会议报告:2021年FSHD国际研究大会

面部肩胛肱肌营养不良症(FSHD)是第二常见的遗传性肌病，其特征是进展缓慢和高度异质性的肌肉萎缩，典型发病于青少年晚期/成年早期[1］．虽然FSHD 1型和2型的病因都归因于DUX4异常表达引起的毒性获得功能，但涉及肌肉萎缩的确切致病机制尚未阐明[2- - - - - -4］．2021年FSHD国际研究大会于6月24日至25日举行，召集了350多名研究人员和临床医生，分享了对疾病机制理解的最新进展，讨论了干预策略的扩散和临床结果测量的改进，包括ReDUX4试验的结果，这是losmapimod在FSHD中的2b期临床试验[NCT04003974]。

大会的每一天都以主题演讲开始，然后是关于特定领域的专门会议。第一天，Russell Butterfield(犹他大学)发表了“FSHD在犹他州的一个大家族的历史:80多年的参与的成果”，回顾了19世纪移民到犹他州的一个基因携带者的> 2000 FSHD后代的临床表现[5，6］．这种亲缘关系代表了一种独特的资源，可以识别FSHD的遗传修饰因子，并开发针对这些遗传修饰因子识别的关键途径的治疗方法。迄今为止进行的研究表明，所有受影响的家族成员都携带一个20kb(6单元)的D4Z4重复序列，证实了创始人突变的减数分裂稳定性[5］．2018年，dr。巴特菲尔德和韦斯(都在犹他大学)与查尔斯·爱默生和马萨诸塞大学威尔斯通肌肉营养不良合作研究中心合作，开始了一项基因修饰剂研究，以验证创始人突变的临床严重程度可以被普通遗传变异修改的假设。在这项研究中，收集了来自Kindred 1462 (K-1462)的566个DNA样本，其创始人突变已经分离了至少170年，临床数据收集了超过80年。对来自K-1462的4个个体的初步全基因组测序发现了4个与风险单倍型相关的罕见单核苷酸多态性(SNPs)，但需要更高分辨率的方法来进一步表征表型。为此，我们建立了一种使用纳米孔单分子测序的靶向富集方法(Quentin Gouil在第二部分中对此进行了更详细的讨论)。未来的步骤包括使用DNA微阵列研究未连接修饰剂的全基因组关联研究，以及使用纳米孔测序研究已连接和未连接修饰剂的关联研究。目前正在从亲属中招募更多的家庭成员。

第二个主题演讲由Stephen Tapscott (Fred Hutch癌症研究中心)进行，并探讨了FSHD中的免疫反应方面。先前的一些研究表明，补体系统参与了FSHD，包括FSHD肌肉和C5b-9的肌层复合沉积中存在活化的膜攻击复合物。编码补体蛋白的rna在FSHD进展过程中轻度上调，培养中表达dux4的细胞的分泌组显示了补体蛋白的存在。对补体作为FSHD生物标志物的探索表明，C3和C4b在FSHD人群中显著升高，而包括四种补体蛋白的综合评分显示有希望作为FSHD生物标志物，并支持补体激活在FSHD中的作用。来自脉动DUX4表达系统的证据指向一个模型，其中DUX4表达免疫原性蛋白及其抑制MHC I类抗原呈递导致波动免疫反应，最终可能导致FSHD病理。

研究表明，即使短暂接触DUX4也可能引发FSHD肌肉中与毒性相关的自我维持的分子和病理级联[7］．关于DUX4的内源性调控因子还有很多有待了解的地方，它们有可能被操纵以获得治疗益处，而单细胞/细胞核转录组分析的快速进展正在阐明DUX4在FSHD肌肉原生环境中特定细胞类型中的重要作用。

尽管DUX4被广泛认为是FSHD的关键触发因素，但在成人肌肉活检组织中很难检测到这种蛋白质，这增加了DUX4可能只是短暂作用的可能性。Darko Bosnakovski(明尼苏达大学)研究了doxycycline (Dox)可诱导DUX4表达的小鼠模型(iDUX4pA;HSA)，并研究了DUX4瞬时表达如何影响下游靶基因、炎症和肌肉再生[8］．在连续使用Dox诱导4个月的小鼠中，观察到类似人类FSHD的肌肉病理，以及与mri引导的FSHD肌肉活检一致的转录组变化，尽管DUX4蛋白仅在一小部分肌纤维中很少检测到。在受累肌肉中检测到表达纤维化前转录组特征的纤维成脂肪祖细胞(FAPs)增加。用抗纤维化药物治疗小鼠可减少炎症浸润和肌内胶原沉积。然而，单次腹腔注射Dox可在一天内诱导DUX4表达，而DUX4在脉冲后4天衰减到几乎无法检测到的水平。此时出现单个核细胞浸润，炎症标志物和DUX4活性小鼠生物标志物达到峰值;重要的是，后者在诱导后至少8天仍被检测到。单次DUX4爆发后，增加的FAPs持续至少30天，心脏毒素损伤的肌肉显示再生受损。此外，在用Dox饲料短暂诱导DUX4 10天3个月后，FAPs仍然升高，肌肉纤维转变为缓慢氧化纤维类型。总之，这些发现与活跃FSHD的人类肌肉活检的观察结果一致，并支持了即使是短暂的DUX4表达也会引发长期病理影响的观点。

DUX4的调控和毒性机制可能受到其他与FSHD治疗发展相关的细胞成分的影响。Paola Ghezzi(米兰San Raffaele科学研究所)使用高严格度的双亲和纯化和蛋白质组学方法鉴定了10个dux4相互作用的蛋白。表达DUX4的转染细胞凋亡随着其中一个相互作用子matrin 3 (matrin 3)的抑制而增加，matrin 3是一种参与基因表达、RNA控制和DNA损伤反应的核基质蛋白。值得注意的是，突变形式的matri3与渐冻症和远端肌病有关。此外，与matri3共转染可特异性缓解dux4介导的细胞凋亡。结果表明，在DUX4诱导的细胞凋亡中，氨基酸1-287能够起到保护作用，且matri3直接与DUX4的dna结合结构域相互作用。近距离结扎实验表明，在FSHD原代肌细胞中，matri3和DUX4相互作用，在这些细胞中，过表达matri3会降低DUX4及其靶基因的表达，而当sirna介导的matri3缺失时则相反。同样，过表达matri3可以促进FSHD肌细胞的肌源性分化、融合指数和活力，而缺失则会增加细胞凋亡。提出了一个初步的工作模型，其中matri3与DUX4的相互作用可能限制DUX4与DNA结合并启动靶基因转录的可用性。这项研究为进一步分析matri3 - dux4相互作用的结构铺平了道路，这可能使未来设计具有类似性质的类药物制剂成为可能。

调节DUX4表达的治疗靶向FSHD的根本原因，但DUX4影响肌肉微环境的下游后果尚不完全清楚。为了帮助定义这些变化，Anugraha Raman (Fulcrum Therapeutics)展示了16个FSHD stir阳性和2个健康肌肉活检样本的单核RNA测序结果。这些研究获得了约126,000个疾病核和约23,000个健康核，这些核可以根据先前肌肉转录组学研究中的标记基因表达分配到不同的已知细胞类型。肌核构成了约60%的细胞类型(在健康活检中为90%)，先前在病理样本中确定的细胞类型在数量上有所增加，包括成纤维脂肪祖细胞或FAPs(增加到13%)、脂肪细胞、T细胞和B细胞以及巨噬细胞。这些细胞类型组成的变化在个体活检中高度可变，反映了临床严重程度和小型活检取样的预期可变性。此外，特定细胞类型的基因表达变化可能与大量RNAseq分析中的FSHD活检特征有关，该分析之前发现了约170个失调基因。这可能表明特定的细胞类型是如何促成这些FSHD特征的。此外，DUX4靶基因的表达仅限于与再生或早期肌生成相关的一群细胞中30个罕见的肌核的一个子集，约为3000个总肌核中的1个。对这些结果的持续分析可能会提供关于FSHD期间微环境变化的见解，这可能会提出新的治疗靶点，以及活检在临床试验中跟踪DUX4靶基因作为生物标志物的效用。

海报会议的亮点包括Alexandra D. Gurzau(墨尔本大学)对二聚化的详细生化分析染色体柔性铰链结构域的结构维护（SMCHD1)的GHKL atp酶，该酶需要其n端泛素样结构域，对于SMCHD1的染色质相互作用和基因沉默至关重要。Jonathan Chau(加州大学欧文分校)观察到最内源性DUX4转录本积累并保留在肌细胞核内的病灶内，一些DUX4靶基因如LEUTX可以维持DUX4触发后的下游变化。Rajanikanth Vangipurapu(圣路易斯大学)使用CRISPR方法单独和组合敲除p38α/β MAP激酶，并表明p38似乎是FSHD细胞DUX4表达的重要(尽管不是唯一的)激活剂。Chris Brennan(辉瑞罕见病研究)测量了DUX4诱导后蛋白质磷酸化的整体变化，并表明DUX4过表达14小时会导致> 600 mRNA剪接变体的变化。

Emanuele Mocciaro (San Raffaele科学研究所)提出了一种新的抑制病理的药物靶点DUX4作为一种可能的FSHD治疗。此前，他们的实验室发现长链非编码RNA被称为DBE-T转录的上游DUX4基因，有效刺激DUX4FSHD患者细胞中的表达[9］．DBE-T招募三胸组蛋白ASH1L到D4Z4重复区进行介导DUX4激活，尽管确切的分子机制尚不清楚。如何解决DBE-T功能方面，他们建立了一个报告系统，首先识别最小域DBE-T基因激活功能所必需和充分的RNADBE-T．蛋白质组学研究以该片段(片段3)为诱饵，确定WD40重复含蛋白5 (repeat-containing protein 5, WDR5)为相互作用蛋白之一。WDR5的过度表达和缺失DBE-TWDR5基因片段的存在和缺失都证实了WDR5基因片段对DBE-T(片段3)介导的基因激活。在FSHD细胞中，WDR5的耗尽或化学抑制被有效抑制DUX4和DUX4靶基因的表达，并将DUX4过表达的表型挽救到与DUX4缺失相当的程度。WDR5在染色质介导的基因调控中具有多种功能，最广为人知的是与ASH2L一起作为混合谱系白血病(MLL)组蛋白H3K4甲基转移酶复合物的核心成分。目前Mocciaro等人的研究表明ASH1L可能形成类似的复合体。已知WDR5与增强子样长非编码rna (lncRNAs)结合，包括HOXA位点的HOTTIP，以介导基因激活。因此,DBE-T似乎是通过与WDR5相互作用来激活的DUX4．他们目前正在FSHD细胞和动物模型中测试WDR5抑制剂的功效。虽然考虑到WDR5的复杂作用，副作用是值得关注的，但这些抑制剂已经被测试用于癌症治疗，因此可能会被重新用于FSHD治疗。

Quentin Gouil (Walter和Eliza Hall医学研究所)介绍了他们的研究，使用纳米孔长读测序以更实惠的方式简化FSHD遗传和表观遗传诊断。纳米孔测序在测序读数的长度和准确性方面优于其他测序平台。Gouil举了一些例子来证明，可以准确地确定单倍型和等位基因特异性的D4Z4重复长度，以及涉及D4Z4等位基因的大型结构重排。此外，他们的数据表明，有可能在长基因中检测单核苷酸的变化SMCHD1并分析4q35位点的DNA甲基化状态。Gouil还介绍了使用cas9标记方法进行靶向纳米孔测序的结果，这种方法更具成本效益。该策略还可以用于多路复用，从而可以同时进行D4Z4阵列和修饰基因的测序，具有较高的富集度和准确性。他们希望进一步完善这项技术，将染色质开放和组蛋白修饰等其他表观遗传变化结合起来。

为了开发FSHD的靶向治疗方法，详细了解DUX4表达的调控途径、DUX4诱导的下游级联以及肌肉外细胞对疾病病理生理学的贡献将是重要的。在本次会议上，提出了疾病的新型细胞模型，在蛋白质水平上对DUX4调控的见解，以及肌肉炎症的潜在机制。

在大约4%的FSHD患者中，该疾病与脑内基因突变有关SMCHD1基因(3.］．奇怪的是，同一基因突变也会引起博斯马arhinia小眼综合征(BAMS) [10］．Camille Laberthonniѐre(马赛医学遗传学)使用诱导多能干细胞(iPSCs)从FSHD和bams影响的个体中产生肌肉纤维，进行深入的转录组学研究。使用一种新的计算框架MOGAMUN，他们可以确定这两种疾病的共同或不同的途径。FSHD肌肉纤维对骨骼肌功能有影响，BAMS肌肉对发育过程有更明显的影响。更具体地说，FSHD肌肉高度下调了肌节成分，包括几种肌动蛋白和肌凝蛋白丝蛋白，以及与钙处理有关的蛋白质。功能研究证实了FSHD ipsc来源的肌肉纤维的肌肉缺损，揭示了FSHD肌肉衰弱与收缩器官改变之间的联系。

近年来，我们已经了解到关于监管的重要信息DUX4在RNA水平，但很少涉及DUX4蛋白调控。Renatta Knox(全国儿童医院)介绍了研究DUX4蛋白翻译后修饰(PTMs)的工作，它们对DUX4功能的影响，以及这种PTMs是否可以作为一种治疗方法。利用质谱法，诺克斯和哈珀实验室的同事在DUX4上发现了几个丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点和精氨酸甲基化位点。对55个不同的突变体进行细致的筛选，这些突变体要么模仿这种修饰，要么削弱这种修饰，从而鉴定出一个丝氨酸/苏氨酸拟磷突变体子集和一个精氨酸甲基化零突变体，它们保护细胞免受dux4介导的毒性。在后续研究中，他们证明DUX4是蛋白激酶a的底物，并且它也与精氨酸甲基转移酶PRMT1存在复合物。广泛甲基化抑制剂和特异性PRMT1抑制剂都可以保护DUX4诱导的成肌细胞死亡，证明了靶向DUX4 PTMs的治疗前景。

为了消除与使用从不同供体分离的样本相关的变异性，Nam Viet Nguyen(加州大学欧文分校)使用CRISPR-Cas9通过诱导D4Z4重复序列的缺失或突变来生成等基因FSHD模型SMCHD1从一个健康的供体的同一个不朽的肌肉细胞系开始。通过删除D4Z4重复单元和SMCHD1Nguyen单独或组合基因，能够重新捕获FSHD的分子特征，包括D4Z4位点上H3K9me3的减少和DUX4靶点的表达。DUX4靶基因表达在双突变体中特别稳健，并揭示了关于早期和晚期靶标的有趣的时间模式。有趣的是，突变细胞在DUX4表达的时间与DUX4靶细胞表达的时间方面与患者来源的成肌细胞不同，突变细胞仅在分化成肌管后才显示靶细胞的激活。这些结果暗示了可以利用这些新的FSHD模型细胞系探索有趣的调节机制。

FSHD和的显著特征之一DUX4肌肉炎症。为了研究这一过程的机制，Anna Greco(内梅亨大学医学中心)研究了150名FSHD患者和98名健康对照的循环标志物，发现IL-6和TNF-α在FSHD中显著上调，IL-6与肌肉无力、疾病严重程度和持续时间呈正相关。在体外工作时，她在刺激整个骨骼肌或纯化的自然杀伤细胞(NK细胞)后发现了类似的结果。基于这些结果，她提出了一个模型，FSHD患者的肌肉细胞产生炎症分子，然后激活循环中的NK细胞，进一步产生炎症细胞因子并导致疾病。如果正确，干扰这一过程可能会减缓FSHD的疾病进展。

在FSHD领域，非常需要与疾病严重程度和进展相关的分子生物标志物，并可用于评估治疗策略。在本次会议上，几个实验室介绍了他们在鉴定FSHD生物标志物方面的工作。

Amy Campbell (Colorado University Anschutz Medical Campus)使用Olink公司的接近扩展检测技术，目的是鉴定可以在血液中检测到的dux4驱动基因[11］．该方法使用匹配的dna偶联抗体对，可以结合感兴趣的生物标志物，然后进行定量PCR来定量蛋白质水平。Olink面板含有有限数量的DUX4靶基因肽，由碱性磷酸酶、胎盘(ALPP)、碳酸酐酶2 (CA2)和促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(CRHBP)组成。在强力霉素诱导的DUX4 (MB35-iDUX4)和患者来源的成肌细胞中研究了这些候选生物标志物的表达。虽然CRHBP和CA2水平低于检测极限，但在表达dux4的细胞裂解液和上清液中可以很容易地检测到ALPP水平。DUX4siRNA处理MB35-iDUX4成肌细胞导致ALPP上清水平低于检测限。通过研究对照组和FSHD患者在不同分化天数的成肌细胞系，证实FSHD细胞系上清液中ALPP水平升高。用DUX4小分子抑制剂(BET1抑制剂JQ1， β2激动剂福莫特罗，p38抑制剂losmapimod)进行的实验显示，ALPP上清水平降低，与DUX4表达水平降低相对应。然而，20名FSHD患者的ALPP血清水平与20名对照组的ALPP血清水平相比没有变化。一种解释可能是ALPP的基础水平已经相当高，这表明ALPP的非肌肉表达可能掩盖了肌肉特异性差异。综上所述，ALPP似乎不是一个有前途的FSHD血清生物标志物，但ALPP上清水平可以用于跟踪DUX4在培养细胞中的活性。

Robert Bloch(马里兰大学医学院)介绍了他的团队在潜在的FSHD生物标志物溶质载体家族34成员2 (SLC34A2)方面正在进行的工作，SLC34A2是一种负责钠依赖性磷酸盐摄取到细胞的蛋白质和DUX4靶基因。本实验室之前的研究使用了不朽FSHD的人类肌肉异种移植和控制肌原性前体细胞，发现SLC34A2是FSHD的一种新的蛋白质生物标志物[12］．此外，western blot分析显示，SLC34A2蛋白在FSHD成肌细胞和FSHD异种移植物中均可检测到，与携带对照异种移植物的小鼠相比，SLC34A2蛋白在FSHD异种移植物小鼠血清中表达增加。此外，在10例FSHD SLC34A2患者中，蛋白质水平比对照组的SLC34A2血清水平高3-9倍。总的来说，这些数据表明SLC34A2可能是FSHD有用的血清蛋白生物标志物。未来的研究包括在其他对照血清中测量SLC34A2蛋白水平。

Jonathan Pini (Université Côte d’azur)讨论了一项回顾性研究，通过使用Meso Scale Discovery试剂盒测量20种促炎细胞因子和调节细胞因子的水平，研究了100例经基因证实的FSHD成年患者的血清样本。此外，该患者队列的临床数据可获得，包括手动肌肉测试Sum评分(分析来自上肢和下肢的28块肌肉)，Brooke和Vignos评分(上肢和下肢的功能评估)，以及临床严重程度评分。只有细胞因子IL-6和TNF-α的浓度与功能和临床严重程度评分相关，其中IL-6的相关性最高。此外，FSHD1患者的IL-6血清水平比50个匹配的对照组高2-3倍。最后，临床严重程度评分在7至10分之间的FSHD1患者血清IL-6水平显著升高。在DUX4诱导的转基因小鼠模型(ACTA1-MCM;FLExDUX4小鼠模型)中的研究表明，在DUX4表达水平最高且表型严重的小鼠中，血清和肌肉IL-6水平均显著升高[13］．总之，IL-6有望作为FSHD的血清生物标志物，与疾病严重程度相关。这项研究现已发表[14］．此外，IL-6可能是一种治疗靶点，IL-6抑制剂已经被批准用于治疗几种疾病，包括类风湿性关节炎。

鉴于其对FSHD的重要性，干扰DUX4的表达或功能具有很强的治疗相关性，本会议重点介绍了阻断DUX4转录或诱导的策略DUX4RNA降解。

Fran Sverdrup(圣路易斯大学)描述了p38丝裂原激活蛋白激酶在调节的作用DUX4转录和报道了p38 α/β在激活的关键作用DUX4FSHD肌细胞分化过程中的表达。p38抑制剂losmapimod显著降低DUX4靶基因的表达和激活。使用小鼠异种移植模型，Sverdrup小组发现losmapimod在异种移植发育的早期阶段非常有效地降低DUX4激活的峰值，但低水平的DUX4靶基因持续存在，在后期对p38抑制不敏感。这些发现的相关性仍有待确定。这些关于losmapimod作用机制的结果对于正在进行的FSHD 2b期临床试验非常重要(参见“Special session-Fulcrum’s 2b期ReDUX4结果”部分)。

下调DUX4表达的另一种方法是降解其RNA。Nizar Saad(全国儿童医院)利用计算机预测发现了8种潜在的疾病mir - 675结合位点DUX4mRNA，具有两种高亲和力mir - 675结合位点通过体外结合试验确定。优化后的mir - 675研究发现，在异位表达DUX4的HEK293细胞中，可以显著降低DUX4的表达和DUX4相关的毒性。有趣的是，阻塞是内生的mir - 675活动增加了DUX4及其在FSHD肌肉细胞中的一个靶标的表达，证实了这一想法mir - 675是天然的调节剂DUX4表达式。使用基于aav的体内模型，用mir - 675导致DUX4表达和相关病理体征显著降低。值得注意的是，化合物增加了mir - 675DUX4的表达和导致相应的DUX4水平的降低被确定。未来在动物模型上的工作将研究治疗相关性mir - 675用于FSHD [15］．

学术界和工业界的几个小组正在寻求以核酸为基础的抑制策略DUX4RNA水平的基因表达。虽然各种策略之间存在一定的差异，特别是在作用机制和传递策略上，但都有一个共同的特点:要求治疗性核酸种与核酸形成反义碱基对DUX4信使rna。本次会议的发言者描述了三种不同的实现机制DUX4反义方法沉默mRNA:

1. 1.

   RNA干扰(RNAi)策略利用设计用于结合的小干扰RNA (siRNAs)DUX4通过rna诱导沉默复合体(RISC)触发mRNA的降解(Barbora Malecova, Avidity Biosciences;凯特琳·达曼，马萨诸塞大学;Jonathan Van Dyke (Arrowhead);林赛·华莱士全国儿童医院)

2. 2.

   利用DNA缺口蛋白反义寡核苷酸(缺口蛋白ASOs或缺口蛋白)通过RNA/DNA双工诱导RNAse H裂解(Linde Bouwman来自莱顿大学医学中心)

3. 3.

   使用磷酸二酯morpholino寡聚物(PMOs或Morpholinos)的空间位阻(Ngoc Lu-Nguyen，皇家霍洛威大学，和Nelson Hsia, Dyne)

从历史上看，将合成核酸输送到肌肉一直具有挑战性[16］．本次会议的发言者介绍了各种增加向肌肉输送核酸的方法，包括用脂质制定核酸(Linde Bouwman，莱顿大学医学中心;Katelyn Daman，马萨诸塞大学)，穿透细胞的树状大分子(Ngoc Lu-Nguyen，皇家霍洛威大学)，或与靶向转铁蛋白受体(TfR)或肌肉膜上存在的其他受体的抗体或配体连接(Barbora Malecova, Avidity Biosciences;戴恩(Dyne)公司的夏家乐(Nelson Hsia);Jonathan Van Dyke(《箭头》)。像其他传统的小分子疗法一样，那些使用ASOs和sirna的疗法需要终生重复给药来维持预期的治疗效果。另外，基于aav的肌肉基因治疗系统使用病毒衣壳来实现广泛的肌肉传递，并可设计为在一次给药后实现长期表达(Lindsay Wallace, national Children 's Hospital)。目前用于肌肉基因治疗的AAV载体的局限性包括生产成本高，载体递送后无法调整剂量和重新调整，以及与全身递送高剂量载体相关的安全问题。

Linde Bouwman(莱顿大学医学中心)报道了一项使用非诱导的ACTA1-MCM;FLExDUX4小鼠的研究结果，其中DNA间隙物与棕榈酸盐(C16)混合，每周以50 mg/kg的剂量给药两次，持续4周，随后每周50 mg/kg，持续5周。与ACTA1-MCM;FLExDUX4小鼠相比，dux4 -gap处理的动物表现出减少DUX4和3个dux4激活的小鼠靶基因，以及组织学和功能改善的证据(中央细胞核的肌纤维从26%减少到18%，1250米跑步机性能分别增加30%)。然而，使用悬挂网格测试和握力测试测量的肌肉重量或力量没有发现任何改善。这项研究现已发表[17］．

Barbora Malecova (Avidity生物科学)提出了体外和体内数据，使用DUX4靶基因作为沉默疗效的替代指标DUX4-靶向siRNA结合小鼠转铁蛋白受体(TfR)单克隆抗体。具体来说，Malecova博士报告了用10 nM siRNA处理的11种不同的人FSHD肌管系中4个DUX4靶基因(QPCR)和SLC34A2蛋白(免疫荧光)的减少。同样，3周后，在siRNA+TfR抗体偶联处理的FLExDUX4小鼠中发现4个dux4激活的小鼠靶基因的剂量依赖性减少。小鼠研究未报道功能或组织学结果(表2)1）.

凯特琳·达曼(麻省大学)使用过DUX4-靶向sirna与二十二酸组成，以促进传递到FSHD成肌细胞，FSHD肌管和FSHD异种移植模型。用3种不同浓度的siRNA(0.5、1和2 μM)体外处理FSHD细胞，可产生3种人DUX4靶转录物的剂量依赖性降低。同样，在FSHD异种移植小鼠皮下用两次20mg /kg剂量的siRNA/二十二糖酸处理一周后，4个DUX4靶基因减少。

Nelson Hsia (Dyne Therapeutics)描述了一种策略DUX4-通过将治疗性寡核苷酸偶联到TfR抗体Fab片段，将PMO FM10靶向到FSHD肌管。此前有报道称FM10结合在DUX4polyA信号，从而潜在地操作不稳定DUX4阻断聚腺苷酸[18］．Hsia博士报告了用8 nM的FM10-TfR抗体Fab片段偶联物处理的人FSHD肌管中3个DUX4靶基因的减少。

Ngoc Lu-Nguyen(皇家霍洛威大学)介绍了她的工作，描述了几种PMOs靶向的体外筛选DUX4，然后将先导序列耦合到胍枝状大分子，用于体内递送(vivo - pmo)。在体外，几种PMOs导致FSHD肌管DUX4和3靶基因的减少。在他莫西芬诱导的ACTA1-MCM;FLExDUX4小鼠中进行体内研究，动物每周腹腔注射铅vivo - pmo (10 mg/kg)，持续30天。这种治疗导致部分减少DUX42个dux4激活的小鼠靶基因，组织学和功能结果部分改善。这项研究现已发表[19］．

Jonathan Van Dyke (Arrowhead Pharmaceuticals)介绍了一项全面的研究DUX4涉及用未指明的传递系统传递核酸的抑制。报告的数据表明，sirna和传递系统在沉默方面非常有效DUX4并改善了几种表型。具体地说，体外递送1,10和100 nMDUX4-靶向人类FSHD肌管的siRNAs导致10个DUX4靶基因的剂量响应性减少。在体内研究中，Arrowhead使用了他莫西芬诱导的ACTA1-MCM;FLExDUX4模型。动物在他莫西芬诱导后的第3天和第5天用共轭siRNA治疗，随后每周注射，持续30天。这种治疗方案导致了DUX4和DUX4激活的小鼠靶基因，在DUX4诱导后30天体重改善，在旋转杆上的性能提高22天。纤维化的改善也有报道，但没有定量。

Lindsay Wallace(全国儿童医院)报告了她翻译aav基因治疗项目的进展DUX4用一种叫做mi405［20.，21］．Wallace博士报告了几项非诱导和他莫昔芬诱导的TIC-DUX4小鼠模型的体内研究，分别概括了dux4相关的轻度和较严重形式的肌病[22］．为了解决治疗的持久性，单次肌注剂量为1 × 10¹¹携带U6的AAV6血清型载体的载体基因组(vg)。mi405expression cassette protected muscles from histological damage out to 1 year (25% central nuclei in untreated limbs; 5% in treated limbs), and systemic intravenous (IV) delivery of 3 × 10¹³或3 × 10¹⁴Vg /kg可改善6个月的活动、后肢饲养和旋转能力。同样，他莫西芬诱导的TIC-DUX4小鼠用AAV6或AAV9血清型U6治疗IV。Mi405载体在10周内笼活性没有下降。最后，在与Emerson实验室(马萨诸塞大学)使用FSHD异种移植模型的合作研究中，IM注射AAV6载体减少了DUX48个DUX4靶基因。

最后，陈逸文博士(Dr. Yi-Wen Chen)在2020年IRC会议上介绍了一项ASO研究，该研究现已发表，他今年没有提交摘要，但在会议结束时参加了问答[23］．

由于FSHD靶向治疗的临床试验正在进行和即将进行，本次会议的主要重点是临床试验准备。

Sanne Vincenten(内梅亨大学医学中心)的首次报告是关于FSHD的5年自然史研究的初步肌肉MRI结果。由于临床结果测量可能不够敏感，无法检测这种缓慢进展疾病的变化，定量肌肉MRI已被提议作为FSHD临床试验的替代测量或生物标志物。这项研究包括105例FSHD患者，并在基线和5年随访时测定了每位患者19块腿部肌肉的脂肪分数(FF)。几乎所有肌肉都有显著的FF进展，最突出的是腿筋和小腿肌肉。所有肌肉的平均FF (MRI复合评分)增加2.4(±2.8 SD)。MRI复合评分的变化与两项临床结果指标(Lamperti临床严重程度评分和运动功能指标)的变化之间的纵向相关性为中度但显著性(CC 0.3)。MRI复合评分的变化与FSHD类型、性别、D4Z4重复阵列大小或年龄无关(CC为0.0-0.2)。MRI复合评分的变化与基线Lamperti临床严重程度评分、stirt阳性肌肉数量和基线脂肪浸润程度呈正相关(CC 0.3-0.4，p< 0.05)。这些初步结果显示了定量MRI变化与临床结果测量之间的关系，但正在进行额外的工作，以确定MRI在FSHD临床试验中的最佳使用。

接下来，Ghobad Maleki和Ahnjili Zhuparris(人类药物研究中心)提出了一项关于使用智能手机和可穿戴设备捕捉fshd相关症状的可行性研究，并通过持续监测与疾病相关的变化来克服现有临床结果的有限能力。使用智能手机和可穿戴设备对38名FSHD患者和20名非FSHD对照组进行了6周的监测。总的来说，智能手机应用程序的耐受性很好，但67%的受试者注意到他们智能手机的电池寿命缩短了。所有传感器的数据完整性均超过75%。FSHD和非FSHD对照的分类准确率为93%，敏感性为100%，特异性为80%。与智能手机加速、应用程序使用、位置、身体活动、睡眠和通话行为相关的特征是最显著的分类特征。研究人员得出结论，远程监测数据收集允许收集日常活动数据，并且可以根据与身体和社交活动相关的数据，使用智能手机和可穿戴设备检测FSHD患者和非FSHD对照组的特征差异。

Nicol Voermans(内梅亨大学医学中心)就FSHD欧洲试验网络的启动作了报告，结束了本次会议。欧洲国家关于临床试验、药物监管和参与以及保健规定的指导方针在各种细微的方面都有所不同，将受益于专门针对欧洲多语言情况的总体战略。这促使FSHD欧洲启动了FSHD欧洲试验网络，这是一个与临床研究试验网络、TreatNMD和欧洲罕见病参考网络合作的项目。该网络的虚拟启动会议于2021年春季举行。这导致了四个工作组的临床和遗传诊断，临床结果测量，生物标志物和肌肉成像。这些小组将致力于申请在2022年和2023年举办两次ENMC研讨会。此外，还将任命一名通讯代表。网络成员将被任命去接触尚未连通的国家，并与包括FSHD CTRN在内的其他组织合作。网络专家将为FSHD欧洲目前正在进行的患者期望调查做出贡献。网络成员将促进在所有临床中心和患者登记处使用商定的FSHD核心数据集。 More information can be found in the following:https://fshd-europe.info/what-is-it-about/．

Rabi Tawil(罗切斯特大学医学中心)描述了由Fulcrum Therapeutics赞助的losmapimod治疗FSHD的ReDUX4 2b期试验的结果。ReDUX4是一项随机、双盲、安慰剂对照、48周的losmapimod治疗FSHD的疗效和安全性研究。Losmapimod是一种口服的、选择性的小分子p38α/β MAPK抑制剂，在临床前研究中显著降低DUX4的表达。主要终点是肌肉针活检中dux4驱动基因表达的变化。次要终点包括安全性、药代动力学/动力学和全身肌肉骨骼MRI (WB-MSK-MRI)的变化。临床结果评估包括可达工作空间(RWS)、启动时间(TUG, FSHD TUG)、手持测力仪、运动功能测量(MFM)和患者报告的结果测量(PGIC, FSHD- hi)的变化。80名基因证实FSHD1的受试者被随机1:1分配到losmapimod (15 mg口服BID)或安慰剂组，持续48周。dux4驱动基因表达无差异。在第48周，losmapimod显著减缓了肌肉脂肪浸润(MFI)的进展，并显著改善了RWS与体重的相对表面积。在PGIC方面，参与者报告了与安慰剂相比的显著改善，手持测力仪对最大自主等距收缩(MVICT)的评估显示，几个参数都有选择性稳定。 ReDUX4 has shown evidence of the benefit of treatment with losmapimod on structural (WB-MSK MRI) and FSHD relevant clinical endpoints (PGIC, RWS, and dynamometry). Additionally, losmapimod continued to exhibit favorable safety and tolerability and will be pursued further as a potential disease-modifying treatment for people living with FSHD.

今年的FSHD协会青年研究者奖颁发给了乔治·塔斯卡博士，他是a大学警察基金会的神经学家。Gemelli“IRCCS在罗马，意大利。Tasca博士和他的团队发表了许多论文，这些论文极大地提高了我们对FSHD中肌肉成像作为诊断工具、疾病生物标志物以及疾病病理生理学研究工具的潜力的认识。他的研究还阐明了在单个肌肉水平上参与疾病活动性阶段的分子机制，目前专注于检测组织和循环生物标志物，这是FSHD社区的一些最高优先级。

Alec DeSimone博士，目前是耶鲁大学医学院的博士后研究员，是2021年FSHD IRC的最佳海报奖得主。他的海报“FSHD治疗的活细胞药物筛选平台”描述了一种具有成本效益、更高通量和临床相关的药物筛选平台。使用先前描述的FSHD患者来源的成肌细胞系和集成荧光DUX4报告细胞[7]， DeSimone开发了一种高含量成像检测方法，以准确量化指标，如肌管中DUX4激活事件的数量和DUX4激活后的生存时间，以跟踪DUX4诱导的肌毒性。

对DUX4调控、其激活的后果和导致FSHD肌肉萎缩的病理生理机制的理解的进展，以及更准确和多系统疾病模型的发展，干预策略的激增，以及更敏感的结果测量的验证和试验临床网络的扩展，反映了FSHD治疗发展的前景。这些进展，从基本的分子表征到多国临床协调，也强调了一个领域需要同时发生的许多方面，以推进有前途的治疗。2021年FSHD国际研究大会汇集了来自20多个国家的350多名注册代表，代表在上述领域具有专业知识和兴趣的学术、临床、监管和工业部门。2022年FSHD国际研究大会旨在巩固这一势头，计划于6月16日至17日在佛罗里达州奥兰多举行现场活动。

项目委员会和联合主席

Jamshid Arjomand, FSHD协会，美国

杰西卡·c·德·格里夫，荷兰莱顿大学医学中心

Davide Gabellini, IRCCS San Raffaele科学研究所/校际肌学研究所，意大利

Scott Q. Harper，基因治疗中心，阿比盖尔韦克斯纳研究所全国儿童医院/儿科，俄亥俄州立大学医学院，美国

Lawrence J. Hayward，美国马萨诸塞大学医学院

Sujatha Jagannathan，美国科罗拉多大学安舒茨医学院

June Kinoshita，美国FSHD协会

Mikell Lang, FSHD协会，美国

Karlien Mul，荷兰内梅亨大学医学中心

Sabrina Sacconi，尼斯大学医院/法国尼斯癌症与衰老研究所

Mark Stone, FSHD协会，美国

Kyoko Yokomori，美国加州大学欧文分校医学院

不适用。

我们感谢Mikell Lang为组织本次会议所做的一切努力，以及以下赞助商对2021年FSHD国际研究大会的支持:AFM Telethon、AMRA Medical、Armatus Bio、Arrowhead Pharmaceuticals、Avidity Biosciences、Bionano Genomics、Dyne Therapeutics、Facio Therapies、Fulcrum Therapeutics、Genomic Vision、miRecule、PerkinElmer Genomics、Ultragenyx、麻省大学医学院/NIH/Wellstone中心和内华达大学雷诺医学院

这次会议由FSHD协会资助。

作者指出

1. Sujatha Jagannathan和Jessica C. de Greef是同等的主要合著者。

作者及隶属关系

1. 科罗拉多大学安舒茨医学院生物化学与分子遗传学系，美国科罗拉多州奥罗拉，80045

   Sujatha Jagannathan

2. 荷兰莱顿大学医学中心人类遗传学系

   杰西卡·c·德格里夫

3. 马萨诸塞大学医学院神经内科和FSHD Wellstone中心，伍斯特，MA, 01655, USA

   劳伦斯·j·海沃德

4. 加州大学欧文分校医学院生物化学系，美国加州92697

   恭子Yokomori

5. IRCCS San Raffaele科学研究所，意大利米兰，遗传学和细胞生物学分部

   大卫。Gabellini

6. 荷兰奈梅亨大学医学中心Donders脑、认知和行为研究所神经内科

   Karlien Mul

7. 尼斯大学医院/尼斯癌症与衰老研究所，尼斯，法国

   塞布丽娜Sacconi

8. FSHD协会，伦道夫，马萨诸塞州，美国

   Jamshid Arjomand和June Kinoshita

9. 基因治疗中心，阿比盖尔·韦克斯纳研究所，全国儿童医院，儿科，俄亥俄州立大学医学院，哥伦布，OH, 43205，美国

   斯科特·q·哈珀

贡献

所有作者都对本报告的撰写和审查做出了贡献。作者们阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到斯科特·q·哈珀．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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