在长时间的太空飞行中，选择性剪接使骨骼肌转录组多样化

背景

随着人们对载人航天飞行兴趣的增加，对理解骨骼肌在微重力下有害生理适应的转录组学机制的需求也在增加。虽然微重力诱导的差异基因表达(DGE)已被广泛研究，但尚未在动物模型中研究差异选择性剪接(DAS)对骨骼肌转录组的可塑性和功能状态的贡献。因此，通过在太空飞行中评估DGE和DAS，我们开始提供暴露于微重力期间骨骼肌转录组景观的第一个全面描述。

方法

利用30周龄雌性BALB/c小鼠的腓肠肌和股四头肌分离的总RNA和组织切片进行RNA测序、免疫组化和形态分析，这些小鼠暴露在微重力或地面控制条件下9周。

结果

为了应对微重力，骨骼肌转录组通过DGE和DAS被重塑。重要的是，DGE表现出可变的基因网络富集，而DAS在骨骼肌的结构和功能基因网络中富集，导致选择性剪接的转录异构体的表达，这些转录异构体与微重力下骨骼肌的生理变化有关，包括肌肉萎缩和纤维类型功能的改变。最后，调控pre-mRNA剪接所需的rna结合蛋白本身被差异剪接，但没有差异表达，这是一种上游事件，被推测可以解释在目标骨骼肌基因中识别的下游剪接变化。

结论

我们的工作是对太空飞行中大肢体肌肉DGE和DAS坐标变化的首次调查。它为理解(i)骨骼肌基因剪接变异调节骨骼肌对微重力的生理适应的分子机制和(ii)小分子剪接调节疗法如何在长时间的太空飞行中阻止肌肉萎缩和纤维类型功能的改变开辟了新的机会。

随着太空探索的科学和商业利益迅速扩大，人类长期太空探险的增加是不可避免的，但并非没有风险。甚至在1961年人类进入这个新领域之前，天文学家和临床医生都警告说:“决定载人航天是否最终成为现实并保持现实的不是工程问题，而是人类身体的极限。”1］．因此，在过去半个世纪里，生物医学研究人员通过描述航天飞行对人体的影响并研究减轻持续失重不利影响的干预措施，孜孜不倦地工作，以跟上航天工程方面的突破步伐。

例如，骨骼肌长期不使用，通常被称为机械卸载，在微重力环境下会导致肌肉萎缩，其特征是肌肉质量和力量的损失[2］．类似的微重力相关肌肉表型已在小鼠的肢体肌肉中被发现[3.]，老鼠[4]，和猴子[5]暴露在微重力环境下，以及老年人等久坐不动的人群[6]和handicapped [7］．虽然对策是有益的，其中最主要的是经常锻炼身体[8]，这些干预措施未能完全防止微重力引起的萎缩[9］．最终，仅在微重力环境下暴露1个月后，骨骼肌的质量就会减少20%，强度减少30% [10］．这种质量和力量的损失使宇航员无法执行任务，并使他们在返回高重力条件时受伤的风险增加。11］．

虽然地球上积极的肌肉调节和康复最终可以恢复肌肉质量和力量，但这一过程可能需要几个月到4年的时间，不同肌肉类型的康复时间差异归因于不同肌肉之间的成分和功能差异[12］．骨骼肌由其肌球蛋白重链(MyHC)表达模式来定义，慢肌主要表达MyHC I亚型，快肌主要表达MyHC II亚型[13］．在功能上，骨骼肌是由它在控制运动中的作用来定义的。大多数微重力研究都集中在控制矢状面运动的骨骼肌上，包括屈曲(关节弯曲)和伸展(关节伸直)[14］．腓肠肌和股四头肌是这里研究的老鼠后肢的肌肉。腓肠肌表达MyHC I型和MyHC II型异构体，功能为踝伸肌和膝屈肌，而股四头肌主要表达MyHC II型异构体，功能为膝伸肌和髋屈肌[14］．

骨骼肌的组成和功能决定了它对微重力反应的性质和程度。例如，长时间的太空飞行导致慢肌纤维比快肌纤维更严重的萎缩，主伸肌比主屈肌更严重，萎缩反应开始于肌肉内最大的纤维[15，16］．虽然肌肉萎缩是骨骼肌对微重力最突出的生理适应，但骨骼肌也会受到肌肉类型特定纤维类型的改变。正如其命名所暗示的那样，快抽搐纤维负责动态运动，而慢抽搐纤维支持低水平、持续的活动[14］．因此，在微重力条件下，依赖于运动功能的动态成分，必须以现有的慢肌纤维为代价，自适应地增加快肌纤维含量[17，18］．

高通量测序技术的发展激发了人们对阐明微重力诱导表型的转录组基础的广泛兴趣。人们对差异基因表达水平的转录组效应最感兴趣。小鼠骨骼肌转录组研究进展[19，20.，21]已经注解了微重力诱导的DGE与收缩机制、钙稳态、肌肉发育、细胞代谢、炎症/氧化应激反应和线粒体功能相关的基因网络。一项具有里程碑意义的研究是美国国家航空航天局(NASA)的双胞胎研究[22]，在暴露在航天或地面控制条件下一年的同卵双胞胎中发现了DGE。虽然这项研究是在外周血单个核细胞和流式细胞仪分类的免疫细胞的背景下进行的，但一些转录组变化在返回地球后持续了6个月，这表明太空飞行导致的转录组重塑并不完全是短暂的。

然而，只关注DGE水平并不能解释替代剪接(AS)在宿主转录组上的作用。rna结合蛋白(RBP)介导的AS解释了人类基因组中约30,000个基因所能解释的可翻译mRNA亚型多样性的数倍增加[23］．事实上，大约95%的人类基因已被发现表现出交替剪接的异构体[24]，主要归因于最具特征和最普遍的AS类型:跳过外显子(SE)和互斥外显子(MXE)事件[25］．AS在地球上骨骼肌中的作用已经得到了很好的解释，包括调节肌肉生成[26，27，28]，细胞类型特定的功能[29，30.，31]，纤维类型特定的函数[32]，肌肉收缩[33，34]、钙处理[35，36，37]，肌肉萎缩[38，39]、肌肉萎缩症[40］．然而，在航天飞行期间或之后的骨骼肌中，还没有差异选择性剪接(DAS)的研究。事实上，迄今为止对微重力诱导DAS的检查只有一次，而且那项研究的重点是拟南芥，一种开花植物[41］．

在这里，我们开始在动物模型中首次通过微重力DAS描述骨骼肌转录组的多样化。从30周龄的雌性BALB/c小鼠腓肠肌和股四头肌中分离总RNA和组织切片，这些小鼠暴露在微重力或地面控制条件下共9周。通过rna测序(RNA-seq)、免疫组织化学和形态学分析，我们旨在描述非差异表达骨骼肌基因中功能上显著的DAS变化，这些变化描述了一种以前未研究过的修改转录组以响应微重力生理需求的方法。

实验设计与时间轴

本研究使用20只30周龄的雌性BALB/c小鼠(Taconic Biosciences, NY)。这些动物是从一项研究中偶然获得的，该研究最初旨在分析微重力暴露后骨骼的变化，并测试一种治疗骨质疏松症的新疗法。在这里的研究中，只使用了接受对照治疗的动物(在总共9周的实验中，每两周注射一次皮下磷酸盐缓冲盐水(PBS))。我们的小鼠的年龄、性别和品系是根据骨质疏松症研究的设计选择的。在年龄方面，30周左右是小鼠后肢骨密度(BMD)达到峰值并趋于稳定的时间点，直到两岁左右最终下降[42，43］．因此，在太空飞行9周后观察到的任何骨密度变化都可以肯定地归因于微重力的影响，而不是发育和/或衰老过程。在性别方面，在骨质疏松症研究中，雌性小鼠往往比雄性小鼠更受青睐，因为卵巢切除术是绝经后骨质疏松症最成熟、最具临床相关性的模型[44］．最后，关于品系，BALB/c小鼠是骨质疏松症治疗测试的常用模型，因为与其他品系相比，BALB/c雌性小鼠对卵巢切除术和性腺功能减退症的反应最佳[45]和BALB/c男性比C57BL/6男性表现出更普遍的糖皮质激素诱导继发性骨质疏松症[46］．

在火箭发射前，所有的老鼠都被安置在美国佛罗里达州的肯尼迪航天中心(KSC)，随机分为地面控制组和飞行组(n=每组10个)。2017年6月3日，作为SpaceX商业补给服务(CRS)-11的一部分，飞行小鼠被运送到国际空间站(ISS)，并在国际空间站上进行了整整9周的实验，而地面控制小鼠则在KSC保持了相同的时间(图3)。1)．地面控制小鼠被安置在相同的硬件设备中(啮齿动物研究硬件系统，NASA艾姆斯研究中心，https://www.nasa.gov/ames/research/space-biosciences/rodent-research-hardware)和飞行小鼠的相似，并被安置在匹配的环境条件(温度、湿度和二氧化碳水平)下。飞行和地面控制的小鼠可以自由地获得水和特别开发的NASA营养食物棒[47］．

样品制备

在研究结束时，所有小鼠分别在国际空间站和KSC由训练有素的宇航员或地面人员人道地安乐死。右后肢去皮，臀部解剖，10%中性缓冲福尔马林浸泡，6天后PBS清洗，70%乙醇浸泡，长期保存。右后肢在室温下保存，直到返回分离个体肌肉进行免疫组织化学和形态学分析。然后将剩余的小鼠尸体冷冻到- 80°C或更低的温度。2017年9月17日，SpaceX CRS-12从飞行状态中提取的样本返回地球。所有样本都用干冰运送到加州大学洛杉矶分校(UCLA)。冷冻的尸体在湿冰上解冻，然后进行组织解剖。每具尸体左后肢的骨骼肌被单独解剖并保存在RNAlater用于RNA提取和纯化后RNA-seq的防腐剂溶液(Invitrogen, Waltham, MA, USA)。

免疫组织化学和形态分析

用切片机切取腓肠肌和股四头肌的福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肌肉切片(5 μm厚)，并安装在带电载玻片上。对切片进行标准苏木精-伊红染色以概述或使用以下抗MyHC亚型抗体进行免疫标记:I型MyHC亚型(Abcam, Cat# ab11083);II型MyHC亚型(Abcam, Cat# ab51263)。切片用抗层粘连蛋白抗体(Abcam, Cat# ab11575)联合染色，以测量纤维大小。在所有方案中，使用驴抗兔Alexa-488偶联二抗(Abcam, Cat# ab150073)进行层粘连蛋白染色，使用驴抗小鼠Alexa-594偶联二抗(Abcam, Cat# ab150108)进行I型MyHC抗原染色，使用驴抗小鼠Alexa-488偶联二抗(Abcam, Cat# ab150105)进行II型MyHC抗原染色。显微照片使用配备Cell Sense数字成像系统(Olympus, Japan)的Olympus BX 51和IX 71显微镜获得。

为了评估肌纤维的横截面积(CSA)，从抗层粘连蛋白抗体染色的免疫荧光切片中获取数字化照片，并按前面所述测量CSA [48］．简单地说，横切面肌肉束的每张图像都在ImageJ 1.45g中概述(美国国立卫生研究院图像，https://imagej.nih.gov/nih-image/)．组织学伪影(如切片撕裂、皱纹)、干扰肌纤维识别的解剖结构(如血管、肌腱、斜纤维)和检测不良的肌纤维使用软件排除工具手动从分析中移除。利用精密尺(0.647 μm/pixel)估算像素与微米的换算系数，测定所有剩余纤维的CSA，并由软件自动报告平均纤维面积。每只鼠标量化一个完整的中间束部分。

RNA提取纯化

总RNA是从小鼠腓肠肌(n= 3)和股四头肌(n= 3)的各试验组(飞行和地面对照组)采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取，然后进行硅膜净化。简单地说，冷冻组织样本被切碎成小块(1毫米× 1毫米× 1毫米)。通过添加溶出缓冲液和在冰上进行温和的超声振动，可获得均匀的溶出液。将组织裂解液离心，上清液用于苯酚/氯仿中提取RNA。相分离后，转移水层，与等体积的70%乙醇混合。然后根据制造商的协议，使用RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的RNeasy自旋柱提取总RNA。

RNA-sequencing分析

对于所有12个RNA样本，cDNA文库由UCLA基因组学和生物信息学技术中心(TCGB)按照Illumina链mRNA协议制备。然后由UCLA TCGB使用HiSeq 3000测序仪(Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)对文库进行测序，平均产生4150万个单端50碱基对读取。结果RNA-seq读取与mm10对齐亩骶基因组(UCSC基因组浏览器，https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10)使用STAR软件[49］．RNA-seq数据集的质量通过读取深度和映射统计来确认(图2)。S1A).所有样本的读取深度都在3000万或以上，只有一个地面控制的股四头肌样本有2740万唯一映射读取。所有样本的唯一映射读百分比均在80%以上。转录丰度直接从FASTQ文件中测量为TPM(每百万转录本)，使用kallisto [50]，用R包“tximport”总结成基因表达矩阵[51］．

通过rMATS-turbo检测DAS事件，并将其量化为百分比拼接(PSI)值[52使用连接读取(跨越拼接连接的读取)。五种DAS事件类型被注释(图。S1B)，包括跳过外显子(SE)、替代5 '剪接位点(A5SS)、替代3 '剪接位点(A3SS)、互斥外显子(MXE)和保留内含子(RI)。SE和MXE是本文所关注的DAS事件类型，分别占所有DAS事件的大约50%和20%。进行基因本体(GO)分析，以揭示受显著基因表达变化影响的富集功能通路，以及使用enrichment r [53，54，55］．

统计分析

对于免疫组化和形态学分析，使用OriginPro 8 (Origin Lab Corp.， Northampton, MA, USA)，使用未配对的双尾Student 's进行统计学意义分析t -测试。值为p< 0.05为差异有统计学意义。统计分析咨询了加州大学洛杉矶分校统计生物数学咨询服务。

对于DGE有统计学意义的注释，过滤低表达基因(所有样本中TPM≤5)，然后用DeSeq2进行差异分析[56］．对于每一个比较，基因有一个绝对对数₂折叠变化> log₂1.5和经过调整的错误发现率(FDR)p-value < 0.05为差异表达基因。

为了检测数据集中的替代剪接事件，在所有12个样本中，低结读支持度(≤10个平均结读，≤10个总包含结读，或≤10个总跳过结读)或极端PSI值范围(所有12个样本中PSI≤0.05或≥0.95)的事件被排除在下游分析之外。然后使用rMATS-turbo进行差分拼接分析，比较每个组织(腓肠肌和股四头肌)中的重复地面控制样本和飞行样本。差异剪接事件由以下标准识别:(i)两组> 10个平均结读(包括和跳过结读);(ii)没有极端PSI值(所有6个样本的PSI≤0.05或PSI≥0.95);(iii) FDR < 0.05;iv) PSI的绝对变化(|ΔPSI|) > 0.05。

对于受显著基因表达变化和选择性剪接变化影响的丰富功能通路的注释，每个类别(生物过程、分子功能和细胞成分)中最小的五个GO项进行了调整p-values被包含以供参考。调整后的值p< 0.05为差异有统计学意义。

腓肠肌和股四头肌的大小和纤维类型组成因长时间的太空飞行而受到不同程度的干扰

腓肠肌肌纤维的CSA平均为1170±141 μm²至856±74 μm²，减少约27% (p< 0.01)的肌肉纤维大小，因为长时间暴露于微重力(图。2A, B).股四头肌肌纤维的平均CSA从1986±330 μm下降²至1046±201 μm²，减少约47% (p< 0.01)的肌肉纤维大小(图;2因此，股四头肌比腓肠肌表现出更大程度的微重力诱导萎缩(基于纤维CSA约多1.8倍)。

与地面对照组相比，腓肠肌中慢肌纤维(表达MyHC I的纤维)的总体丰度从18%下降到5% (p< 0.01)，快速收缩纤维(表达MyHC II的纤维)的丰度从80%增加到96% (p在微重力暴露9周后，< 0.01)(图;2A, C)。这种快速收缩纤维含量的增加是以现有的慢收缩纤维为代价的，这可以从太空飞行小鼠腓肠肌中的共标记纤维(同时表达MyHC I和II的纤维)中得到证明(图。2D)。相比之下，没有证据表明股四头肌的纤维类型转变是其天然100%快收缩纤维类型组成的结果(图。2A, C)。这些发现在高电平收集的图像中是一致的(图。2A)和低(图。S2)的放大。

DGE和DAS是微重力诱导转录组调控的不同功能机制

作为对扩展太空飞行的回应，有证据表明DGE(附加文件1而且2)和DAS(附加文件3.而且4)在腓肠肌和股四头肌。然而，微重力诱导的这两块肌肉的转录组是不同的。在腓肠肌和股四头肌之间，只有大约8.5%的DGE基因和大约9%的DAS事件基因是相同的。3.A、B)。

在腓肠肌中，微重力暴露9周后，有120个DGE基因，其中43个上调，77个下调(图2)。3.C).上调的基因显示出不显著的基因网络富集，而下调的基因在蛋白质合成/加工、线粒体功能和肌球蛋白重链结合方面富集(补充文件)5)．在四头肌中，在微重力暴露9周后，有70个DGE基因，其中23个上调，47个下调(图2)。3.D).上调的基因表现出不显著的基因网络富集，而下调的基因则富集脂质代谢(附加文件)5)．

在腓肠肌中，在微重力暴露9周后，72个基因中有159个DAS事件，其中78个在飞行组中被更多地包含，81个在飞行组中被更多地排除(图。3.E).包含或不包含DAS事件的基因绝大多数存在于骨骼肌的结构和功能基因网络中，包括肌浆网钙离子运输、肌肉收缩和肌动蛋白结合等(附加文件)5)．在四头肌中，在微重力暴露9周后，180个基因中有285个DAS事件，其中158个在飞行组中被更多地包含，而127个在飞行组中被更多地排除。3.F).再次，具有DAS事件的基因在骨骼肌的结构和功能基因网络中大量富集，包括肌节组织、肌原纤维组装和肌肉收缩等(附加文件)5)．因此，与腓肠肌相比，股四头肌中DAS事件大约多1.75倍，在这两种肌肉中，DAS发生在编码骨骼肌中具有已知功能的蛋白质的基因中(以下称为骨骼肌基因)，而不是DGE。唯一的例外是八个骨骼肌基因的DGE (Actn2，Myl12a，Myl2，Myl3，Myom3，Myoz2，Tnnc1，Tnni1)在暴露于微重力的小鼠腓肠肌中(表1)．相比之下，在长时间的太空飞行中，在腓肠肌的15个骨骼肌基因中有32个潜在的蛋白质结构改变DAS事件2)和在股四头肌中25个骨骼肌基因中68个潜在的蛋白质结构改变DAS事件(表3.)．潜在改变蛋白质结构的DAS事件被定义为那些涉及转录本区域的事件，这些区域(i)编码所得到的蛋白质产物的功能域，(ii)在蛋白质编码序列中调用移码，或(iii)先前已被证明以其他方式改变了蛋白质产物的结构和/或功能。

一旦我们确定了骨骼肌转录组在太空飞行中通过DAS经历了广泛的重塑，我们就试图更详细地描述这些DAS事件。根据文献，我们组织了表格1，2而且3.将DGE基因和可能改变DAS事件的蛋白质结构的基因分为四组:(i)已知伴随肌肉萎缩的基因;(ii)与纤维类型功能改变有关的;(iii)那些被认为损害肌肉骨骼剪接调节剂功能的;(iv)具有未知或不相关扰动的情况。这些发现总结在图中。4，从中可以看出，无论是腓肠肌还是股四头肌，骨骼肌对微重力的慢性生理适应可能更依赖于DAS而不是DGE。

肌肉萎缩与微重力诱导的泛素-蛋白酶体通路和巨肌蛋白转录本的DAS有关

通过泛素-蛋白酶体途径的蛋白质降解是急性肌肉萎缩的主要原因，这代表了在萎缩诱导扰动后约48小时内发生的肌肉损失[57］．泛素-蛋白酶体通路的急性激活已被证明是由DGE指导的[58];然而，最近一项对大鼠的研究[39]在后肢卸载7天后发现泛素-蛋白酶体通路转录本的DAS。在微重力暴露9周后，我们在两个腓肠肌中观察到编码泛素-蛋白酶体途径蛋白的转录本的DAS，而不是DGE(两次DAS事件;见表2)和股四头肌(四次DAS事件;见表3.)．重要的是，我们确定了潜在的功能增益剪接事件Ubap1而且Usp14这些可能是DAS激活泛素-蛋白酶体通路的慢性例子。

Ubap1其编码泛素相关蛋白1，通过外显子4和5的相互排斥进行DAS(图。5A).最重要的是包含或排除外显子5，它编码Ubap1与泛素相互作用所需的泛素相关(UBA)域[59］．包含外显子4的，包含外显子5的转录异构体编码功能完整的，uba1保留的蛋白质产物，而包含外显子4的，包含外显子5的转录异构体编码部分功能失调的，uba1去除的蛋白质产物(图。5B).在太空飞行小鼠的腓肠肌中，在微重力暴露9周后，外显子4的丰度降低了27% (FDR < 0.05;无花果。5C)，导致外显子5丰度的相互增加。因此，在外显子4排除，外显子5包含，功能完整，uba1保留的蛋白产物可能在太空飞行中在腓肠肌中表达得更高。飞行组和地面对照组的股四头肌外显子4或5包裹体无显著差异(4%，FDR > 0.05;无花果。5C)。

Usp14其编码泛素羧基末端水解酶14，通过外显子3和4的互斥进行DAS(图。5D).外显子4编码Usp14激活泛素化蛋白和刺激蛋白酶体降解能力所需的泛素样(UBL)结构域[60］．因此，包含外显子3的，包含外显子4的转录异构体编码功能完整的，带有ull的蛋白质产物，而包含外显子3的，包含外显子4的转录异构体编码部分功能失调的，带有ull的蛋白质产物(图2)。5E).腓肠肌飞行对照组和地面对照组外显子4包合量差异无统计学意义(5.1%，FDR > 0.05;无花果。5F)，与地面对照相比，太空飞行小鼠的股四头肌中外显子4的含量增加了13% (FDR < 0.05;无花果。5F)以外显子3的倒数代价。这表明在外显子3排除，外显子4包含，功能完整，ull保留的蛋白产物可能在四头肌的航天飞行中表达得更高。

虽然单个转录本中的AS事件通常是彼此孤立地讨论的，但许多AS事件可能同时起作用，影响长mRNA转录本的结构和功能。在骨骼肌中，编码三种巨型肌蛋白的转录本伴随AS (Ttn，Obscn,内)可以引起对所产生的蛋白质产物(肌肽、obscurin和星云蛋白)大小的重大改变。Non-differentially表示,Ttn，Obscn,内在9周的太空飞行后，腓肠肌和股四头肌都进行了不同程度的拼接。具体来说，我们观察到编码与肌肉萎缩相关的重要功能域的转录区域长度的显著改变。

Titin，由基因编码Ttn，是一种3900 kda的蛋白质，通过其PEVK结构域的长度调节肌节的弹性和收缩强度，因其含有高比例的Pro-Glu-Val-Lys氨基酸而得名。PEVK结构域的延长通常被称为“分子弹簧”，与肌肉萎缩的发展有关[61］．而正面和负面的分布相对平均△PSI值(平均值)△有统计学意义事件的PSI = - 2.0%;无花果。6B)在腓肠肌PEVK域编码区域内的10个重要DAS事件(图。6A)，在股四头肌PEVK域编码区域内的33个重要DAS事件中的大多数(图。6A)表现出积极的一面△PSI值(平均值△有统计学意义事件的PSI = 8.1%;无花果。6C).在组成股四头肌的肌纤维中，交替剪接外显子的同时包含有望在长时间的太空飞行中延长titin的PEVK结构域。太空飞行引起的PEVK结构域的延伸可能导致股四头肌萎缩的发展，而考虑到在本研究中与股四头肌相比，腓肠肌的PEVK结构域的萎缩水平相对较低，因此预计没有广泛的太空飞行引起的腓肠肌PEVK结构域的改变。

暗箱素，由基因编码Obscn，是一个800 kD的蛋白质，在组装过程中是肌原纤维组织的组成部分。DASObscn剪接变异区(SVR，外显子40-53)与大鼠模型肌肉萎缩有关[38］．具体地说，SVR内的外显子包含导致了表型的萎缩。而精确的调控机制则是DAS作用的基础Obscn在萎缩过程中尚未完全阐明，据推测，在富含“GGGG”的SVR中包含外显子导致了称为g -四丛的细胞毒性二级RNA结构的发展[62］．在暴露于微重力9周的小鼠腓肠肌中，有证据表明，在一个外显子Obscn在微重力条件下，SVR被纳入的程度明显更高(图2)。6D, E);然而，在暴露于微重力9周的小鼠四头肌中，我们发现了三个外显子Obscn与地面对照组相比，微重力条件下被纳入的SVR的程度明显更高(图2)。6D, F)。这与Qiu等人在萎缩大鼠模型中发现的四外显子包体的大小相似。[38］．外显子包含在Obscn在长时间的太空飞行中，SVR预计会增加构成腓肠肌和股四头肌的肌纤维中细胞毒性g -四丛的流行率，这可能会导致两种肌肉萎缩的发展，尽管在本研究中腓肠肌的萎缩程度小于股四头肌。

星云蛋白是由该基因编码的600-900-kD蛋白内这决定了细丝的长度。与肌肽相比，星云素缩短与肌肉萎缩的发生有关[63］．在暴露于微重力9周的小鼠的腓肠肌和股四头肌中，在大脑的3 '区域内分别有8个和7个显著的DAS事件内成绩单;涉及的3 '外显子编码肌动蛋白、原肌凝蛋白和纤溶蛋白结合区域(图。6G).平均有统计学意义△在所有DAS事件中，腓肠肌和股四头肌的PSI值分别为−16.1%和−6.1%。6H, I)。在长时间的太空飞行中，腓肠肌和股四头肌交替剪接外显子的同时排斥，预计将缩短构成腓肠肌和股四头肌的肌纤维中星云的c端可变区。这种太空飞行引起的星云缩短可能有助于腓肠肌和股四头肌萎缩的发展。

DGE与慢肌纤维含量的降低有关，而DAS与快速肌纤维功能的潜在扩展有关

在微重力环境下，依赖于运动功能的动态成分，需要在暴露于微重力环境9周的小鼠后肢肌肉中向更大的整体快缩纤维表型的适应性转变。在太空飞行之前，腓肠肌同时表达慢肌和快肌纤维，经历了纤维类型的转变，其中快肌纤维含量显著增加，而原生慢肌纤维则减少(见图)。2)．相比之下，股四头肌保持了100%的快速抽搐优势(见图。2)．考虑到在9周的微重力暴露后，腓肠肌发生了纤维类型的转变，而股四头肌表现出了纤维类型的维持，我们研究了在太空飞行期间，这两块肌肉中微重力诱导的腓肠肌和股四头肌纤维类型改变的差异是否伴随着纤维类型相关基因DGE和DAS的差异。

首先，我们发现在腓肠肌中所有差异表达的纤维类型相关基因(Actn2，Myl12a，Myl2，Myl3，Myom3，Myoz2，Tnnc1，Tnni1；见表1)编码慢抽搐特异性蛋白[64，所有这些转录本在延长太空飞行后都被下调了。相比之下，暴露在微重力下的小鼠的四头肌中没有纤维类型相关基因的差异表达(见附加文件)2)．因此，腓肠肌中慢抽搐纤维含量的减少，而在股四头肌中没有观察到，可能是腓肠肌中慢抽搐特异性转录物的下调而不是股四头肌。

虽然长时间暴露在微重力环境中，股四头肌中没有纤维类型相关基因的差异表达，但有5种纤维类型相关基因(Tnnt1，Mybpc1，Tnnt3，内,Ryr1；见表3.)发生了可能改变蛋白质结构的DAS事件，其中三个(内，Ryr1,Tnnt3；见表2)也在暴露于微重力的小鼠的腓肠肌中观察到。考虑到在9周的微重力暴露后，股四头肌的纤维类型组成没有变化，我们更详细地研究了这些DAS事件对天然快收缩纤维功能的潜在影响。

例如,Tnnt1而且Mybpc1分别编码肌钙蛋白T (Tnnt)和肌凝蛋白结合蛋白c (MyBP-C)的慢收缩亚型;然而，这些典型的慢抽搐转录本可以被交替拼接，从而产生的蛋白质异构体反映了其快抽搐对应物的功能。具体来说，包括外显子5Tnnt13外显子除外Mybpc1转录本在快收缩肌纤维中被大量观察到。在这种情况下Tnnt1外显子5的包合或排除改变了Tnnt的三维结构，进而影响钙(Ca^{2 +})肌钙蛋白复合体的敏感性[65，66］．预测的优势Ca^{2 +}包含外显子5的Tnnt亚型相对于不包含外显子5的Tnnt亚型的敏感性有助于优先包含外显子5Tnnt1快收缩肌纤维内的转录本[67，68］．至于Mybpc1的外显子3Mybpc1属于编码蛋白产物的肌动蛋白和肌凝蛋白结合区域的区域，并以变体特异性方式调节肌动蛋白-肌凝蛋白的结合和滑动[69］．外显子3的排除在Mybpc1转录本在快收缩肌中表达，由此导致的MyBP-C蛋白磷酸化变化被认为促进肌动球蛋白跨桥形成[70，71］．因此，增加的丰度Tnnt1外显子5 (10%，FDR < 0.05;无花果。7A)和减少的丰度Mybpc1外显子3(−9.9%，FDR < 0.01;无花果。7B)暴露在微重力环境下的小鼠的四头肌中，都是与长时间航天飞行期间快速收缩纤维功能扩张相关的潜在功能显著的DAS事件。

在微重力暴露9周后注释的其他改变纤维类型功能相关DAS事件包括互斥Tnnt3外显子16/17和内外显子127/128。而Tnnt1编码肌钙蛋白T的典型慢收缩亚型，Tnnt3编码其快速抽动亚型。的3 '区域内，Tnnt的快抽搐功能受DAS的调节Tnnt3编码肌钙蛋白I和原肌凝蛋白c端结合域[72］．特别是外显子16和外显子17Tnnt3与功能相同的外显子的序列相似度不同Tnnt1；外显子17的相似度(61%)远高于外显子16 (32%)(Wang and Jin， [73])。因此，Tnnt与其功能伙伴(肌钙蛋白I和原肌凝蛋白)的结合亲和力是可变的[74];含外显子17的Tnnt亚型对肌钙蛋白I和原肌凝蛋白的慢收缩亚型的亲和力较高，而含外显子16的Tnnt亚型对肌钙蛋白I和原肌凝蛋白的快收缩亚型的亲和力较高(Wang and Jin， [73])。而没有慢或快抽搐基因亚型内的交替拼接异构体内显示了纤维类型的特异性。例如，包含外显子128和包含外显子127的异构体分别在快抽搐和慢抽搐优势肌类型中更为丰富[75，76，77］．因此，增加的丰度Tnnt3外显子16 (9.1%，FDR < 0.001;无花果。7C)以…为代价Tnnt3外显子17，伴随着丰度的增加内外显子128 (8.1%，FDR < 0.001;无花果。7D)以…为代价内暴露在微重力环境下的小鼠四头肌中的外显子127提供了额外的证据，证明在长时间的太空飞行中，快速收缩纤维功能可能通过DAS扩张。DAS对腓肠肌的影响也可见一斑，可见于腓肠肌中内外显子128 (6.4%，FDR < 0.001;无花果。7D)以…为代价内暴露在微重力环境下的小鼠腓肠肌中的127外显子。

类似于内，还有另外两个基因(Tnnt3，Ryr1)与暴露于微重力的小鼠腓肠肌中发现的与纤维类型功能相关的DAS事件有关，这两者与太空飞行小鼠的股四头肌相同。除了在其3 '区域内通过拼接进行调节外，Tnnt3在其5 '可变区域内也经历广泛的剪接。虽然Tnnt的n端可变区在细丝调控系统中没有已知的结合伙伴，但在的5 '可变区内可选择剪接Tnnt3生成各种蛋白质异构体，这些异构体可分为富酸性残基或富碱性残基异构体类[78］．n端可变区电荷的变化改变了所得到的蛋白质的三维结构，并影响钙^{2 +}肌钙蛋白复合物的敏感性。具体来说，排除外显子4、8和F的基本异构体倾向于调用更大的Ca^{2 +}收缩敏感性[65，78]，使其在快收缩骨骼肌纤维中得到优先利用[67，68］．在腓肠肌中，外显子4无明显DAS (- 2.7%， FDR > 0.05，图;7E)， 8外显子明显被排除(−11.9%，FDR < 0.001，图;7F)和F(−5.3%，FDR < 0.01;无花果。7G).外显子4(−8.3%，FDR < 0.001;无花果。7E)和8(−7.3%，FDR < 0.001;无花果。7F)在股四头肌中被显著排除，而外显子F无明显的选择性剪接(- 3.0%，FDR > 0.05，图。7G)。尽管在腓肠肌和股四头肌中表现出部分不同的剪接模式，但这两种肌肉类型在的5 '可变区域内均表现出DAS的证据Tnnt3这将促进基本的残基富集蛋白异构体的表达，可能是为了应对钙含量的增加^{2 +}长时间航天飞行对快收缩纤维的需求。此外，有证据表明DAS的Ryr1可能有助于快速收缩肌肉的功能。具体地说，人类的同源物Ryr1外显子70 (RYR1外显子70)优先包含在快抽搐肌的剪接mRNA中，而在慢抽搐肌中则相反排除[79］．虽然这种异构体在快速收缩肌肉中使用增加的机制尚不清楚，但微重力诱导的外显子70包涵在Ryr1腓肠肌(8.8%，FDR < 0.001;无花果。7H)和股四头肌(9.3%，FDR < 0.001;无花果。7H)可以作为两种肌肉类型在长时间航天飞行期间可能的剪接支持的快收缩纤维功能扩张的进一步证据。

肌肉骨骼剪接调节剂的DAS可以解释航天飞行中的下游剪接变化

DAS受rna结合蛋白(RBPs)的调控，这些RBPs的DGE被认为引起DAS的下游变化[23］．然而，尽管发现了许多航天诱导的DAS事件，但没有证据表明航天诱导的rbp DGE(见附加文件)1而且2)．令人惊讶的是，我们发现了RBPs本身可能改变蛋白质结构的DAS的证据;在腓肠肌中，与股四头肌中8个rbp编码转录本中8个显著DAS事件相比，在4个rbp编码转录本中有4个显著DAS事件2而且3.)．特别有趣的是Mbnl1而且Rbfox1，因为有报道Mbnl1指导剪接Tnnt1，Tnnt3，Ttn,Ryr1［80和Rbfox1指导拼接Mybpc1而且Ryr1［81］．

Mbnl1是两个串联的RBP反式-作用rna结合域[锌指(ZF)1-2串联和zf4 -4串联]结合顺式mRNA靶标中的调控元件，包括Tnnt1，Tnnt3，Ttn,Ryr1(无花果。8D)，直接剪接邻近转录区域[80］．Mbnl1经历外显子2的DAS，生成两种异构体，每种异构体具有不同的翻译起始密码子(图。8A).在包含外显子2的转录本亚型中，起始密码子位于外显子2中，最终的蛋白质亚型包含串联rna结合域(ZF1-2和zf4 -4)。然而，在排除外显子2的转录异构体中，起始密码子位于外显子3中，最终的蛋白质异构体仅包含两个串联rna结合域中的一个(zf4 -4，图3)。8B).含有ZF1-2和ZF3-4的蛋白亚型比单独含有zf4 -4的蛋白亚型表现出更多的活性和靶RNA基序特异性[82］．在太空飞行小鼠的腓肠肌中，外显子2包合物无明显变化(- 3.0%，FDR > 0.05;无花果。8C)，但在暴露于微重力的小鼠的四头肌中，编码ZF1-2和ZF - 3-4串联结构域的包含外显子2的转录本亚型的丰度降低了13% (FDR < 0.001;无花果。8C).因此，虽然Mbnl1的活性和结合特异性可能在太空飞行小鼠的腓肠肌中保持完整，但在暴露于微重力的小鼠的股四头肌中，Mbnl1可能以功能受损的形式表达。

的异常拼接Mbnl1在股四头肌中被推测为我们在其下游目标中发现的一些剪接变化的原因。例如，Mbnl1已motif映射到的PEVK域编码区Ttn外显子5Tnnt1．的纯合敲除Mbnl1结果包括增加Ttnpevk编码外显子和Tnnt1外显子5，表明Mbnl1在促进这些外显子的跳过中起正常作用[80］．这与我们对增加纳入的注释是一致的Ttnpevk编码外显子(见图。6),Tnnt1外显子5(见图;7)在太空飞行的股四头肌中，它越来越多地表达外显子2排除，可能功能失调的蛋白质编码转录异构体Mbnl1．此外，缺乏DAS的Ttnpevk编码外显子(见图。6),Tnnt1外显子5(见图;7)与包含外显子2的功能蛋白编码的表达一致Mbnl1在这块肌肉中的转录异构体。图中概述了通过上游剪接RBP转录本实现骨骼肌靶基因具有生理意义的DAS的机制。9利用mbnl1及其下游目标，Ttn而且Tnnt1，作为一个例子。

此外，Rbfox1是一种RBP，在肌肉和脑组织中都起到剪接调节作用，该蛋白的组织特异性功能由DAS调节，涉及B40(由40个碱基对组成的脑特异性外显子)和M43(由43个碱基对组成的肌肉特异性外显子)(图。8E, f) [83］．在肌肉中，已知Rbfox1调节剪接Mybpc1而且Ryr1(无花果。8H) (81］．虽然B40/M43 DAS事件之前被注释为相互排斥的事件，但我们观察到B40在腓肠肌和腓肠肌中的包含显著增加(8.1%;FDR < 0.05;无花果。8G)和股四头肌(8.9%;FDR < 0.01;无花果。8G)，尽管在任何肌肉中都没有相互显著的M43排斥。B40优先加入Rbfox1股四头肌和腓肠肌的转录本可能导致这两种肌肉中RBP与其pre-mRNA靶点的结合日益受损。

类似于Mbnl1的异常拼接Rbfox1可能解释了我们在其下游目标中确定的一些拼接变化。例如，Rbfox1已基序映射到的外显子3Mybpc1．的纯合敲除Rbfox1结果增加排斥性Mybpc1外显子3 [81］．这与我们对股四头肌中显着外显子3排除的注释一致，该外显子3经历剪接Rbfox1潜在的抑制异构体。尽管有潜在的抑制剪接Rbfox1在腓肠肌中，我们没有发现DASMybpc1在这块肌肉的外显子3处，可能是由于腓肠肌中B40包涵体的大小比股四头肌小。

我们开始描述DAS在小鼠后肢肌肉对微重力的转录组反应中的作用;然而，这里提出的工作也为DGE和DAS之间的相互关系提供了更广泛的新见解。共转录剪接早在30年前就被首次记载。84]，此后，DGE和DAS偶联的分子机制已被阐明，包括通过转录伸长率调节剪接[85]和核小体定位对剪接因子募集的调节[86]和组蛋白修饰[87］．此外，最近的研究表明，在转录机制中pre-mRNA出现时，RNA聚合酶II和剪接体之间存在直接的物理联系[88］．总之，这些证据表明，这些不同的转录组调节机制(转录和剪接)是复杂相关的。虽然人们认为这种复杂的关系是由组织特异性的调节因子调节的，但DGE和DAS要么是在一个单一的生物系统中一起研究的[89，90]或分别横跨多个生物系统[91，92］．因此，目前为止还没有将DGE和DAS一起跨多个生物系统进行全面的研究。我们的结果显示，在微重力暴露9周后，腓肠肌和股四头肌的转录组分别偏向于通过DGE和DAS进行适应(见图。3.)．这一观察结果首次证明了DGE和DAS之间可能存在相互的、肌肉类型特定的关系，即每个肌肉优先使用一种转录组调节机制，而牺牲另一种机制。

我们假设，我们确定的肌肉类型特定的调节偏差表明了每块肌肉的能量可用性差异。虽然有人提出能量可用性影响转录组调控模式，但直到最近才发现DGE和DAS的模式在高能量和低能量环境中有所不同[93]由于萎缩骨骼肌中线粒体腺嘌呤核苷酸的供应减少[94，95］．在更萎缩的股四头肌中，腺嘌呤核苷酸供应的潜在减少可能指导DAS的使用，DAS是一种能量依赖性较低的转录组调节模式，而DGE是一种能量依赖性较高的转录组调节模式[96，97］．相反，在萎缩程度较轻的腓肠肌中，腺嘌呤核苷酸的充足供应可能有利于DGE而不是DAS。为了检验这种可能性，对微重力诱导的肌肉萎缩的进一步研究应该比较不同骨骼肌类型的腺嘌呤核苷酸水平。

不管在长时间的太空飞行中，每个肌肉中优先使用转录组调控机制，我们发现，在骨骼肌中编码已知功能的蛋白质的转录本在微重力暴露9周后，腓肠肌和股四头肌中主要是交替剪接而不是差异表达(见图。4)．因此，虽然我们通过DGE确定了线粒体功能和脂质代谢的调节(见附加文件)5)，正如先前在太空飞行后的骨骼肌所描述的[19，20.，21]，我们认为DAS是一种修改转录组以响应微重力的新方法。此外，我们确定了拼接和微重力诱导的后肢肌肉生理适应的坐标变化，包括肌肉萎缩(见图2)。5而且6)和快速收缩函数的潜在展开式(见图。7)．最后，在微重力暴露9周后，我们在研究的后肢肌肉中都没有明显的RBPs DGE，我们发现了潜在的功能显著的，太空飞行诱导的RBPs本身的DAS(见图。8)，这是一种上游刺激，可能解释了我们在骨骼肌转录靶点中发现的下游剪接变化。总之，这些发现代表了骨骼肌对微重力的剪接变异和生理适应的首次平行观察。这些发现得到了来自微重力和非微重力环境模型的大量引用文献的支持，这些模型要么注释了类似的剪接-表型关联，要么通过扰动异构体特异性表达和描述肌肉生理学的下游变化来建立了因果剪接-表型关系。最终，我们的工作增加了越来越多的研究，证明了选择性剪接影响骨骼肌生理的力量和潜力，并为未来对选择性剪接骨骼肌基因产物的机制研究和骨骼肌对微重力的生理适应创造了资源。

除了我们工作的关联性(不一定是因果性)之外，我们也意识到我们的研究与设计相关的四个局限性，包括所使用小鼠的年龄、性别和品系以及我们实验的时间轴。首先，先前关于肌肉骨骼适应航天飞行的特征已经发生在航天飞行时8-20周大的小鼠身上[19，20.，98，99]，需要探究年龄(我们的实验使用了实验开始时30周大的小鼠)可能在产生我们观察到的肌肉表型和我们描述的转录组改变中所起的作用。虽然我们的小鼠比以前微重力研究中使用的小鼠相对更老，但我们发现的骨骼肌的生理适应与以前在年轻小鼠中表征的一致[19，98，99］．这是意料之中的，因为在正常重力下生活的小鼠至少要到两岁才会出现肌肉减少症[One hundred.］．对我们的工作更重要的是转录组调控模式与年龄之间的关系。虽然DGE和DAS的相对使用随年龄和机体发育而波动，但小鼠的这种波动大多发生在出生前后(直到大约出生后28天)[89］．此外，在小鼠和人类中都有证据表明，骨骼肌转录组在成年后甚至在晚年都相对稳定[101］．因此，我们所描述的转录组改变不太可能仅仅是所使用小鼠年龄的产物。事实上，对年轻小鼠微重力诱导的差异基因表达的研究[19，20.显示出代谢和线粒体通路的下调，这与我们在老年小鼠中发现的情况类似。因此，虽然DAS还没有在航天背景下得到充分的研究，但可以推测，无论年龄大小，都可以确定广泛的微重力诱导DAS。尽管如此，未来的研究将在不同年龄的小鼠中调查微重力诱导的DAS，这将为评估年龄依赖性转录组对长时间太空飞行的反应提供重要的背景。

第二，先前关于骨骼对太空飞行的转录组和生理适应的特征已经发生在女性[98]，男性[20.]，以及雌雄两种[99]小鼠，需要探究性别(我们的实验只使用了雌性小鼠)可能在产生我们观察到的表型和我们描述的转录组改变中所起的作用。在小鼠的肌肉生理学中有性别二态性的证据。具体来说，雌性小鼠往往有更多的I型(慢肌纤维)纤维含量[102]和更小的纤维CSA [103]而不是雄性小鼠。由于这些解剖差异，雌性小鼠在后肢卸载过程中更容易出现由慢到快的纤维类型改变和肌肉萎缩[104］．因此，与雄性小鼠相比，我们观察到的微重力诱导表型的量级可能被放大。对我们的工作更重要的是转录组调控模式和生物性别之间的关系。在小鼠模型中，选择性剪接的性别二态模式仅在子宫内性别决定时进行过分析[105］．在人类中，对男性和女性的骨骼肌转录组进行了全面的比较，发现在DGE和DAS水平上骨骼肌转录组存在显著的性别差异。女性富集的转录异构体与线粒体功能、酸和酮代谢、氧化和还原、细胞呼吸和脂肪酸代谢相关。相比之下，在细胞质和蛋白酶体中发现了雄性富集的转录异构体，富集的生物过程几乎都与蛋白质分解代谢有关[106］．最终，骨骼肌转录组的性别二态性表明，尽管在暴露于微重力的雌性和雄性小鼠中都可能发现DAS，但下游骨骼肌基因靶点可能是性别特异性的。未来对微重力诱导的雄性小鼠DAS的研究将为评估长时间太空飞行的转录组反应的性别差异提供重要的背景。

第三，许多先前的肌肉骨骼适应太空飞行的特征已经发生在C57BL/6小鼠[19，98，99]，需要探究菌株(我们的实验使用了BALB/c小鼠)可能在产生我们观察到的肌肉表型和我们描述的转录组改变中发挥的作用。与我们的小鼠年龄相对较大的讨论相似，我们确定的骨骼肌的生理适应与先前在C57BL/6小鼠中的特征一致[19，98，99]尽管有证据表明肌肉重塑的应变差异，尽管是非微重力环境[107］．对我们的工作更重要的是转录组调控模式和小鼠品系之间的关系。值得注意的是，最近对NASA GeneLab数据的多组学分析[108结果显示，C57BL/6小鼠在转录组水平上比BALB/c小鼠对太空飞行的反应更强烈，C57BL/6数据集的差异表达基因平均比BALB/c数据集多5 - 10倍。虽然Beheshti等人[108他们的工作仅限于肝脏的转录组研究，他们的发现与我们在暴露于微重力后在BALB/c股四头肌中发现的大约10倍少的差异表达基因一致(70个DGE基因;见图。3.)与Chakraborty等人的研究结果相比。[20.]在暴露于微重力后的C57BL/6股四头肌中发现(776个DGE基因)。尽管这些DGE的菌株特异性差异尚未在DAS的背景下进行研究，但现有的证据表明，与C57BL/6小鼠相比，BALB/c小鼠的转录组适应可能不那么深刻。未来对C57BL/6和BALB/c小鼠微重力诱导DAS的研究将为评估长时间太空飞行综合转录组反应的品系差异提供重要背景。

第四，先前关于肌肉骨骼适应太空飞行的特征通常发生在暴露于微重力2-4周后[19，20.，98]，需要探究时间(我们的样本是在微重力暴露9周后收集的)可能在产生我们观察到的肌肉表型和我们描述的转录组改变中发挥的作用。Cadena等人[109]发现肌肉萎缩是动态的，在微重力暴露2-4周后腓肠肌的萎缩达到顶峰，飞行小鼠和地面对照组小鼠的腓肠肌重量在第8周时没有显著差异。在微重力暴露9周后，我们观察到腓肠肌有统计学意义的萎缩，这可能表明我们的样本量更大(n= 10对n= 5)和/或我们使用不同的方法来测量萎缩(CSA减少与体重减轻)。与我们的发现一致的是，在微重力暴露长达13周后，慢肌和快肌以及屈肌和伸肌都出现了萎缩[99］．与Cadena等人的时间过程性质相反。109我们的工作，我们的学习和大多数其他人[19，20.，98，99]采用单一的，终端时间点的样本收集。这是微重力研究的一个系统性限制，由于飞行中样本收集、处理、处理和存储的能力有限，特别是在研究需要安乐死收集的组织时，如骨骼肌，对微重力的急性和动态适应往往没有得到重视。甚至像Cadena等人的时间课程研究。109]受到小样本量和非急性时间点的限制，因此在表达中的潜在动态趋势MuRF1而且MAFBx在微重力暴露的1、2、4和8周的腓肠肌中，两种特征良好的萎缩基因没有统计学支持。因此，有必要使用更大的样本和更早的时间点进行类似的研究。我们的希望是，在这里提出的工作将提供充分的理由来研究在长时间的太空飞行中，骨骼肌中DGE和DAS的急性和动态变化。

除了上面讨论的基于设计的限制之外，还有一些独立于我们的研究设计的变量可能会影响其结果，包括太空飞行小鼠和地面对照组之间潜在的行为差异。我们的小鼠是啮齿动物研究-5 (RR-5)任务的一部分，目前还没有正式的行为分析。然而，Ronca等人。110]分析了来自啮齿动物研究-1 (RR-1)任务的小鼠的行为，该任务使用了与RR-5相同的NASA啮齿动物研究硬件系统。Ronca等人[110]发现飞行小鼠和地面对照组小鼠的进食时间和飞行后体重都是相当的。虽然我们没有关于RR-5期间食物摄入的信息，但我们可以报告，与本研究中使用的不同队列的飞行小鼠在活体返回地球24小时后与地面对照组小鼠体重相当。因此，飞行对照组和地面对照组的食物摄入量可能相似，因此，这个变量预计不会影响我们的结果。此外，Ronca等人[110]在年轻小鼠(16周大)中观察到高水平的独特圆圈或“赛跑追踪”行为，而在老年小鼠(32周大)中观察到很少的赛跑追踪行为。虽然在RR-5期间没有正式分析种族跟踪，但在RR-5期间拍摄的视频观察表明，与Ronca等人类似。[110)的发现，我们的30周大的老鼠表现出一些但不是很多的种族追踪行为。因此，飞行控制组和地面控制组的活动模式可能有些不同，因此，这个变量预计会影响我们的结果，尽管影响很小。考虑到这种活动模式会在微重力下激活这里分析的肌肉，与在太空飞行中没有种族跟踪的情况下相比，我们观察到的表型的量级可能会减弱。

总之，我们已经证明，在9周的太空飞行后(i) DAS和DGE以相互的方式变化，可能是对组织特异性能量可用性的反应，(ii)编码骨骼肌蛋白的转录本主要是差异拼接而非差异表达，这表明DAS在调节后肢肌肉对微重力的转录组反应方面比DGE发挥更重要的作用。(iii) DAS事件与微重力下腓肠肌和股四头肌的生理变化有关，包括肌肉萎缩和快速收缩功能能力的潜在扩张;反式- DAS的调控因子，本身在无差异表达时被差异拼接。总之，我们的工作结果强调了DAS在确定微重力条件下骨骼肌转录组的可塑性和功能状态方面的重要性。这一知识是重要的，因为它允许识别新的潜在靶点进行治疗干预。具体来说，各种小分子剪接调节剂最近已被批准用于治疗萎缩性神经肌肉疾病，如脊髓性肌萎缩和肌肉营养不良。这些疗法作为剪接开关寡核苷酸，促进外显子的包含(SMN显子7,nusinersen [111)或跳过外显子(DMD外显子51,eteplirsen [112];DMD外显子53,golodirsen [113]和viltolarsen [114])，从而产生功能更好的蛋白质，与肌肉疾病症状和体征的改善有关。最终，微重力诱导的DAS的进一步表征将指导寻找基于小分子剪接调剂的治疗方法，以减轻微重力诱导的肌肉萎缩、纤维类型改变和其他相关的、对长时间太空飞行有害的生理适应。

支持这项研究结果的数据公开可在基因表达Omnibus在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE178822．

DGE:

差异基因表达

DAS:

差分可选拼接

MyHC:

肌球蛋白重链

美国国家航空航天局(NASA):

美国国家航空航天局

RBP:

rna结合蛋白

为:

可变剪接

SE:

跳过外显子

得到:

互斥外显子

RNA-seq:

RNA-sequencing

PBS:

磷酸盐

弹道导弹防御:

骨密度

肯尼迪:

肯尼迪航天中心

空间站:

国际空间站

CRS:

商业补给服务

术语:

终端

加州大学洛杉矶分校:

加州大学洛杉矶分校

客服人员:

横截面积

TCGB:

基因组学和生物信息学技术中心

PSI:

特定外显子的拼接百分比

投产:

备选5 '拼接位置

A3SS:

可供选择的3 '拼接位置

国际扶轮:

保留基因内区

走:

基因本体论

罗斯福:

错误发现率

原子能委员会:

3-Amino-9-ethylcarbazole

舰队指挥官:

褶皱变化

△PSI:

特定外显子拼接百分比的变化

非洲联合银行:

Ubiquitin-associated

UBL:

Ubiquitin-like

PEVK:

Pro-Glu-Val-Lys

SVR:

拼接可变区域

Ca^{2 +}：

钙

ZF:

锌指

3:

由40个碱基对组成的脑特异性外显子

M43:

由43个碱基对组成的肌肉特异性外显子

TSS:

平移起始点

RR5:

啮齿动物研究

RR1:

啮齿动物Research-1

这项工作得到了Yi Xing博士的贡献和他在宾夕法尼亚儿童医院实验室的资源的支持。此外，我们感谢整个NASA啮齿动物研究小组，所有NASA支持人员，以及国际空间站上的宇航员。最后，我们感谢加州大学洛杉矶分校骨骼生物学家雷切尔·克罗斯比博士和克里斯汀·斯坦斯-里德博士提供的见解和指导。

这项工作部分由空间科学促进中心(GA-2014-154)和国家卫生研究所/国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所(R01AR066782, R01AR068835和R01AR061399)资助。

作者指出

1. Mason Henrich, Pin Ha和Yuanyuan Wang对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 加州大学分子、细胞与发育生物学系，615 Charles E Young博士S室446，洛杉矶，CA, 90095, USA

   梅森·亨利克和约翰·s·亚当斯

2. 美国加州大学洛杉矶分校整形重建外科外科

   Pin Ha和Chia Soo

3. 生物信息学IDP，加州大学洛杉矶分校，美国

   王渊源

4. 福赛斯研究所，剑桥，马萨诸塞州，美国

   康停

5. 美国科罗拉多大学博尔德分校生物服务空间技术航天工程科学系

   路易Stodieck

6. 美国加州大学洛杉矶分校矫形外科

   约翰·s·亚当斯和雷内·春

贡献

K.T.和C.S.获得了资金。k.t.、l.s.、c.s.、j.s.a.和R.C.对项目及其方法进行了概念化。P.H.进行了动物实验。M.H.和Y.W.进行了RNA测序分析和解释。M.H.撰写了主要的手稿文本，并准备了图表。m.h.、p.h.、y.w.、l.s.、c.s.、j.s.a.和R.C.审阅并编辑了手稿。所有作者都阅读并认可了当前形式的手稿。

相应的作者

对应到梅森亨利克先生．

伦理批准并同意参与

所有的动物程序都是根据加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会的指导方针(议定书# 2009-127)以及国际空间站和堪萨斯大学sc机构动物护理和使用委员会的指导方针进行的。

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

K.T.和C.S.是nell -1相关专利的发明者。他们是Bone Biologics Inc./Bone Biologics Corp.的创始人和/或前任董事会成员，该公司从UC董事那里转授权Nell-1专利。他们还持有该公司的股权。所有其他作者都没有潜在的利益冲突需要披露。

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