GDF-11在小鼠生殖系中肌肉生长抑制素的功能性替代

背景

肌生长抑制素(MSTN)是一种转化生长因子ß超家族成员，是骨骼肌质量的主要调节因子。GDF-11与MSTN高度相关，在胚胎发育过程中发挥多种作用，包括调节中轴骨架、肾脏、神经系统和胰腺的发育。由于MSTN和GDF-11具有高度的氨基酸序列一致性，在细胞培养实验中表现几乎相同，并利用相似的调控和信号传导成分，一个关键的问题是，它们不同的生物学功能是由于它们与特定调控和信号传导成分相互作用能力的内在差异造成的，还是它们不同的生物学功能主要反映了它们不同的时空表达模式。

方法

我们生成并鉴定了小鼠，我们精确地在种系中替换了Mstn基因编码成熟的c端肽与相应的区域Gdf11．

结果

在敲入等位基因纯合的小鼠中，所有循环的MSTN蛋白都被GDF-11取代，导致循环的GDF-11水平增加了30 - 40倍。纯合子敲入等位基因的雄性小鼠肌肉重量略有下降，高脂肪饮食导致体重增加略有增加，血浆胆固醇和高密度脂蛋白水平略有增加，骨密度和骨量显著下降，而雌性小鼠大多不受影响。

结论

GDF-11似乎能够几乎完全在功能上取代MSTN控制肌肉质量。用GDF-11取代MSTN的发育和生理后果非常有限。

肌生长抑制素(Myostatin, MSTN)是转化生长因子-ß (TGF-ß)超家族成员，通常起限制骨骼肌质量的作用[1］．缺乏MSTN的小鼠全身肌肉质量显著增加，单个肌肉生长到正常大小的两倍左右。MSTN在进化中高度保守[2]，以及基因中自然发生和工程突变MSTN基因也已被证明在许多其他哺乳动物中导致肌肉质量和/或功能的增加[2，3.，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16]， fish [17，18，19]，和avian [20.，21)的物种。MSTN的缺失会导致发育过程中形成的肌肉纤维数量增加，以及单个纤维的大小增加[1］．出生后，MSTN由肌纤维产生[1]，在血液中循环[22]，并将信号传回肌纤维以限制生长[23，24］．基于MSTN的这种出生后功能，许多制药和生物技术公司已经开发了MSTN抑制剂，这些抑制剂已在肌肉和代谢疾病患者的临床试验中进行了测试(请参阅参考文献)。25])。

GDF-11，最初是用Mstn作为探针[1]，是一种高度相关的TGF-ß家族成员，在蛋白的成熟部分与MSTN约90%相同[26，27］．小鼠的基因靶向研究表明GDF-11的功能与MSTN不同。在胚胎发生过程中，GDF-11已被证明可以调节轴骨的前后模式[28]以及肾脏的发育[29]，胰腺[30.，31]，以及神经系统[32，33，34］．虽然表型Mstn^−−/而且Gdf11^−−/小鼠似乎大多不重叠，这两个基因已被证明至少部分功能冗余的前后轴模式[35］．我们对GDF-11的成人功能知之甚少，因为Gdf11^−−/小鼠在出生后24小时内死亡。

MSTN和GDF-11在细胞培养检测中几乎难以区分，并且也有许多共同的调控和信号传导机制和成分。MSTN是以前体形式合成的，在蛋白水解过程之后，作为实际信号分子的c端二聚体以非共价的方式以非活性的潜在状态与前肽结合[36，37］．金属蛋白酶BMP-1/tolloid家族成员对前肽的蛋白水解裂解可激活MSTN潜在复合体[38]，这似乎是在体内起作用的主要机制[39］．同样，GDF-11的c端二聚体和前肽也形成一个潜在的复合物，可被BMP-1/甲样体蛋白酶激活[40］．MSTN也受到细胞外其他结合蛋白的调控，包括卵泡抑素(FST) [36]， fstl-3 [41]、gas -1和gas -2 [42］．基因研究表明，FST的缺失[43，44，45]和/或gas -1/ gas -2 [46]导致肌肉质量下降，纤维类型改变，这与它们在体内抑制MSTN的作用一致。这些结合蛋白也能抑制GDF-11，缺乏FST的小鼠[43]或GASP-1/GASP-2 [46]也表现出与GDF-11活性增加一致的轴向图形缺陷。最后，当没有抑制性结合蛋白时，MSTN能够结合2型受体ACVR2和ACVR2B [36]，以及1型受体ALK4和ALK5 [47］．在小鼠中靶向这些受体会导致肌肉质量增加，这与这些受体在体内介导MSTN信号传导中发挥的关键作用一致[24，48］．GDF-11能够与这些受体结合Acvr2而且Acvr2b突变小鼠出现轴向图案和肾脏缺陷[49，50，51，52，53]类似于Gdf11突变体。

鉴于MSTN和GDF-11具有高度的氨基酸序列一致性，在细胞培养实验中表现几乎相同，并利用相似的调控和信号传导成分，一个关键的问题是，它们不同的生物学功能是由于它们与特定调控和信号传导成分相互作用能力的内在差异造成的，还是它们不同的生物学功能主要反映了它们不同的时空表达模式。鉴于MSTN和GDF-11都在血液中循环，另一个关键问题是这些配体是局部作用还是系统作用于向靶细胞发出信号。遗传学研究表明，MSTN具有自分泌/旁分泌和内分泌两种作用模式[54]，尽管人们对GDF-11在成年动物中的功能及其作用模式知之甚少。尽管任一MSTN [22]或GDF-11 [55，56]已被证明可在成年小鼠中诱导恶病质样综合征，至少有一项研究报告了外源给予小鼠MSTN和GDF-11蛋白的明显效果，这表明这两种分子可能在生物学特性上存在内在差异[57］．在这里，我们解决了这两个分子的功能等价替换的部分Mstn基因编码其成熟结构域的相应部分Gdf11在老鼠的生殖系中。

所有的动物实验都是按照康涅狄格大学医学院和约翰霍普金斯大学医学院的动物护理和使用委员会批准的协议进行的。产生小鼠携带aMstn^Gdf11敲入等位基因，靶向结构被电穿孔到胚胎干细胞(ES)细胞，携带同源靶向等位基因的ES细胞被注射到囊胚中。从这些囊胚产生的嵌合小鼠被培育以识别那些表现出生殖系传播的目标等位基因。这些交配的后代然后与EIIa-Cre转基因小鼠[58]，以删除种系中的新霉素抗性盒。从这些十字架中，我们得到了携带Mstn^Gdf11敲入等位基因缺乏新卡带。

采用液相色谱-串联质谱法测定循环MSTN和GDF-11水平，如所述[59］．在GDF-11试验中没有检测到MSTN的交叉反应，在MSTN试验中也没有检测到GDF-11;加入高达100 ng/mL的GDF-11对GDF-8的测量没有显著影响，加入高达100 ng/mL的GDF-8对GDF-11的测量没有影响。GDF-8和GDF-11的定量下限均为0.5 ng/mL。两种检测方法的线性范围为0 ~ 100 ng/mL。MSTN检测在低(8.7 ng/mL)、中(51.1 ng/mL)和高(97.6 ng/mL)质量控制池中的检测间变异系数分别为15.1%、11.3%和7.4%，GDF-11检测在低(3.4 ng/mL)、中(52.0 ng/mL)和高(104.7 ng/mL)质量控制池中相应的cv分别为8.7%、12.8%和17.1% [59］．

为了测量肌肉重量，从10周大的小鼠两侧解剖单个肌肉，每块肌肉使用平均重量。用低温恒温器从腓肠肌最宽处横向切取连续切片(15 μm)。纤维类型分析使用Schiaffino等人开发的抗体(BA-D5、SC-71和BF-F3分别针对肌凝蛋白重链I型、IIa型和IIb型)进行。[60]，并从发育研究杂交瘤库中获得，杂交瘤库是在国家儿童健康和人类发展研究所的赞助下开发的，由爱荷华大学维护。使用Piximus双能x线吸收仪(DXA)进行活体动物成像。葡萄糖耐量试验(GTT)是在禁食6小时后腹腔注射1g葡萄糖/kg体重。然后将小鼠置于60千卡%脂肪饮食(D12492, Research dietary, Inc.)，并在4周后进行重复GTT;然后，小鼠继续保持高脂肪饮食4周。为了分析骨骼模式，新生小鼠被安乐死，剥皮，去内脏，在80%乙醇中固定，在95%乙醇中脱水1天，在丙酮中脱水3天。骨骼在含有0.003%茜素红和0.0045%阿利新蓝的10%乙酸乙醇中染色36小时。染色后，骨骼在1%氢氧化钾中清除，并在几天内转移到20%、50%、80%和100%甘油中。为了进行显微ct分析，将左股骨、左肱骨和腰椎置于70%乙醇中。μCT在8 μm的Scanco μCT40中进行^3.决议。样品在55% kVp、145 μA强度、300 ms的70%乙醇中扫描。仪器每周使用Scanco幻影进行校准，所有扫描都通过了常规质量控制验证。采用标准方案进行骨骼分析，股骨小梁的阈值较低，为2485 HU，股骨皮质为4932 HU，椎骨小梁为3078 HU [61］．根据这些阈值生成相应的表面效果图。对于所有数据，使用Student 's进行统计显著性评估t测试。

作为确定MSTN和GDF-11之间是否存在可导致体内不同生物活性的根本固有差异的一种方法，我们分析了在种系中用GDF-11取代MSTN的效果。如图所示。1,Mstn该基因包含三个外显子，成熟的c端结构域编码在外显子3内。我们生成了一个靶向结构，其中我们精确地替换了MSTN c端结构域的编码序列，从糠醛蛋白水解处理位点开始，编码GDF-11 c端结构域。因此，这个敲入等位基因(Mstn^Gdf11)编码由MSTN前肽和GDF-11 c端结构域组成的混合前体蛋白，经过蛋白水解处理后，成熟的GDF-11信号分子将在通常产生MSTN的地方产生。已有研究表明MSTN前肽能够结合并抑制GDF-11 c端二聚体[37]，因此我们的预期是来自该杂交蛋白的MSTN前肽能够像成熟的MSTN一样，将成熟的GDF-11 c端二聚体保持在潜伏状态[36］．在胚胎干细胞中进行同源重组，将目标细胞注射到囊胚中，并将囊胚转移到假怀孕的雌性，我们获得了转移敲入等位基因的嵌合小鼠(Mstn^Gdf11)通过生殖细胞。在使用种系表达的cre转基因去除新卡带后[58]，在分析之前，我们将5代敲入等位基因回交到C57BL/6遗传背景上。

Mstn^{Gdf11 / Gdf11}小鼠是可存活的，我们在10周大的小鼠上进行了所有分析Mstn^+/+，Mstn^{+ / Gdf11},Mstn^{Gdf11 / Gdf11}我们从杂交中培育出的老鼠Mstn^{+ / Gdf11}老鼠。我们首先使用针对每种蛋白质高度特异性的液相色谱-串联质谱分析方法测量了这些小鼠血浆中的MSTN和GDF-11蛋白水平[59］．如图所示。2，野生型小鼠循环MSTN和GDF-11水平分别在~ 150 ng/ml和~ 4 ng/ml范围内。老鼠携带Mstn^Gdf11等位基因中MSTN和GDF-11的循环水平与MSTN完全被GDF-11取代一致。特别是,Mstn^{Gdf11 / Gdf11}小鼠没有检测到循环的MSTN，其循环的GDF-11水平与正常的MSTN水平相当，比正常循环的GDF-11水平高约30 - 40倍。Mstn^{+ / Gdf11}小鼠的两种蛋白质都处于中间水平。

为了确定GDF-11是否可以在功能上替代MSTN，我们首先检查了体成分。在10周龄小鼠中，总体重和瘦体重(通过DXA分析)显示出小的(~ 6-8%)下降，但具有统计学意义Mstn^{Gdf11 / Gdf11}相比Mstn^+/+在雄性小鼠，而不是雌性小鼠(表1)。与这些瘦体重的减少相一致的是Mstn^Gdf11等位基因对男性肌肉质量有剂量依赖效应，个体肌肉为Mstn^{Gdf11 / Gdf11}小鼠体重大约比对照组轻10%Mstn^+/+老鼠和Mstn^{+ / Gdf11}表现出中间效应的小鼠(表2）;肌肉重量的差异Mstn^{Gdf11 /Gdf11}而且Mstn^+/+雌性小鼠没有统计学意义。事实上肌肉重量并没有增加Mstn^{Gdf11 / Gdf11}这表明GDF-11可以在负向调节肌肉质量方面替代MSTN。此外，权重略有下降的事实表明，由该敲入等位基因产生的GDF-11甚至可能比内源性MSTN更活跃。我们还进行了纤维类型的分析，如损耗Mstn已被证明会导致更多糖酵解2B纤维的转变[62］．如图所示。3.A和表格3.，我们没有发现纤维类型分布的差异Mstn^{Gdf11 /Gdf11}而且Mstn^+/+老鼠。

除了调节肌肉质量外，MSTN还调节脂肪质量方面的身体成分Mstn^−−/老鼠(63]以及MSTN受体(ACVR2和ACVR2B)在肌纤维中被靶向的小鼠[24从而降低全身脂肪总量。经DXA分析，两组总脂肪含量无明显差异Mstn^{Gdf11 / Gdf11}相比Mstn^+/+老鼠(表1)。此外，我们发现敲入小鼠的血浆瘦素水平与敲入小鼠相比没有显著差异野生型老鼠。Mstn^−−/研究还显示，当小鼠被置于高脂肪饮食中时，其体重增加较少[64]，在小鼠中也有发现Acvr2而且Acvr2b都是针对肌纤维的24］．如图所示。3.B,男Mstn^{Gdf11 / Gdf11}实际上，老鼠的体重增加比Mstn^+/+虽然瘦素水平在两组之间相似Mstn^{Gdf11 / Gdf11}而且Mstn^+/+即使在高脂肪饮食8周后，小鼠仍然可以食用1）;在喂食高脂肪食物的雌性小鼠中，体重增加或瘦素水平没有明显差异。我们还观察到男性血浆胆固醇和高密度脂蛋白水平有微小但显著的增加Mstn^{Gdf11 / Gdf11}小鼠保持标准饮食相比Mstn^+/+小鼠(分别增加19%和18%)以及高脂肪饮食8周后(分别增加24%和15%)(表1)。男性的LDL、甘油三酯或游离脂肪酸水平没有差异Mstn^{Gdf11 / Gdf11}雌性小鼠或任何一种脂质水平Mstn^{Gdf11 / Gdf11}老鼠。因此，尽管在雄性突变小鼠的骨骼肌质量和高脂肪体重增加方面都有一些微小的差异，但用GDF-11替换MSTN成熟结构域对整体身体构成的影响很小。

MSTN-GDF-11调节系统也已知对葡萄糖代谢有影响。特别是,Mstn^−−/尽管胰岛素水平较低，小鼠仍能维持正常或较低的血糖水平[24，63］．此外，已知GDF-11在胰腺发育中发挥重要作用[30.，31]，而小鼠服用GDF-11蛋白(而非MSTN蛋白)已被证明可改善葡萄糖耐量[57］．如表所示1的空腹血糖水平略高Mstn^{Gdf11 / Gdf11}女性相比Mstn^+/+对照组保持标准饮食，但在标准饮食的雄性小鼠或保持8周高脂肪饮食的雄性或雌性小鼠中，没有发现统计学上的显著差异。此外,Mstn^{Gdf11 / Gdf11}而且Mstn^+/+在葡萄糖耐量试验中，小鼠对葡萄糖挑战表现出类似的反应，无论是保持标准饮食的小鼠还是保持4周高脂肪饮食的小鼠。3.C).因此，GDF-11完全替代MSTN似乎对葡萄糖代谢影响很小。

除了分析GDF-11能否在功能上替代MSTN外，我们还研究了这些小鼠中GDF-11表达的增加是否会影响已知由GDF-11调节的其他生物学过程。特别地，我们检查了中轴骨模式是否受到影响Mstn^{Gdf11 / Gdf11}老鼠。先前的研究表明，GDF-11的缺失导致轴向骨骼的前定向同型异型转化[28] GDF-11抑制剂的缺失，特别是FST和/或GASP-1/GASP-2，导致后向转化[43，46］．25个野生型和30个阿利新蓝染色骨架的分析Mstn^{Gdf11 / Gdf11}在55只新生小鼠中，7个颈椎，13个胸椎和6个腰椎显示正常模式。此外，在颈椎区，所有小鼠的C6上都存在前结核，在胸椎区，所有小鼠的前7根肋骨都附着在胸骨上，后6根肋骨保持漂浮。因此，轴向骨图型似乎是正常的Mstn^{Gdf11 / Gdf11}并没有表现出可能由GDF-11过量活动导致的后定向同型异型转化。

最后，我们检查了骨头Mstn^{Gdf11 / Gdf11}老鼠。Mstn^−−/据报道，小鼠骨密度增加[65]，这可能是肌肉增加的次要影响。GDF-11在调节骨稳态中的作用一直存在争议，一项研究报告了成年小鼠外源性给药GDF-11后骨密度下降[66]，另一项研究报告称，骨量下降不仅发生在新生儿身上Gdf11在无效小鼠和年轻成年小鼠中，他莫西芬诱导的crec介导的重组被用于靶向aGdf11^液氧等位基因(67］．无论GDF-11在骨中发挥何种具体作用，以MSTN/GDF-11/激活素A信号通路为靶点，无论是在药理学上使用ACVR2的诱饵形式[68]或ACVR2B [69，70，71，72，73或者通过基因定位Acvr2/Acvr2b［74]或Alk4/Alk5［45]已被证明会导致骨量和骨密度的显著增加。为了评估敲入等位基因对骨骼的可能影响，我们首先用DXA评估骨密度。如表所示1时，我们观察到全身骨密度有轻微(~ 5%)但显著下降Mstn^{Gdf11 / Gdf11}与雄性小鼠相比Mstn^+/+控制老鼠。在身体的多个区域，包括上肢和下肢长骨以及腰椎，都存在类似的差异，但在雌性小鼠中没有发现差异。为了更详细地分析骨结构，我们对肱骨、股骨和腰椎进行了显微ct分析。如表所示4和无花果。4时，骨表面、BV/TV、连通性密度、小梁数、小梁厚度、骨密度等众多显微ct参数均显著降低Mstn^{Gdf11 / Gdf11}相比Mstn^+/+雄性老鼠;例如，股骨的BV/TV和骨密度分别降低了43%和48%，肱骨分别降低了26%和34%，L5椎分别降低了19%和22%。与DXA数据一致，女性显微ct参数的唯一显著差异是L5椎体BV/TV和骨密度的小幅下降(分别减少8%和9%)。

从这里给出的结果来看，两个普遍结论似乎很明显。首先，成熟的GDF-11似乎能够在控制肌肉质量方面完全取代成熟的MSTN;事实上，根据肌肉量的轻微减少可以看到Mstn^{Gdf11 / Gdf11}在雄性小鼠中，由敲入等位基因制成的成熟GDF-11实际上似乎比成熟的MSTN在控制肌肉质量方面更活跃。在雄性小鼠中，与野生型等位基因表达导致的循环MSTN水平相比，我们确实观察到由敲入等位基因表达导致的循环GDF-11水平更高的趋势，但这些差异在统计学上不显著。在携带敲入等位基因的小鼠中，这种增强的活性可能反映了成熟MSTN与成熟GDF-11生物学特性的内在差异，或者潜在MSTN复合体与成熟GDF-11结合到MSTN前肽的混合潜在复合体的激活水平的差异。其次，成熟的GDF-11完全取代成熟的MSTN并不会导致GDF-11过表达所预期的一些发育或生理变化。发育,Mstn^{Gdf11 / Gdf11}小鼠表现出完全正常的轴向骨骼模式。考虑到这一点，这可能并不令人惊讶Gdf11而且Mstn在胚胎发生过程中有不同的表达模式，与Gdf11在妊娠中期胚胎尾芽和原始条纹区表达[28),Mstn在发育体细胞的肌隔室中表达[1］．尽管有这些不同的表达模式，然而，已知这两个基因在轴向模式方面有部分功能冗余Gdf11/Mstn双突变体表现出更广泛的前定向同型异型转化Gdf11单个突变体[35］．因此，正常的骨骼形态在Mstn^{Gdf11 / Gdf11}结果表明，成熟的GDF-11和成熟的MSTN在轴向模式调控方面具有相似的生物活性。生理上,Mstn^{Gdf11 / Gdf11}小鼠的循环GDF-11水平增加了30 - 40倍，但葡萄糖代谢似乎相对正常。根据报道，纯化的GDF-11可改善糖耐量，而MSTN不能改善[57，人们可能会这样想Mstn^{Gdf11 / Gdf11}与野生型小鼠相比，小鼠对葡萄糖挑战的反应有所改善，但我们没有观察到显著差异Mstn^{Gdf11 / Gdf11}野生型小鼠在标准或高脂肪饮食的糖耐量测试中。在高脂肪饮食的小鼠的糖耐量测试中，我们确实观察到了葡萄糖值降低的趋势，但这些差异在统计上并不显著，事实上，Mstn^{Gdf11 / Gdf11}实际上，雌性小鼠的空腹血糖水平略有升高，具有统计学意义。

用GDF-11替换MSTN后，一个组织受到了实质性的影响，即骨组织Mstn^{Gdf11 / Gdf11}BV/TV、小梁数量、小梁厚度和骨密度显著降低的小鼠，至少在雄性中是如此。尽管关于GDF-11在骨调节中的作用有相互矛盾的报道，但GDF-11的表型Mstn^{Gdf11 / Gdf11}在小鼠中，使用激活素2型受体的诱饵形式在药理学上阻断这一途径所观察到的效果是一致的[68，69，70，71，72，73或者基因定位Acvr2/Acvr2b［74]或Alk4/Alk5［45在成骨细胞中。骨量的减少Mstn^{Gdf11 / Gdf11}这与由杂交前体蛋白合成的GDF-11比内源性MSTN更活跃的可能性是一致的，正如在敲入小鼠中看到的肌肉质量轻微下降所表明的那样。或者，骨表型可能是由GDF-11水平本身增加引起的，这可能反映了GDF-11和MSTN在调节骨骼能力方面的内在差异。

在解释这些研究结果时，重要的是要记住不仅GDF-11是在控制下表达的Mstn而且GDF-11蛋白是由含有MSTN前肽的混合前体蛋白制成的。虽然MSTN前肽和GDF-11前肽都能结合成熟的GDF-11，并被BMP-1/tolloid蛋白酶裂解以激活潜伏期[37，38，40]，这些前肽可能具有不同的特性，在MSTN与GDF-11执行的生物功能方面赋予了一定程度的特异性。因此，需要进行额外的实验，例如用GDF-11前肽替换MSTN的种系前肽，或者用MSTN的相应部分反向替换GDF-11前肽和/或成熟结构域，以充分了解这些分子的各种结构域在功能上的等效程度。

在目前围绕GDF-11在体内生物活性的不确定性的背景下，我们的发现具有重要意义。一系列论文表明，GDF-11可能在组织衰老中发挥关键作用。据报道，小鼠体内循环的GDF-11水平随着衰老而下降[75]，而向老年小鼠注射纯化的GDF-11蛋白被证明可以逆转年龄相关的心脏肥厚[75]，刺激老年小鼠神经系统血管重塑，促进神经发生[76]，并改善衰老小鼠的卫星细胞功能及肌肉再生和功能[77］．这些研究表明，将GDF-11水平恢复到年轻水平可能是一种新的治疗策略，可以在广泛的组织中预防或逆转与年龄相关的组织功能障碍。其他一些研究没有发现GDF-11水平在衰老过程中下降。随后的研究表明，用于测量循环中GDF-11水平的测定方法可能已经检测到了循环中的MSTN，并且GDF-11水平在衰老过程中要么没有变化，要么甚至可能增加[59，78，79］．关于GDF-11促进肌肉再生的报道也不确定;考虑到MSTN信号的丢失或抑制已被证明在急性肌肉损伤和慢性肌肉退行性变的情况下可以改善肌肉再生，这一发现是出乎意料的(综述，参见参考文献[80，81，82])。事实上，随后的研究报告称，给小鼠注射纯化的GDF-11会损害肌肉再生的能力[78，83]，这更符合MSTN和GDF-11在体外生物学特性上几乎无法区分的事实。虽然实验程序和剂量方案的差异可能导致研究结果的差异，外源性给药GDF-11可能与内源性产生的MSTN表现不同，但我们的发现与GDF-11能够在体内功能取代MSTN一致。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

MSTN:

肌肉生长抑制素

TGF -ß:

转化生长因子-ß

ES:

胚胎干细胞

测定仪:

双能x射线吸收率仪

GTT:

葡萄糖耐量试验

胡:

Hounsfield单位

我们感谢安·劳勒和查尔斯·霍金斯在约翰·霍普金斯转基因核心实验室进行的ES细胞转染和囊胚注射，以及杰克逊实验室临床化学服务对血浆瘦素、胰岛素和血脂水平的测量。

本出版物中报道的研究得到了NIH拨款R01AR060636(给S-J.L.)， R01AG052962(给S-J.L.)， R56AG052972(给SB)以及Neil Esposito和Donna Hughes 1型糖尿病基金(给E.L.G-L.)和Bessette家族1型糖尿病基金(给E.L.G-L.)的慷慨捐赠。在约翰霍普金斯大学时，s。得到了布朗咨询公司合伙人迈克尔·汉金和安·汉金以及詹姆斯·希金斯和朱丽叶·希金斯的慷慨捐赠。

作者及隶属关系

1. 杰克逊基因组医学实验室，美国康涅狄格州法明顿

   李世真，亚当·莱哈尔，刘叶伟

2. 美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学医学院遗传与基因组科学系

   该大学

3. 美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学医学院骨科

   Renata Rydzik和Daniel W. Youngstrom

4. 美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆妇女医院布里格姆研究化验核心实验室

   Shalender哈

5. 男性健康研究计划:衰老和代谢，波士顿克劳德·d·佩珀老年美国独立中心，布里格姆妇女医院，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞州，美国

   Shalender哈

6. 美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学医学院儿科

   Emily L. Germain-Lee

7. 美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学牙科医学院重建科学系，再生医学与骨骼发育中心

   Emily L. Germain-Lee

8. 美国康涅狄格儿童医院内分泌科、糖尿病科和罕见骨疾病中心

   Emily L. Germain-Lee

贡献

主持实验:S-JL、AL、RR、YL。管理项目:S-JL、DWY、SB、ELG-L。撰写论文:S-JL, SB, ELG-L。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到该大学．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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