氧化应激通过调节progerin-p53相互作用诱导过早衰老和加剧失神经骨骼肌萎缩

背景

Progerin提高萎缩性基因表达，帮助改变核膜，导致严重的肌肉病理，类似于老年人的肌肉无力，从而改变骨骼肌的发育和功能。应激性早衰(SIPS)是由于氧化等刺激导致细胞生长停滞的一种状态，可由progerin引起。然而，关于sips诱导的早衰蛋白积累是否与去神经支配诱导的肌肉萎缩有关的证据并不充分。

方法

利用流式细胞术和活性氧(ROS)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂来评估氧化对坐骨神经损伤小鼠模型失神经肌肉中蛋白(p53)、早衰蛋白(progerin)和核早衰蛋白- p53相互作用的影响。p53靶向缺失的功能丧失方法被用于评估SIPS、失神经肌肉萎缩和纤维发生之间的联系。

结果

坐骨损伤小鼠去神经肌肉中ROS和inos来源NO的增加可上调p53和progerin。核膜中早衰蛋白的异常积累以及核中早衰蛋白- p53相互作用的激活，导致小鼠失神经肌肉细胞过早衰老。去神经支配肌肉中p53依赖的SIPS有助于其萎缩和纤维形成。

结论

氧化应激通过核progerin-p53相互作用引发过早衰老，促进失神经骨骼肌萎缩和纤维生成。

骨骼肌在失去神经支配后逐渐萎缩。这严重影响了靶肌的功能重建，增加了患者和社会的治疗费用[1，2]。虽然延缓肌肉萎缩的治疗取得了一些成功，但萎缩肌肉功能恢复缓慢仍然是一个临床问题[3.，4]。阐明去神经支配后的潜在病理过程可能有助于我们了解肌肉萎缩的发病机制。P53是参与多种疾病病理或生理过程的关键蛋白。然而，它是否对失神经骨骼肌细胞具有独特的作用，迄今为止的研究尚未充分考虑。

过去的研究表明，p53依赖过程可能在氧化应激后通过控制不可逆故障的级联来修复dna损伤细胞中起关键作用[5，6]。然而，如果DNA损伤不足以导致细胞死亡，但细胞不能完全修复，则可能发生细胞衰老[7]。早衰是一种以p53依赖性不可逆G1阻滞为特征的衰老类型。它可以由致癌基因激活和各种压力引起[8，9]。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是一类高活性的应激氧分子[10]被认为是基因组完整性和细胞对DNA损伤反应的重要决定因素[11]。ROS水平的显著升高是诱导和维持细胞衰老的关键事件[12，13]。各种应激引起的mtDNA损伤增加，可能会阻碍电子传递，导致ROS的过量产生，从而加速细胞的过早衰老[14]。此外，低剂量H₂O₂治疗显著加速了端粒缩短的过程，这可能通过ddr - atm -p53依赖途径进一步引发过早衰老[15]。

在ros诱导应激的背景下，inos衍生的NO已被证明与肌肉生理学的调节密切相关[16]，如肌肉萎缩症在衰老相关疾病发病过程中的作用[17]。这种病理通常涉及核因子p53介导的细胞凋亡[18]。NO对细胞凋亡的影响主要是通过p53相关蛋白的s -亚硝基化介导的[19]。此外，s -亚硝化的增加可能导致细胞损伤和衰老。研究证实，骨骼肌中NO的过量产生可导致氧化损伤和肌肉萎缩[20.]。因此，氧化应激可能是介导p53、细胞衰老和肌肉萎缩的重要因素。这促使我们去寻找它们之间的联系。

随着年龄的增长，肌肉骨骼系统等生物结构会发生变化，从而导致身体虚弱，最终导致过早死亡[21]。有研究利用Slc25a46-/-小鼠检测节段性早衰的表型，发现其主要特征强调腓肠肌萎缩[22]。其他研究已经确定并使用Tmem158和CDKN1A分别作为与肌肉萎缩相关的衰老和去神经支配标志物(SDMS) [8]。过去的研究表明，ZMPSTE24基因的缺失导致层粘连蛋白A无法从前层粘连蛋白A形成成熟的层粘连蛋白A，这伴随着层粘连蛋白A/C基因的一种沉默点突变——progerin的产生[23] -导致下肢肌肉的无力和萎缩，以及肌肉纤维和细丝的内在力量减少[24]。小鼠肌肉特异性过表达progerin可显著减少肌肉质量和肌纤维大小，使握力减半[25]。因此，肌肉萎缩与早衰有密切的关系，但失神经肌肉萎缩与早衰之间是否有特定的关系尚不清楚。

在这项研究中，我们研究了p53和progerin的表达及其在失神经支配肌肉中的相互作用。我们发现，去神经支配诱导ROS和inos来源的NO增加，从而导致progerin和p53的上调。骨骼肌随后经历过早衰老，最终萎缩，并导致去神经支配后的纤维生成。

实验动物

雄性P53 KO小鼠，6 ~ 8周龄，每只体重22 ~ 25 g，购自模式生物中心(中国上海)。雄性C57 BL/6小鼠，6 ~ 8周龄，体重22 ~ 25 g，购于中国浙江维特河实验动物科技有限公司。将小鼠置于标准笼子中，室温23°C，相对湿度50%，12小时:12小时明暗循环。qPCR、western和流式细胞术，每实验组4只。组织学上，每实验组6只。为了抑制ROS或INOS，假手术小鼠给予生理盐水(对照组)。在其他实验中，接受假手术的小鼠作为对照。为了抑制ROS，去神经小鼠给予L-NAC (Den+抗ROS组)。为了抑制INOS，去神经小鼠给予1400W (Den+抗INOS组)。两组小鼠均麻醉后行单侧坐骨神经横断术[26]。深度麻醉后，切除每只小鼠右后腿0.5 cm长的坐骨神经;将两神经末梢埋于肌肉中，采用4-0可吸收缝合线缝合切口。在去神经支配后的特定时间点，将小鼠随机分为实验组进行分析。

湿重

去神经后第7天和第14天，小鼠和对照组麻醉，分别取左、右后腿腓肠肌，用生理盐水洗涤，称重。肌重损失比定义为对侧重量减去神经损伤侧肌肉重量除以对侧重量。肌肉样品保存在4%多聚甲醛中，保存温度为- 80°C，待使用。

实时定量PCR (qPCR)

使用RNeasy试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)从腓肠肌中提取总RNA。采用带oligo dT引物的第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)合成cDNA，并用于实时荧光定量PCR (qPCR) (MJ Research, Waltham, MA, USA)。热循环条件为:94°C 5 min, 94°C 30 s, 55°C 45 s, 72°C 1 min, 72°C 5 min，循环35次。通过循环阈值(Ct)计算靶基因的相对表达量。iNOS、α-SMA、progerin、P53表达归一化至GAPDH水平。引物序列如下:iNOS: R, 5 ' GACCTGATGTTGCCATTGT 3 '， F, 5 ' TTG ACG CTC GGA ACT GTA g3 ';α-SMA: R, 5 ' CAC AGC CTG AAT AGC CAC ATA c3 '， F, 5 ' CCT GAA GAG CAT CCG ACA c3 '， progerin: R, 5 ' CTC TCG CTG CTT CCC GTT at3 '， F, 5 ' TGG ATG CTG AGA ACA GGC TAC a3 '， P53:R, 5 ' ACT CGG AGG GCT TCA CTT 3 '， F, 5 ' CAG GAG ACA TTT TCA GGC TTA t3 '。

Western blot分析

冷冻腓肠肌样品在含有1 mM苯基甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学)的放射免疫沉淀测定缓冲液中均质。裂解液在12000 × g(4°C)下离心20 min，上清液中蛋白水平用比优时(Beyotime)比优时(bicinchoninic acid assay kit)测定。通过SDS-PAGE (Beyotime)分离蛋白质，并将其转移到聚二氟乙烯膜(Beyotime)上，该膜在室温下用5%脱脂干牛奶在tris缓冲盐水中阻断，然后与一抗孵育:小鼠抗早孕蛋白(1:200;Santa Cruz Biotechnology, Sc-81611, USA)，兔抗α- sma抗体(1:1000;亲和生物科学，AF1032，美国)，兔抗p53 (1:1000;Abcam, Ab32532, UK)和抗乙酰型p53 (1:1000;Abcam, Ab183544, UK)和兔抗inos抗体(1:1000;亲和生物科学，AF0199，美国)。清洗三次后，与合适的二抗(Abcam)在室温下孵育1小时。使用增强化学发光检测试剂和x射线胶片观察蛋白质。

免疫组织化学

采用免疫组化方法检测大鼠腓肠肌中P53和progerin的表达。切片用二甲苯脱蜡，用乙醇再水合，抗原提取在0.01 m柠檬酸缓冲液(pH, 6.0)中高压锅中进行，然后自然冷却至室温。切片在0.3%双氧水中室温孵育10分钟;用山羊血清在室温下阻断切片15 min，然后与小鼠抗早孕素(1:50;Santa Cruz Biotechnology, Sc-81611, USA)和兔抗p53 (1:100;Abcam, Ab32532，英国)。然后用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG抗体(ab克隆，33301ES60，中国武汉)在室温下处理30分钟。免疫检测采用二氨基联苯胺溶液，根据制造商的说明。清洗后，切片反染色，脱水，然后用中性胶密封胶覆盖。

免疫荧光

为了鉴定去神经支配肌肉中的p53和progerin蛋白，我们进行了双重免疫染色。将多聚甲醛固定的失神经肌肉用一抗和二抗孵育，随后用DAPI涂敷。一抗包括小鼠抗progerin (1:25;Cruz Biotechnology, Sc-81611, USA)和兔抗p53 (1:20 00;Abcam, Ab32532，英国)。荧光显微镜(1 × 71, Olympus, Japan)观察阳性细胞数，ImageJ软件定量。

细胞制备和流式细胞术

腓肠肌单细胞悬液的制备

用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗腓肠肌组织，置于6厘米培养皿中，切成小块(2-4毫米)。将1 mg/mL的DNAse I与1640培养基混合，加入5 mL到组织中。将组织块溶液加入到gentleMACS C管中，并加入5 μl ii型胶原酶。将组织块与酶液一起放入gentmacs C管中，将该管安装在gentmacs组织处理机的机壳内，并插入加热模块。使用37C-mr-SMDK-1程序进行解离;程序完成后，取出C管并短暂离心使组织碎片成球。用70 μm滤镜过滤重悬细胞，将得到的细胞悬液收集于50 ml的试管中。滤网用10 ml RPMI 1640培养基漂洗，重悬细胞的漂洗培养基离心5分钟，丢弃上清。然后对重悬细胞进行计数和染色。

外周血单核细胞悬浮液的制备

将小鼠红细胞裂解液加入50 μl抗凝血剂。将混合物稀释至1ml (biolgend，编号420301)，室温避光孵育15分钟。然后将裂解液在4℃、350 rpm下离心5分钟，观察样品是否存在红细胞。如果观察到红细胞，在室温下避光加入1ml红细胞裂解液，4℃离心5min。然后在重悬的细胞中加入3ml PBS, 4℃离心5min。最后重悬细胞，计数染色。

ROS检测

为了检测ROS，将3ml PBS加入到1ml单细胞悬液中(3×10)⁶细胞)使细胞重悬。细胞在4℃350 rpm下离心5 min，丢弃上清。然后，在细胞颗粒中加入1 ml无血清培养基，以1:1000稀释2′，7′-二氯二氢双乙酸荧光素(DCFH-DA)溶液，最终浓度为10 μmol/L。样品在37°C下孵育30分钟，每3-5分钟翻转一次试管，使探针与细胞保持接触。然后将细胞离心，用无血清细胞培养基清洗3次，在4℃350 rpm下离心，充分去除未进入细胞的DCFH-DA。然后加入200 μl无血清培养基重悬细胞。流式细胞术检测细胞，使用FlowJo软件分析数据。

ROS抑制

静脉注射乙酰半胱氨酸(L-NAC) (MCE, China)或溶剂对照组(生理盐水)，剂量为1.1 mmol/kg/d [27]，并在去神经支配后连续注射14天。

伊诺抑制

腹腔注射iNOS抑制剂1400W (MCE, China)或溶剂对照组(生理盐水)(200 μg/只)[28]去神经支配前1天注射，去神经支配后连续注射14天。

苏木精-伊红(HE)和马松三色染色

小鼠腓肠肌样品用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。取5 μm厚的样品切片，用苏木精-伊红(HE)染色(Beyotime, Shanghai, China)和马松三色染色(Beyotime)染色，观察组织病理变化。采用Image-Pro Plus 6.0软件(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)，对每只小鼠在每组实验条件下随机捕获的6张图像进行盲法分析，测定肌纤维的平均面积、直径和密度。

统计分析

所有数据均以平均值±SEM表示。采用双样本法评估组间差异t测试,Mann-WhitneyU测试，或χ²测试。进行单因素或双因素方差分析，然后进行Bonferroni事后检验进行组间比较。采用Friedman检验评估不同时间点的差异。采用SPSS v17.0软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行统计分析。P值< 0.05认为有统计学意义。

核p53和progerin的升高与去神经支配肌肉细胞过早衰老密切相关

与对照组相比，去神经支配肌肉组织组的p53和progerin蛋白、mRNA的表达以及染色均显著升高(图2)。1f)。有趣的是，细胞核中的p53和progerin在去神经支配肌肉组织组中高度表达(图2)。1这表明，核p53和progerin在肌内细胞中的表达增强可能与小鼠去神经支配肌肉组织的细胞过早衰老密切相关。此外，在连续切片中，sasp相关因子如IL-1、IL-6和ß-gal活性与伴随标记物p21结合显示细胞衰老(图2)。1G, H, K)。

肌肉细胞的过早衰老和P53上调是由ROS引发的，在去神经支配过程中inos来源的NO增加

然后，我们对小鼠外周血和去神经腓肠肌中的ROS进行了时间过程流式细胞术分析，以表征体内ROS的动态变化(持续时间为3,7和14天;无花果。2A, B)。与对照组相比，外周血和去神经腓肠肌中的ROS表达均显著升高(图2)。2C, D)。此外，与对照组相比，去神经支配肌肉组织小鼠的iNOS mRNA和蛋白表达显著增加(图2)。2E, F)。western blotting检测两组失神经小鼠中progerin的表达升高。Den-anti-ROS/iNOS组小鼠的Progerin水平远低于Den-saline组(图2)。2G, H)。western blotting检测P53水平的变化趋势与progerin相似(图2)。2这些数据表明，氧化应激激活了去神经支配过程中p53依赖的肌肉衰老。

去神经支配后p53的上调有助于去神经支配肌萎缩

为了深入了解p53升高在失神经肌肉萎缩中的作用，我们在失神经小鼠模型中使用了功能丧失方法。P53 KO小鼠中P53的靶向缺失导致P53缺失。在P53 KO小鼠组诱导坐骨损伤1周和2周后，去神经支配引起的肌肉重量损失明显减轻(图2)。3.A, B)，平均纤维面积(图2)。3.C)，腓肠肌平均纤维直径(图2)。3.D)更大，它们的平均纤维密度(图2)。3.E)低于WT小鼠。与对照组相比，失神经肌肉组织小鼠的萎缩相关标志物，如MurF1和Mafbx水平显著增加。P53ko-Den-1w组小鼠的MurF1和Mafbx水平远低于Den-1w组(图5)。3.G, H)。我们的研究结果表明p53的增加可加重失神经支配肌萎缩。

P53在失神经肌肉萎缩模型纤维化加重中的作用

然后，我们通过在失神经小鼠模型上使用功能丧失方法来评估p53升高是否在失神经肌肉中诱导纤维化。在P53 KO小鼠中，P53的靶向缺失导致了它的丢失。P53 KO组小鼠坐骨损伤诱导1、2周后，其去神经萎缩肌组织Masson染色面积密度明显低于WT组小鼠(图2)。4A, B)。此外，通过qPCR检测两组小鼠纤维化指数α-SMA的表达升高。Den-p53 KO组小鼠α-SMA mRNA表达量明显低于Den组(图2)。4C)。western blotting测定α-SMA蛋白水平的变化趋势与mRNA相似(图2)。4D).我们的研究结果表明p53的上调会使去神经支配后的肌肉纤维形成恶化。

我们已经证明核p53和progerin的相互作用加重了去神经支配后骨骼肌的氧化性过早衰老，最终导致肌肉萎缩和纤维化。结果表明:(1)氧化应激导致失神经支配肌肉过早衰老。(2) ROS和inos来源的NO通过激活p53/progerin相互作用，加速失神经支配肌肉的过早衰老，导致肌肉萎缩。

应激性早衰(SIPS)是一种特殊的衰老类型，在调节细胞代谢和功能方面起着关键作用。它通常是由防止细胞生长的氧化应激引起的[29，30.]。过度应激导致的过早衰老会引发衰老细胞的异常积累，从而影响细胞功能和组织修复，导致衰老相关的紊乱和疾病[31]。先前的研究表明，去神经支配也会导致目标肌肉组织产生过多的ROS [32，33]，导致下游萎缩相关基因的表达[34，35]。我们还发现，去神经支配肌肉中的ROS生成显著增加，循环中的ROS生成也是如此。此外，氧化应激常伴随亚硝化应激[36，37]，并能增强NO表达[38，39]。在这项研究中，我们观察到inos来源的NO的表达显著增加。此外，其他研究发现EXOSC2突变可诱导过早衰老[40和核苷酸池失衡，导致神经元缺陷。这反过来解释了肌萎缩侧索硬化症和脊髓性肌萎缩症等相关疾病[41]。因此，研究氧化性过早衰老是否贯穿失神经支配肌肉萎缩的进程是很重要的。

我们还探讨了应力诱导的肌肉去神经支配的机制。前纤层蛋白A和随后成熟的纤层蛋白A/C构成核层和核基质，参与各种核活动以维持细胞的稳定性和活性[42，43]。然而，前纤层蛋白A和纤层蛋白A/C的突变会引发多种组织紊乱和一系列疾病。Progerin是一种突变体prelamin a蛋白，是细胞早衰的特殊标志。此外，progerin的异常积累和分布是与细胞功能障碍和多种疾病相关的热点[44，45]。新出现的报告表明，纤层蛋白在核骨架和细胞骨架中起着关键作用，而早衰蛋白的积累会导致肌动蛋白组织的扰动，这意味着早衰蛋白相关的过早衰老调节细胞骨架，从而影响细胞表型[46，47]。我们发现去神经支配小鼠腓肠肌中progerin的表达明显上调。我们还进行了ROS或iNOS阻断试验，发现progerin水平下调。因此，我们发现氧化应激激活的肌肉过早衰老在去神经小鼠模型中出现。

先前的研究表明，氧化应激可通过肝脏中p53的乙酰化而加重与早衰蛋白相关的过早衰老[47]。其他研究报道纤层蛋白相关的衰老是由p53转录相关因子调控的[48]。此外，慢性羟基脲诱导的p53和p21表达上调可导致细胞过早衰老[49]。在之前的研究中，我们通过对人去神经支配肌肉样本的高通量转录组测序发现，p53信号通路是20个最富集的KEGG通路之一。在本研究中，我们发现p53的mRNA和蛋白水平在小鼠去神经支配肌肉中均上调。我们在去神经支配后使用ROS或iNOS抑制剂，发现P53的表达急剧下降。特别是，在使用iNOS抑制剂后，ac-p53在失神经肌肉中的比例明显下降。Progerin与其他几种与核膜蛋白基因缺陷相关的病理变化相同，包括Emery-Dreifuss肌营养不良症、肢带肌营养不良症和先天性肌营养不良症，可导致类似老年人肌肉无力的严重肌肉病理，提示核膜的修饰可能改变骨骼肌细胞的发育和功能[50]。有趣的是，我们发现去神经支配后肌细胞核膜中更多的progerin与p53共定位。这些结果表明氧化应激触发早衰与progerin和p53之间的相互作用有关。

LMNA基因的突变破坏了所有细胞类型核中纤层蛋白A的表达和功能，并可导致称为progerin的改变形式[23，51]。已知在LMNA突变小鼠成纤维细胞和人HGPS患者成纤维细胞中SUN1的积累与核缺陷和细胞衰老有关[52]。骨骼肌中SUN1表达或分布的改变可通过提高萎缩基因表达和抑制编码收缩蛋白的基因表达来损害机械转导[50]。鉴于p53的激活与祖细胞功能丧失和细胞衰老的诱导有关[53]以及p53和progerin在去神经支配后的肌肉细胞核膜中的共定位，我们用p53 KO小鼠的去神经支配肌肉来证明p53 KO后去神经支配肌肉萎缩可以减轻。我们证明p53和progerin的共同表达有助于失神经骨骼肌萎缩。

先前的研究表明，在特发性肺纤维化(IPF)中，p53在外植体组织的AT2细胞内急剧上调[54]。其他研究表明，衰老，而不是肺泡2型(AT2)细胞的丧失，促进了进行性纤维化，并且针对p53激活或衰老的遗传或药物干预都可以阻止纤维发生。p53诱导的AT2衰老是进行性肺纤维化的近端驱动因素和治疗靶点[qh]55，56]。因此，这些数据确定TP53/Trp53是人类和小鼠上皮样品中纤维化的关键调节因子。在本研究中，我们发现P53 KO后失神经支配肌萎缩和纤维形成可以减轻。这些数据表明，氧化应激诱导的功能失调和过早衰老的失神经神经肌肉细胞可能通过p53-progerin相互作用引发萎缩和纤维形成。

总的来说，细胞核中p53和progerin的相互作用增加了去神经支配肌细胞的过早衰老，从而促进了基于p53的进行性去神经支配肌萎缩和纤维化(图2)。5）.以p53激活或过早衰老为目标的遗传或药物干预均可阻断失神经肌肉萎缩和纤维形成。

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇已发表的文章及其附录中补充信息文件。

没有一个

本研究得到上海市临床重点专科[shslczdzk05601]的支持。本研究也得到复旦大学2020年原创个人化项目“髓系细胞在失神经萎缩骨骼肌微环境中的结局及调控机制研究”[IDF151039/059]的支持。

作者指出

1. 向耀先、游宗麒、黄欣英对这项工作也有同样的贡献。

作者及单位

1. 中华人民共和国上海市复旦大学华山医院手外科

   向耀先，尤宗奇，黄新英，戴俊喜，徐磊，蒋俊建，徐建光

2. 国家卫生健康委手部重建重点实验室(复旦大学)，上海

   向耀先，尤宗奇，黄新英，戴俊喜，徐磊，蒋俊建，徐建光

3. 上海市外周神经与显微外科重点实验室，上海，中华人民共和国

   向耀先，尤宗奇，黄新英，戴俊喜，徐磊，蒋俊建，徐建光

4. 中华人民共和国上海复旦大学上海医学院

   黄新英，聂淑琪

5. 上海中医药大学康复科学学院，中华人民共和国上海

   张俊鹏，徐建光

贡献

向耀先和蒋俊健设计了实验，分析了数据，并准备了手稿。徐建光负责监督和监督最终稿件的准备工作。向耀先、尤宗奇、黄新英、戴俊喜进行了实验。张俊鹏和聂淑琪对数据进行了分析。徐磊提供了管理支持。作者参与并批准了这份手稿的最终版本。

相应的作者

对应到Junjian江或Jianguang徐。

伦理批准并同意参与

动物研究由复旦大学华山医院机构动物护理与利用委员会审核通过。

发表同意书

所有列出的作者都已同意随信附上的手稿。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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