膜蛋白，已知可调节线粒体融合，与患者和对照组的肌肉活检相比，其水平没有变化。相反，我们观察到患者肌肉中线粒体裂变因子DRP1明显缺失(图1)。2D).呼吸链复合体活性的分光光度分析显示，在患者的肌肉样本中存在严重的多复合体缺陷，而在对照组中则没有。2E).在患者和对照组的肌肉样本中，没有观察到线粒体呼吸链复合体代表性亚单位的稳态蛋白水平的差异(图。2F)。

本研究描述了一个新的病例巨孔先天性肌肉营养不良(MCMD)由于两个新的CHKB变异(无花果。3.一个)。

1998年，Nishino及其同事首次将MCMD描述为一种独特的肌肉病理[1］．MCMD的遗传缺陷于2011年被发现，并被鉴定为双等位基因CHKB15例MCMD患者在肌肉活检分析中表现出早发性肌肉无力、智力迟钝和巨大线粒体[2］．在自发突变的rmd(“前突肌营养不良症”)小鼠中观察到表型和组织学重叠，该小鼠表现出先天性肌营养不良症和相同的肌纤维病理[7，8］．

虽然MCMD可能表现为异质性多系统受累，但主要观察到的表型是低张力和发育迟缓，无与神经肌肉受累相关的脑畸形，其特征是缓慢进展的近端肌肉无力。症状的出现通常在4岁以内(80%的病例描述，图。3.B)，但MCMD也可以在青春期变得明显。认知受累可能类似于Rett综合征[4而早期死亡通常与扩张型心肌病引起的心力衰竭有关。鱼毒性皮肤变化和癫痫也经常被报道(30%的受试者)。少数病例报告压力/疾病后病情恶化[9，10，11］．

到目前为止，来自40个独立家庭的45名患者CHKB已描述突变(补充表1) [3.］．60%以上的患者来自亚洲，16例独立病例来自土耳其。至少31种不同的突变CHKB报告(补充表1和无花果。3.A).大部分是无意义突变(8个停止密码子和8个移码变异)，其次是错义(n= 10)和拼接位点变体(n= 5)。40个独立先证者中有35个在未受影响的父母中显示纯合缺陷，支持血缘关系。

我们回顾了迄今为止报告的患者的临床表现(n= 45，补充表1)．根据基因型将患者分为两组。第1组包括33例患者，其致病性变异预计只会导致截断的信使RNA (mRNA)的形成，这可能是无意义介导的衰变(过早终止密码子，剪接位点变异，或两者的组合)。第2组包括其余12名患者，他们的变异预计不会导致截断mRNA的形成(错义突变或帧内缺失)。

统计学上有显著差异(Mann-WhitneyU测试中,p两组平均发病年龄(1组2.00±2.03岁，范围出生至8岁，中位年龄12个月;2组6.80±6.95岁，年龄1个月~ 17岁，中位年龄3.5岁)。

组1的平均行走年龄为2.45±1.09岁，组2的平均行走年龄为1.66±0.70岁U测试中,p= 0.02574)。组1中有8例患者(6、9、11、14、17、20、29、30)从未获得独立下床活动[2，4，8，12，13，14，15］．在第2组中，所有患者均实现了无辅助下行走，只有一个先证者(患者43)在酶的胆碱激酶基元中存在纯合子p.Glu283Lys变化。13］．

末次检查年龄资料显示，1组平均年龄为10.77±6.30岁，2组平均年龄为20.23±12.27岁(Mann-WhitneyU测试中,p= 0.0271)。

考虑到获得的最佳运动技能，“步行者”和“坐着者”之间的比例分别为76%(组1为24%)和92%(组2为8%)(图2)。3.C)。

几乎所有患者都存在认知障碍(自闭症谱系障碍、注意缺陷多动障碍、智力障碍、智力有限)，只有两名加拿大兄弟姐妹(患者38和39)在第二个十年出现初始症状，病程轻微(图2)。3.D) (10］．智力障碍似乎在第二组的受试者中不那么严重。第1组患者比第2组患者表现出更多的自闭症特征(分别为70%和45%)。

33例第1组MCMD患者中有11例(33%)报告心脏受累(扩张性心肌病，左心室收缩功能下降，先天性心脏缺陷)，其中6例死亡[6，8，9，12，13，14，15］．在考虑的观察时间内，报告了来自第2组的单一患者(患者35)的心脏病(图2)。3.E) (9］．

在每个组中观察到的广泛的临床异质性限制了这种基因型-表型相关性的范围。例如，第1组中有2例患者在5岁后出现症状(患者7和13 [13])，并携带c项截断突变，预计部分保留胆碱激酶催化位点。在同一家族组中，患者6(发病于14个月大，无法行走)及其同胞患者7(发病于6岁后，3岁独立行走)也报告了显著的临床异质性[13］．

在我们的患者中，p.Gly354Arg改变影响了c项区胆碱激酶结构域下游的一个保守残基，该区域之前曾检测到其他致病变异。c.448-56del27微缺失起着剪接修饰的作用，导致部分内含子保留，从而导致ATP结合环水平上阅读框的偏移。因此，我们的病例显示了一个混合基因型，在反式中有一个错义突变的空等位基因。发病年龄和行走延迟年龄似乎表明，该基因型导致严重的MCMD形式，类似于第1组患者的临床表现。智力障碍的存在，证实这一症状为MCMD的主要特征。到目前为止，患者在临床或仪器水平上未出现心肌病，但强烈建议进行心脏监测。

肌肉活检检查是推动分子检测的基础，并为验证的有价值的资源CHKB转录本水平的缺陷和生化研究的执行。MCMD以典型的巨大线粒体为特征，电镜下可见纤维边缘异常嵴。组织学研究还显示纤维外围线粒体增大，中心区域稀薄。到目前为止，在MCMD患者的所有肌肉活检中，都能均匀地观察到营养不良特征和线粒体变化。肌肉退化由血清CK水平升高(轻度至中度)证实(90%的受测患者)。

MCMD的发病机制虽然尚未完全了解，但在过去15年已被广泛研究[3.］．对Chkb-ko rmd小鼠的研究显示呼吸功能受损，活性氧增加，肌肉组织有丝分裂增强[7，8］．引入肌肉特异性的Chkb转基因完全挽救了rmd小鼠模型的运动和行为功能，证实了该疾病的细胞自主性质。更重要的是，在临床前模型中，基于aav6的肌内基因治疗即使在疾病发作后也能改善营养不良的表型[16］．脂质代谢的改变也被证明会导致肥厚心肌中诱发心律失常的脂质酰基肉碱的增加，从而导致心律失常[17］．Tavasoli及其同事最近证明，在受Chkb−/−影响的肌肉中，脂质代谢发生了短暂的变化。他们观察到，线粒体中脂肪酸的β-氧化受损会导致三酰甘油在疾病发展过程中积聚。有趣的是，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)和下游靶基因表达的降低可以通过PPAR药理学激动作用逆转[18］．

不规则的线粒体形态与线粒体裂变受阻有关，其结果是裂变蛋白DRP1水平降低，降低了OXPHOS活性[19］．Aksu - Menges及其同事最近在MCMD患者的人类原代骨骼肌细胞中观察到线粒体形态的改变、线粒体裂变蛋白水平的降低以及几种线粒体通路的紊乱[20.］．我们的研究证实了患者肌肉中的这些发现:一些肌肉纤维中p62和LC3水平的升高间接提示了自噬的参与，而DRP1水平的降低与呼吸链蛋白亚基正常水平存在的严重多复杂缺陷相关。在我们的病例和以前的报道中观察到的肌肉纤维中心线粒体的稀薄[1，20.，可能是持续的线粒体自噬的结果。

目前，基于NGS测序的现代诊断方法绕过了侵入性手术的需要，对相关数量的神经肌肉疾病患者进行分子诊断。尽管如此，我们强调肌肉活检对遗传结果的验证以及MCMD病例中对明确指导分子分析的病理特征的识别的适宜性。

我们的研究结果扩展了MCMD的遗传库，并支持线粒体形态和动力学改变在严重呼吸链缺陷的建立中的作用，这突出了这种先天性肌病的肌肉病理。额外病例和长时间随访CHKB-突变的患者需要挑战本报告中提出的基因型-表型相关性。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

MCMD:

巨孔性先天性肌肉萎缩症

肌电图:

肌电描记术

核磁共振成像:

磁共振成像

五官科:

耳、鼻、喉评估

CK:

肌酸激酶

考克斯:

细胞色素c氧化酶

OXPHOS:

氧化磷酸化

PPAR:

过氧化物酶体增殖物激活受体

这项工作在欧洲神经肌肉疾病参考网络(ERN-NMD)内得到推广，MS作为意大利ERN-NMD的HCP代表。我们感谢迪诺法拉利中心协会的支持。我们还要感谢位于意大利米兰市Ospedale Maggiore Policlinico的IRCCS Ca’Granda基金会的“肌肉组织、周围神经、DNA和细胞培养库”，它是遗传生物库电视秀网络的成员。

这项研究(部分)由意大利卫生部当前研究IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico资助。这项工作在欧洲神经肌肉疾病参考网络(ERN)内得到了推广。

作者及隶属关系

1. IRCCS基金会Ca ' Granda Ospedale Maggiore Policlinico，神经内科，米兰，意大利

   Francesca Magri, Manuela Garbellini, Stefania Corti, Giacomo Pietro Comi和Dario Ronchi

2. 米兰大学病理生理与移植学系迪诺·法拉利中心，米兰，意大利

   Sara Antognozzi, Francesco Fortunato, Stefania Corti和Dario Ronchi

3. IRCCS基金会Ca ' Granda Ospedale Maggiore Policlinico，神经肌肉和罕见疾病单位，米兰，意大利

   Michela Ripolone, Simona Zanotti, Laura Napoli, Patrizia Ciscato, Daniele Velardo, Monica Sciacco和Giacomo Pietro Comi

4. 意大利米兰，意大利红十字会慈善基金会，医学遗传学部门，妇幼新生儿部

   Giulietta Scuvera和Valeria Nicotra

5. IRCCS基金会Ca ' Granda Ospedale Maggiore Policlinico，新生儿重症监护室，意大利米兰

   Antonella Giacobbe和Donatella Milani

贡献

FM和DR设计了研究并编辑了手稿。DR和SA进行了分子研究。MR、SZ、LN和PC对骨骼肌进行组织学和超微结构分析。FF和MG进行生化研究。患者的临床检查包括FM、GS、VN、AG和DM。DV和MS有助于肌肉活检和数据解释。MS、SC和GPC对重要的知识内容进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到达里奥Ronchi。

伦理批准并同意参与

意大利米兰的“米兰第二地区委员会(Comitato Etico Milano Area 2 Fondazione IRCCS Ca’Granda Ospedale Maggiore Policlinico)”批准了这项研究。所有参与研究的受试者均获得知情同意。

发表同意书

本病例报告及任何随附图像的发表均获得患者的书面知情同意。本期刊编辑应要求可获得书面同意书的副本。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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