Six1通过调控MCT10转运体促进骨骼肌甲状腺激素反应

背景

的Six1转录因子参与控制几种组织类型的发育，尤其是骨骼肌。Six1也有助于肌肉代谢，其活动与快速抽搐，糖酵解表型相关。Six1通过直接刺激其转录或通过长链非编码RNA间接作用调节快肌程序的某些基因的表达。我们假设了额外的作用机制Six1可能在起作用。

方法

结合基因表达谱分析和全基因组定位分析数据进行分析。结果通过体内RNA干扰功能丧失试验验证，随后通过RT-PCR和转录报告试验测量基因表达。

结果

的Slc16a10编码甲状腺激素跨膜转运蛋白MCT10的基因被鉴定为直接结合转录增强子的基因Six1并要求Six1在成年小鼠胫骨前肌中充分表达的活动，主要是快速收缩肌肉。在各种甲状腺激素转运蛋白中，MCT10 mRNA被发现在骨骼肌中最为丰富，并且在快肌组比慢肌组有更强的表达。胫前肌MCT10功能丧失总结了Six1对快收缩肌基因的表达和导致甲状腺激素受体依赖性报告基因活性降低。

结论

这些结果阐明了控制MCT10组织表达谱的分子机制，并确定了甲状腺激素信号通路的调节作为另一种机制Six1影响骨骼肌代谢。

转录因子Six family (tf)是一组由六个同源结构域蛋白质组成的蛋白质，它们共享一个保守的、特征性的Six结构域[1，2］．它们是通过互补实验发现的正眼果蝇果蝇复眼发育所必需的基因[3.］．在整个动物界都发现了六种蛋白质家族的同源物[4，5，6]并且有强有力的证据表明，与六种tf相关的调节网络在脊椎动物分化之前就已经进化形成了[7］．6个家族基因敲除模型强调，这些tf在包括骨骼肌在内的几种组织类型的发育中发挥着全球水平的关键作用[8]，肾脏[9，10]，神经元[11]，心肌[12]，眼睛[13]和生殖腺[14］．

在骨骼肌中，Six1而且已被证明参与肌原蛋白的转录表达[15，16，17]，是骨骼肌纤维末梢分化所必需的肌生调节因子[18，19］．MRFs和六种tf之间的相互作用调节两个tf家族的下游靶点，表达肌肉干细胞增殖、融合和分化过程中的关键基因[17，20.，21，22，23］．的作用Six1在发展肌肉是必不可少的，如Six1敲除小鼠出生时因横膈膜形成不当而死亡[24］．在成人肌肉干细胞中，Six1和Six4对于损伤后的组织再生都是必不可少的[22，25］．相比之下，六个tf在成人肌肉稳态中的作用可以说是不太清楚。在成人成熟的骨骼肌中，强行表达Six1和它的余子式Eya1足以将慢收缩氧化肌重新编程为快速收缩糖酵解表型[26］．相反,myofiber-specificSix1条件敲除(Six1-cKO)小鼠表现出向慢肌收缩肌表型的切换，其典型表现为慢肌收缩肌球蛋白和肌钙蛋白异型的表达[27，28］．

主要提出了机制Six1成人肌纤维类型的调节是通过对Linc-MYH(一种长链非编码RNA)的直接正向转录调控[28］．林肯- myh击倒概括了大部分Six1敲除条件表型，尽管达到约80%的效应量级，并不能显著增加慢缩肌球蛋白亚型的表达。这部分概括了Six1敲除表型表明，调节纤维类型规格的其他途径可能同时处于下Six1监管控制。虽然许多调节网络涉及成人骨骼肌纤维类型的维持，包括钙调神经磷酸酶/NFAT信号[29]， AMPK轴[30.]， pgc-1α [31]， Sox6 [32]，以及甲状腺激素(TH)信号[33]，在维持成人肌肉表型的不同信号和转录途径之间的确切层次和相互作用尚不清楚。

在这里，我们报告的研究结果的含义Six1对TH通路的调节与六大tf相似，TH在哺乳动物健康中起着至关重要的作用，参与大脑、肌肉、肝脏和胰腺等各种组织的发育、分化、生长和代谢稳态[34］．TH主要有两种形式，T₄和T_3.并可通过基因组或非基因组调控影响细胞代谢[35］．而T₄已被证明在非基因组相互作用中有更大的作用[36), T_3.是TH的主要基因组活性形式，作为配体激活甲状腺受体tf(编码Thra或Thrb基因)结合靶基因调控区TH反应元件(TREs)并调节其转录水平[37］．

在骨骼肌中，TH活性调节肌生成和肌肉再生过程[38，39]，收缩结构[40]、能量消耗[41]、线粒体产热、脂肪酸氧化[42]，葡萄糖摄取[40]、胰岛素反应性[43]，以及自噬[44］．在肌纤维类型规范的背景下，甲状腺功能亢进促进快肌纤维表型，而甲状腺功能减退则与向慢肌纤维表型的转换有关[45，46］．从机制上看，TH受体已被证明直接控制与快抽搐表型相关的某些基因的表达[47]以及通过上调miR-133a1间接拮抗慢抽搐程序，进而下调驱动慢抽搐程序的TF Tead1 [33，48］．T_3.已被证明可以调节多种mrf的表达，这得到了功能性TREs驱动Myod1［49),Myog［50］．甲状腺功能亢进症已被证明能促使卫星细胞表达更多的Myod1［51]，相反，甲状腺功能减退阻碍肌源性分化[52］．

由于TH不能被动地穿过脂质双分子层扩散，组织特异性激素转运体对于T4和T3的细胞外排和摄取都是必需的[53］．有几种蛋白质具有跨膜运输TH的能力。它们在底物特异性、组织表达谱以及主要作用于激素内流还是外流方面存在差异[54］．MCT8, MCT10, OATP1C1, LAT1和LAT2(由基因编码Slc16a2，Slc16a10，Slco1c1，Slc7a5,Slc7a8，分别与TH细胞内流最相关[53］．MCT8基因敲除小鼠骨骼肌基因表达从慢抽搐向快抽搐的调控转变[55，56］．有趣的是，MCT8仅在骨骼肌中低水平表达，MCT8在该组织中功能丧失的影响可以通过这些动物体内循环T3水平的增加来解释，从而驱动激素流入和下游基因激活[55］．mct8缺陷小鼠在肌肉损伤后也表现出肌肉再生受损[57］．MCT8在肌肉卫星细胞中被检测到，而肌肉卫星细胞是负责这一过程的成体干细胞，该细胞类型中MCT8的特异性缺失会损害其分化，这表明构成性MCT8敲除小鼠的再生缺陷并不完全是由于它们上述的血清TH失衡[57］．MCT10是一种与MCT8结构相关的蛋白质，与MCT8相比，MCT10在骨骼肌中表达水平更高[54］．然而，人们对MCT10在骨骼肌中所起的作用知之甚少。最近有研究表明，在腓肠肌中，MCT10的mRNA水平在小鼠衰老过程中呈线性增加，而MCT8的mRNA水平则没有，这表明MCT10具有潜在的稳态调节作用[58］．在啮齿动物中，OATP1C1的表达主要局限于大脑，但在体外培养激活的肌肉卫星细胞中也检测到其表达[57］．最后，LAT1和LAT2也可参与TH的摄取[59，60］．而LAT2在骨骼肌中表达最高[53]时，肌肉卫星细胞中LAT1的mRNA比LAT2的mRNA更丰富[57］．肌肉特异性敲除LAT1减弱了亮氨酸暴露在该组织中mTOR-S6K通路的激活[61］．

关于各种TH转运蛋白的组织特异性表达谱的机制缺乏研究[54，62］．此外，据我们所知，没有研究直接调查了Six TF和TH功能之间的联系。两种途径在MRF表达调控中的重叠调控作用[15，50]及骨骼肌类型规格[28，33，63，64]，表明了两个监管网络之间的相互作用值得研究。通过这项研究，我们证明了甲状腺转运蛋白MCT10在成人骨骼肌中受Six1的直接转录控制。

Six1功能与快收缩肌程序有很强的相关性

我们最初感兴趣的是识别Six1直接控制的基因，这些基因可能与快抽搐表型有关。为此，我们分析了两个基因表达谱数据集。首先，Sakakibara等人的数据集提供了野生型和肌肉特异性Six1敲除成年小鼠(Six1- cko)腓肠肌中的微阵列基因表达概况[28］．其次，Terry等人的muscleDB数据集提供了几种不同小鼠肌肉群的RNA测序(RNA-seq)表达谱[65］．我们从识别Six1- cko腓肠肌中差异表达的基因开始，发现204个基因需要Six1才能正常表达(图2)。1一个;Six1-cKO低表达86个基因，高表达118个基因)。为了研究Six1-cKO腓肠肌中失调控基因与快或慢抽搐特异性表达程序相关的比例，我们考虑了它们在muscleDB数据集中的表达。我们将分析局限于一个肌肉群的子集，主要是快速抽搐(指长伸肌(EDL)、股四头肌、胫骨前肌(TA)、腓肠肌、跖肌，分类在肌群中的第1簇)或缓慢抽搐(比目鱼、指短屈肌(FDB)、横膈膜，分类在肌群中的第2簇)。我们观察到Six1缺失时基因下调与快速收缩肌中正常高表达的基因之间存在显著关联，反之亦然，Six1- cko上调与慢收缩肌中较高的基因表达之间存在显著关联(图2)。1B). Pearson相关系数为−0.72与双尾T测验p计算这些基因的对数折叠变化(Six1-cKO - WT和fast - slow)之间小于0.05的值(图5)。1C)。

为了增加这种分析所识别的基因是Six1的直接转录靶点的可能性，这些基因被注释为接近Six1结合位点。通过染色质免疫沉淀和高通量测序(ChIP-seq)鉴定了6个结合的基因组位点。分离出原代成肌细胞并保持在生长期(MB)或诱导分化48小时，在此期间产生大且完全分化的原代肌管(MT)。在MB和MT样本中使用抗six1抗体或对照IgG进行ChIP-seq。我们在MB中鉴定出11664个高置信峰，在MT中鉴定出7624个高置信峰;MB和MT中均有3985个区域被Six1结合(图。2A和表格S1和S2)．约20%的结合位点靠近基因的转录起始位点(距离起始位点5 kb内);然而，大多数结合位点距离起始位点更远，这表明Six1的相当一部分靶位点代表远端转录增强子(图2)。2B和C)。总体而言，该结果与C2C12成肌细胞的ChIP-on-chip实验结果具有高度可比性[17];提供了ChIP-seq读密度覆盖的例子(图S1A).从头DNA序列motif分析发现MEF3序列元素是six1结合位点中最富集的(motif M1，图。2D)，我们早期对C2C12细胞的研究也发现了这一结果[66］．在7679个仅结合MB的区域中，4311个至少出现了一个MEF3基序(56%)。在仅与肌管结合的序列中，比例相似，为58%。更大比例(72%)的MB和MT中由Six1结合的区域至少有一个MEF3位点。tf识别的已知与肌肉发生有关的其他motif是最丰富的，包括AP-1 (M3 [67，68，69，70])， MRFs (E-box元素，M2 [71，72])， Runx1 (M5 [73，74，75])和Mef2因子(M6 [76，77，78])。在MB和MT中均发现的six1结合位点中，MEF3和E-box元件富集程度最高，而AP-1基序在MB或MB和MT中six1结合位点中富集程度最高。73同样，anti-MyoD ChIP-seq的信号在Six1结合的位点中也最高，在MB和MT中或仅在MT中(图S .1B). Six1和MyoD在染色质上的相似性强调了这两个因素在调节基因表达方面的合作[17］．条件特异性的six1结合位点通过MB和MT中H3K4单甲基化(H3K4me1)的剖面反映出来(图S .)1B):仅以MB为结合单位的位点具有以MB为单位的最高H3K4me1 ChIP-seq信号，而以MT为结合单位的位点在相应样本类型中仅具有较高的H3K4me1信号。组蛋白H3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac)也有类似的情况，MB中Six1结合与MB中H3K27ac信号最高相关，MT中Six1结合位点最高。培养MT中Six1结合位点与成熟骨骼肌组织相关，腓肠肌和比目鱼肌中表现出明显的H3K4me2和H3K27ac信号，染色质开放。在six1结合位点上H3K4me1和H3K4me2信号的存在加强了该TF结合功能远端增强子的概念。最后，利用基因本体(gene ontology, GO)术语富集分析来检测six1结合基因所参与的生物学过程(图。2E).正如预期的那样，与肌肉发育和功能相关的术语显示出显著的丰富。与几种信号通路相关的GO术语显著地表示在Six1-结合基因，包括Wnt, BMP, Hippo通路和MAPK级联。有趣的是，正如我们早期在C2C12细胞中进行的研究所指出的，GO术语与已知受影响的其他组织的发育相关Six1敲除小鼠的耳朵、肾脏和胸腺也显著富集[8，9，79］．

我们在基因表达谱数据中标注了基因是否有邻近位点的信息Six1-结合位点(图;1A、红条中的行注释)。在Six1-cKO肌肉中，近一半的差异表达基因(204个中的100个)具有一个不同的表达Six1-结合位点在MT的附近。有趣的是，Six1-cKO上调的基因很可能与Six1在MT中(118个基因中有57个存在six1结合位点)，而Six1-cKO基因下调(86个基因中有43个)。这一分析揭示了基因可能被直接激活Six1在腓肠肌中与快抽搐表型密切相关。

Six1直接调控MCT10转运体在骨骼肌中的表达

我们的注意力集中在识别快速抽动程序的可能直接控制的调节器上Six1．我们的注意力被吸引到Slc16a10基因(图中红色箭头所示)。1B和C)，这成为了本研究的重点。Slc16a10编码TH的MCT10跨膜转运蛋白，TH与快速收缩骨骼肌形成有关[34］．我们的分析发现MCT10在Six1-cKO腓肠肌中表达下调(图2)。1)．在编码TH内流转运蛋白的5个主要基因中，MCT10在骨骼肌中的表达水平明显高于其他4个被测基因[54］．此外，对muscleDB RNA-seq数据的分析表明，MCT10在快收缩肌组中的表达明显高于慢收缩肌组(图2)。1而且3.A)。其他TH转运蛋白(MCT8, Slco1c1, Slc7a5和Slc7a8)的表达水平明显较低，并没有显示出与纤维类型组成一致的表达谱(图。3.抵扣)。MCT10纤维型特异性表达谱通过定量反转录PCR (qRT-PCR)对从小鼠腓肠肌、比目鱼和TA中分离的RNA进行验证(图。3.F，以及图中Myh1, Myh2, Myh7的剖面比较。3.G-I分别为快型IIX、快型IIA和慢型I的标记)。这些结果，连同先前关于TH在肌肉代谢中的作用的知识，表明MCT10可能是Six1在建立快抽搐表型中的作用的中介。

通过检查我们的ChIP-seq数据，我们注意到一个Six1-结合位点位于MCT10基因转录起始位点上游48个碱基处(图2)。4a - b)。以获得更多的证据证明这一点Six1我们分析了在快抽搐股四头肌和慢抽搐比比鱼中获得的组蛋白标记ChIP-seq和DNA可及性(转座酶可及染色质测定(ATAC-seq))数据[80］．的Six1-结合位点位于一个可能的基因增强子内，其特征是高DNA可及性，存在H3K3me2和H3K27ac，这三个标记在股四头肌样本中都比比目鱼样本更丰富(图。4a - b)。Slc16a2/MCT8位点未显示任何six1结合位点。4相比之下，Myh1(快速，IIX型)和Myh4(快速，IIB型)在股四头肌中显示出更高丰度的组蛋白标记，而Myh2(快速，IIA型)和Myh7(慢I型)在比比鱼中表现出更高丰度(图2)。4Six1在Myog位点的结合也被检测到，与比目鱼相比，这两种组蛋白标记在股四头肌的该位点更丰富。4F)。

验证Six1通过ChIP-seq识别的-结合位点，我们使用抗Six1对照兔IgG检测小鼠后肢骨骼肌组织染色质。然后对ChIP洗脱物(qChIP)进行定量PCR，使用−48 kb增强子特异性引物，Myog近端启动子作为阳性对照(图中蓝框)。4F (17])和阴性对照位点(Hoxd10位点，骨骼肌异色[81，82])。这表明显着富集Six1绑定(图。5)．我们的结果证实了MCT10位点上的−48kb假定增强子是a善意的Six1-binding网站。

Sakakibara等人的微阵列转录组分析(图。1A)在小鼠中获得Six1在胚胎第9天左右切除，此时HSA-Cre转基因首次在肌分裂中检测到[28，83］．为了探索Six1功能丧失对成人肌肉的影响，我们使用肌内短干扰RNA (siRNA)双电穿孔来降低TA肌肉(肌肉db簇1中的另一个主要快速收缩肌肉)中的Six1表达。选择TA是因为其体积较小，与腓肠肌相比，使电穿孔更有效。从电穿孔组织中收集总蛋白和RNA。对sirna处理过的肌肉提取物进行western blot，结果显示Six1蛋白水平相应降低了88%。6采用qRT-PCR方法评价其对靶基因表达的影响。Six1在sisx1敲除条件下，mRNA表达量下降约57%;未见代偿作用，有亲属关系的家庭成员(图;6C). MCT10的表达显著降低Six1-敲除样本，验证了该TH转运蛋白的表达依赖于Six1(无花果。6C).这种效应是MCT10特有的，因为MCT8的表达与Six1可拆卸的。综上所述，这些结果表明TH转运蛋白MCT10是一种直接的靶基因Six1并依赖于该TF在快收缩骨骼肌中达到正常表达水平。

甲状腺通路调节在Six1功能丧失条件下受到负面影响

确定…的影响程度Six1在此基础上，我们选取了4个TH受体靶基因进行qRT-PCR分析:Atp2a1，Slc2a4(Glut4),组织,Ucp3之所以选择它们，是因为它们是骨骼肌中TH信号和TH受体的最佳表征直接靶点之一[40，84，85，86，87，88，89］．MCT10表达下调与Six14个TH通路基因的敲除与此平行(图2)。6D);基因组作为一个整体显著减少表达Six1功能丧失的双向方差分析。该小组的表达降低表明，甲状腺基因组调控通路活性降低Six1可拆卸的。

我们进一步研究了两者之间的联系Six1通过对Sakakibara等人的Six1-cKO基因表达谱数据进行基因集富集分析(GSEA)，研究骨骼肌的TH信号通路和功能。为此，为了研究骨骼肌中与TH作用最相关的基因集，我们从Nicolaisen等人的研究中生成了两个基因集。[41]，通过RNA-seq检测T3治疗和肌肉特异性敲除甲状腺激素受体α基因(Thra-cKO)的影响。具体来说，我们生成了第一组基因，与野生型相比，在t3处理的Thra-cKO肌肉中表达显著降低，而第二组基因表现出相反的行为，在Thra-cKO组织中表达更高。我们发现Six1-cKO中表达较低的基因在Thra-cKO中表达较低的基因中富集(图2)。7在这组基因中，我们注意到Sox6，是慢肌基因转录的抑制因子[90),而Myoz1(Calsarcin 2)，一种阻断NFAT TF慢抽搐程序促进功能的蛋白质[29，91，92］．参与细胞呼吸的四个基因也在这一组中:Idh3a，Ndufs6，Ndufa5,Uqcrq．相反，我们观察到Six1-cKO上调的基因倾向于与条件基因上调的基因重叠Thra肌肉损失(图;7其中，我们注意到钙稳态蛋白Atp2a2，Ryr3,Casq2，葡萄糖稳态的调节因子的基因而且Pdk3慢速肌钙蛋白Tnnc1，Tnnt1,Tnni1以及与脂肪酸代谢有关的基因Abhd1，Acot1，Acsf2,Tecrl．分析结果表明Six1活动与的活动直接相关Thra．总之，这些观察表明Six1在骨骼肌中与TH通路活性有功能性正相关。

MCT10是骨骼肌TH信号通路活性所必需的

研究MCT10下调对TH信号表型的影响Six1当功能缺失时，我们使用siRNA直接敲除MCT10转运体。类似于采用的方法Six1敲低后，将靶向MCT10转录本(siMCT10)的siRNA双联体电穿孔到成人TA肌肉中，并使用qRT-PCR评估mRNA表达水平。siMCT10电穿孔可显著降低MCT10 mRNA的表达水平，而对相关MCT8基因无明显影响(图5)。8A).尽管siRNA敲低后MCT10的表达较低(降低29%)Six1击倒(无花果。6C)， MCT10的下调伴随着TH信号通路基因面板表达的降低(图。8B)，其趋势与Six1击倒条件下观察到的趋势相似(通过双向方差分析(ANOVA)，以组为单位有统计学意义，图。6D)。最后，为了进一步证实MCT10敲低与TH转录应答的降低有关，我们检测了与siRNA双核苷酸同时电穿孔的TH应答荧光素酶报告基因的活性。MCT10敲低导致th依赖报告基因的活性显著降低(图。8C).这些结果表明MCT10是骨骼肌正常TH信号传递所必需的。

结合三个基因组研究分析骨骼肌基因调控(Six1ChIP-seq, Six1-cKO中的表达式分析和muscleDB数据库)，我们强调了两者之间的强关联Six1功能和快速抽搐表型。分析结果不仅证实了这一点Six1与建立腓肠肌中若干基因的正确基因表达谱有关[28，但也重申Six1基因表达的激活因子和抑制因子。之前的报告已经证明了这一点Six1和其他6个家族tf可能与共同调控因子合作抑制转录Sobp［93]以及Dach或Groucho/TLE家族的成员[15，94]，并与Eya家族的辅助因子或SWI/SNF复合物激活转录[15，79，95，96，97］．这种联系Six1以前在培养的成肌细胞和肌管中观察到结合和功能丧失后的基因上调和下调[17但Six1在骨骼肌中转录抑制的确切机制，以及它们如何影响慢或快抽搐表达程序，仍有待发现。我们研究的一个局限是我们的Six1ChIP-seq分析在体外培养的分化的原代细胞中进行，代表来自不同肌肉群的肌肉前体的异质混合物。这是可能的Six1基因组结合数据不仅反映了分化肌纤维表型的维持，如快速收缩程序，而且还暗示Six1在肌源性分化过程中上调这些基因。这可以部分解释为什么Six1的结合位点在慢抽搐特异性Myh7基因附近被发现。4E).全基因组研究Six1在从特定肌群分离的肌纤维中进行的结合，将需要进一步评估该TF在建立和维持慢抽动与快抽动基因表达程序中的功能和作用模式。

我们的基因组学分析显示，在快收缩骨骼肌中，Six1直接调控TH转运蛋白MCT10的表达。确定其他组织类型是否也依赖Six1来表达MCT10将是有趣的。在这种情况下，值得注意的是，Eya1敲除小鼠的甲状腺发育存在缺陷[98]而Six1和MCT10 mrna均在成人甲状腺中检测到[99］．我们注意到Atp2a1是已知的直接目标吗Six1［17，63]，以及图中ChIP-seq和基因表达谱数据的分析。1表明,组织这是这个TF的另一个直接目标。这些基因是否下调后Six1功能的丧失是严格由于减少Six1活动或直接和间接作用的组合(例如，通过解除TH信号的调控)仍有待正式确定，但这些观察结果提高了基因表达组合调控的可能性Six1和TH受体。我们的研究结果也表明，这种情况仍在持续Six1表达是维持成人肌肉中适当的基因表达程序所必需的。

我们在两者之间作了比较Six1缺乏症和甲状腺功能减退症Six1功能丧失和TH信号通路损伤(通过Thra基因消融)在对基因表达的影响方面有相似之处。我们的发现与Six1缺乏症通过降低骨骼肌中TH的进入而导致甲状腺功能减退。相反，甲亢和Six1功能的获得都与快速抽搐程序的获得有关[26，45，46］．然而，由每种条件引起的转录组变化的重叠程度以及MCT10诱导是否是这种机制的一部分仍有待观察。TH信号和之间的串扰的可能性Six1调控的基因程序也值得未来的关注。

作为一个Six1靶基因MCT10被鉴定为影响的中介Six1对骨骼肌TH信号通路的影响不能排除骨骼肌纤维中其他转运蛋白对TH摄取的影响。然而，MCT10似乎在这一过程中发挥了重要作用，而其他转运蛋白无法完全弥补MCT10敲低的影响。成熟肌肉的情况与再生时的情况不同，再生时MCT8和OATP1C1发挥更重要的作用[57］．先前的一篇报道表明MCT10在MCT8/Oatp1c1缺失的情况下可以起到代偿作用[57，在这种情况下，卫星细胞介导的肌肉再生会暂时延迟。MCT8/Oatp1c1敲除小鼠同样表现出神经发育受损，与分化谱系相比，这两种转运蛋白在神经干细胞中表达更高[One hundred.］．在这种情况下，MCT10 mRNA在分化谱系中比其他任何一种转运蛋白都高表达。这得到了蛋白质水平数据的支持，这些数据显示，终分化神经元组织中MCT10表达增加[101］．这些数据表明MCT10在成人组织中具有更大的作用，在发育和分化的早期阶段具有代偿作用的潜力。也有报道在小鼠衰老过程中，腓肠肌中MCT10的mRNA水平显著升高，而MCT8的mRNA水平没有明显升高[58］．因此，现有的证据表明MCT10与TH基因调控程序的成人组织稳态调控密切相关。到目前为止，MCT10基因敲除仅在小鼠中以一种构成方式实现;动物在某些外周器官(包括骨骼肌)中显示出较高浓度的芳香族氨基酸[102]但正常循环TH轴值[103];mct10缺失骨骼肌的表型未被彻底检查。有条件的MCT10肌肉特异性缺失小鼠的表型特征将是重要的，以确定其在该组织发育中的作用，以及在成人代谢表型的建立和维持中的作用。

除了TH转运蛋白外，其他种类的蛋白质也参与TH信号传导。TH的转录作用是由它们的核受体tf介导的Thra而且Thrb．细胞内脱碘酶Dio2而且Dio3将T4转化为效力更强的T3，将T3分别转化为效力更低的T4、RT3或T2。mu - crystin，由Crym基因，是一种高亲和力的细胞内TH结合蛋白，可调节TH进入其核受体和Crym-null小鼠显示快速IIb型肌纤维肥大[104］．在查询muscleDB mRNA表达数据集时，我们发现所有这些蛋白在不同的肌肉群中以不同的水平表达，在快肌群或慢肌群中没有明显的表达偏倚;事实上,Slc16a10/MCT10仍然是表达偏倚最明显的基因(图S2)．在这些基因中，MCT10也是唯一一个受到显著影响的基因Six1条件敲除肌(图;1)．

考虑到TH信号对肌肉功能和代谢的重要性，本文的研究结果表明，TH转运蛋白的表达必须严格控制，我们已经证明Six1通过上调MCT10的表达在调节机制中发挥重要作用。

动物

所有实验使用6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，购自Charles River。采用颈椎脱位法处死小鼠。

ChIP-sequencing

如前所述，对原代小鼠成肌细胞中的Six1进行ChIP-seq检测[23］．测序数据已保存在NCBI基因表达Omnibus (GEO)上，编号为GSE175999。原代成肌细胞从8周龄雌性小鼠中分离，在合流处收获或生长至合流处，在分化培养基(DMEM中添加10%马血清)中培养48 h，生成原代肌管。制剂几乎是纯的，因为95-100%的细胞表达MyoD，在生长期通过免疫荧光检测(未显示)。分化48小时足以获得非常大的肌管，其中发现超过80%的核(与C2C12细胞分化120小时相当，数据未显示)。为了识别six1结合位点，MACS2 [105]在BED模式下使用默认参数，并使用SSP估计片段大小[106］．使用PeakSplitter将大的复合峰分割成单独的峰来细化峰，截断值为70，谷值为0.8 [107］．通过消除MACS2使用输入样本发现的重叠峰、使用IgG与输入对照发现的重叠峰以及mm9基因组黑名单区域，进一步细化了Six1的峰。表S中提供了具有峰值坐标的BED文件1(成肌细胞)和S2(肌管)。使用这些包将Six1 ChIP-seq峰注释到小鼠基因上TxDb.Mmusculus.UCSC.mm9.knownGene而且ChIPseeker［108]，设置距离截断为50kb。表S中提供了基因注释3.和S4．股四头肌和比目鱼的组蛋白标记ChIP-seq和ATAC-seq来自Barish等人的研究[80]并从NCBI Short Reads Archive中获得(条目SRP199043和SRP173476)。C2C12细胞组蛋白标记来自Asp等。[81]和Blum等人。[69] (SRP006743和SRP012465)。TF在原代成肌细胞中的结合来自Umansky等人[73) (SRP040422)。为了简化分析，每种条件下所有可用的生物和技术复制都被合并到一个文件中。读取的适配器和低质量部分使用fastp [109]，利用STAR将它们与小鼠mm9基因组对齐[110]在局部模式下，最大内含子大小设置为1个碱基对，并使用没有基因模型GTF文件构建的基因组索引。只保留了与单个基因组位置对齐的reads。重复的标记使用皮卡[111］．使用deepTools bamCoverage计算全基因组测序覆盖率，不包括标记为重复的reads [112］．在ATAC-seq的特定情况下，bamCoverage被限制在10到130个碱基对之间的成对末端片段，假设代表无核小体区域。对于组蛋白标记ChIP-seq，可作为单端数据，bamCoverage使用使用SSP作为各自库中最常见的染色质片段大小计算的读扩展长度来执行。利用R/Bioconductor制备基因组覆盖图[113]和karyoploteR包(114］．ChIP-seq读密度(覆盖率)热图用deepTools computeMatrix和plotHeatmap制作。

在R/Bioconductor中使用“模因”包进行从头motif发现[115]和STREME计划[116］．将MB-only组、MT-only组和MB- MT组的2500个最高峰下的序列(以ChIP-seq读取数为单位)进行组合。对照序列是相同的一组，使用“通用motif”包和“欧拉”方法进行洗牌以保留双核苷酸频率，k= 2和100的随机种子。新母题与JASPAR数据库中已知母题的相似性[117]使用Tomtom [118］．利用Ame [119]，以各组six1结合峰下的DNA序列为测试集。控制序列集是所有Six1-binding峰下序列的并集，用欧拉方法洗牌，k= 2和随机种子200，使motif发现和富集的控制集不同。

在R/Bioconductor中使用“topGO”包进行氧化石墨烯术语富集分析[120]，以整个小鼠基因为背景。测试集是转录起始位点最接近每个峰值的基因，最大耐受距离为50 kb。只包含至少10个小鼠基因的GO项。P使用Benjamini-Hochberg算法将值修正为错误发现率[121］．

基因表达谱数据分析

Sakakibara研究的基因表达数据[28]是从NCBI GEO检索到的(编号GSE46151)。分析中只包括腓肠肌样本。数据分析使用R/Bioconductor和益生元而且limma包(122，123]，采用RMA归一化和基于基因型的差异表达检测设计。日志₂计算折叠变化，和P使用Benjamini-Hochberg算法调整数值;对于显著性阈值，分别使用0.58和0.05的截断值。差异表达基因列表见补充表S5．基因表达数据来自Terry et al. muscleDB研究[65]是从NCBI GEO(入世GSE100505)和SRA入世SRP110541中检索到的。用fastp修剪Reads，并使用STAR在局部模式下与mm10小鼠基因组对齐，并使用基因模型GTF文件(mus_muscle . grcm38.102)构建基因组索引。从ENSEMBL获得的gtf)。只保留了与单个基因组位置对齐的reads。重复标记，但保留所有下游分析，使用Picard。使用Subread featurets对基因进行读摘要[124］．R/Bioconductor和DESeq2包用于定量和归一化基因表达，并获得方差稳定表达估计[125］．数据聚类和热图生成使用pheatmap包(126］．用于分析数据和生成图形的R脚本(包括包版本和会话信息)作为补充文件Code_S提供1．使用Sakakibara数据和Nicolaisen等人研究中的两个基因集进行基因集富集分析[41］．简单地说，RNA-seq数据(基因读取计数)从NCBI GEO接入GSE146336下载，并在R/Bioconductor中使用刨边机包(127］．数据采用TMM归一化，批效应采用RUVseqRUVr算法和k= 2 [128］．在t3处理的Thra-cKO肌肉中，与t3处理的野生型肌肉相比，基因显著上调或下调(glmQLFTest功能显示FDR < 0.05)，并保存为两个独立的基因集。GSEA在R/Bioconductor中进行clusterProfiler包(129]，除最大基因集大小限制调整为1000外，其余均采用默认参数的fgsea算法。这两个基因集(以Entrez gene ID作为标识符)在补充文件Code_S中提供2．

可以阻止电穿孔

对6 - 8周龄雌性C57BL/6小鼠胫骨前肌进行电穿孔实验。在敲除实验中，在实验第0天，通过踝关节肌腱上方的后肢皮肤肌内注射0.4单位/μL浓度的25 μL透明质酸酶(Worthington)消化TA的间结缔组织，以确保基因物质能够包围并成功转染大部分肌肉纤维[130］．1 h后，将22.5 μL siRNA以20 μM的浓度经后肢皮肤肌注至TA腹部。核酸电穿孔用Tweezertrodes(2桨电极组件，BTX-Harvard Apparatus 45-0165)进行，电极之间有7mm的间隙。注射siRNA后，在皮肤上涂抹超声凝胶，浅涂两发电穿孔，第一个电穿孔中的桨向后肢横矢状方向，第二个电穿孔中桨向后肢横矢状方向。使用BTX ECM 630电穿孔系统进行电刺激，设定为50伏，6个脉冲，50 ms/脉冲，脉冲之间间隔200 ms。实验第3天重复镊子电极电穿孔。非静音控制和Six1——或者Mct10通过Invitrogen (Stealth siRNA技术)获得-靶向siRNA双链，在20 μM下进行重组。序列为sisx1: GCGAGGAGACCAGCUACUGCUUUAA;siMct10: GCGUCUUCACAAUCCUGCUCCCUUU。siNS阴性对照为Stealth RNAi siRNA阴性对照，Med GC序列1(目录号12935300)。为了减少生物变异的影响，在所有实验中，同一只动物的一条腿接受了siNS双链，而另一条腿接受了Six1-或mct10 -靶向siRNA。实验第7天处死所有小鼠。

体内荧光素酶测定

在包括转录报告质粒的体内电穿孔实验中，实验第0天，22.5 μL siRNA与7.5 μL pdV-L1质粒混合，以3 μg/μL的浓度在无菌半盐水(0.45% NaCl)中注射siRNA。该质粒包含两个T3响应元件和位于萤火虫荧光素酶基因上游的SERCA1基础启动子，以及前面有SERCA1启动子的对照组肾草荧光素酶基因(由W.S. Simonides博士(阿姆斯特丹VU医学中心，NL)提供)[131，132］．实验第3天注射只含有如上所述的siRNA。7天后收集处理过的肌肉，用冷却的臼和杵(Plattner’s)在液氮中粉碎，每100 mg组织块重新悬浮在100 μL的被动裂解缓冲液(Promega)中。荧光素酶检测结果通过在Glomax Luminometer中使用50 μL荧光素酶检测试剂(Promega)读取5 μL裂解液获得。萤火虫荧光素酶信号读数归一化为Renilla荧光素酶读数，以控制电穿孔效率的可变性。

RNA提取

所有样品在1 mL TRIzol试剂(Invitrogen)中提取。解剖和粉碎的TA样品放置在Lysing Matrix D管(MP Biomedical)的TRIzol中，并在MagNa Lyser机器(Roche)中均质，程序为7000 RPM，共进行三次20秒的爆破，中间在冰上冷却10秒。然后将样品在4°C, 12000 g下旋转5分钟以去除脂肪含量。RNA提取按照TRIzol制造商的建议进行。RNA通过DNase I (RNase-free, New England Biolabs)处理和制造商推荐的酶热失活进一步纯化。

反转录

根据制造商的建议，使用SuperScript III第一链合成系统(赛默飞世尔)，使用随机六聚体方法和反应后RNAse H处理，使用500 ng经过dnas处理的总RNA将RNA反转录为cDNA。PCR前将cDNA样品用10 mM Tris pH 8.0稀释至50 μL。

染色质免疫沉淀反应

对于ChIP实验，每次复制都使用两只小鼠的所有后肢肌肉进行。组织在低渗缓冲液(25 mM pH 7.8, 1.5 mM MgCl)中冰上解剖并均质₂， 10mm KCl, 0.1% (v/v) NP-40和蛋白酶抑制剂)，使用特氟龙波特- elvehjem均质器安装在台式钻头上。从11X溶液(11%甲醛，0.1 M NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.5 M EGTA, 50 mM HEPES pH 8.0)中加入甲醛，室温下10分钟。用0.125 M甘氨酸在室温下淬火5 min。样品以1000 g在4℃下旋压5min，重悬于新鲜低渗缓冲液中，经70 μm细胞过滤器过滤，再以1000 g在4℃下旋压5min，再悬浮于650 μL超声缓冲液(10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.1% (w/v) SDS和蛋白酶抑制剂)中。通过离心收集核颗粒，并在核裂解缓冲液(200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl pH 8和蛋白酶抑制剂)中裂解。将核制成球团，在650 μL超声缓冲液(1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.5% (w/v)萨科齐钠，10 mM Tris-HCl pH 8.0和蛋白酶抑制剂)中重悬。所有超声均使用振幅为40%的探头超声器进行，进行60个周期，1秒剪切DNA, 4秒冷却。其余的分析按照先前发表的方法进行[17]，每个样品25 μg染色质，用Protein A sepharose珠进行预处理，每个样品2 μg抗体孵卵过夜，珠洗7次，SDS结合交联逆转洗脱，苯酚萃取，乙醇沉淀法清除DNA。ChIP所用的一抗为抗six1(兔多克隆HPA001893, Sigma)和正常兔IgG (Jackson ImmunoResearch)。最后的微球在50 μL 10 mM Tris-HCl pH 8.0中重悬，进行下游qPCR。

qPCR

在含有SYBR Green I HotStarTaq酶(Qiagen)的反应中对cDNA和ChIP样品进行qPCR。相对定量是使用标准曲线进行的池化的等分的每个cDNA样本被检查。由于库中每个基因的绝对mRNA丰度是不同的，因此可以在样品间比较给定基因的表达，但不能直接比较不同基因的表达水平。相反，qChIP的标准曲线是用输入的基因组DNA制作的;假设每个基因都存在于基因组中相同的等位基因数量中，可以直接比较不同基因的富集水平。所有样本均作为技术三次重复运行，并取其几何平均值。在qRT-PCR中，通过18S核糖体RNA和的几何平均值得到相对表达量Actnb，它们在实验条件下是不变的[133］．对于每个实验，图表显示单个生物复制(实验小鼠)作为单独的点，以及它们的平均值和标准误差。寡核苷酸序列见表S6．

蛋白提取，定量，免疫检测

肌肉蛋白按照制造商推荐的程序从TRIzol有机相中提取。蛋白质颗粒在尿素-SDS样品缓冲液(6 M尿素，1% SDS, 20 mM Tris pH 6.8)中以每1 mg组织约3 μL缓冲液的比例溶解，并在4°C下轻轻摇晃过夜。使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Scientific)测定样品蛋白质浓度。一抗是抗six1(兔多克隆HPA001893, Sigma)和抗- tubulin(小鼠单克隆杂交瘤克隆E7, DSHB)。二抗与HRP结合。在x射线胶片上获取信号，随后将其数字化并在FIJI软件中进行密度定量分析。

统计分析

所需要的重复数是根据经验确定的，以获得足够的统计力。没有样品被专门排除在分析之外。R和rstatix进行统计分析[134］．qPCR、密度测定和荧光素酶测定的统计学意义由配对确定T测试，总是将用敲低siRNA电穿孔的实验肌肉与用siNS电穿孔的同一动物的对侧肌肉配对。在已有数据表明影响方向的情况下，采用单侧检验。P≤0.05的值被认为是有显著差异的均值。在适用的情况下，对p值的计算采用Benjamini-Hochberg方法[121］．除非另有说明，每次实验获得不少于3个生物或技术重复。统计分析的控制样本组和实验样本组总是使用相同数量的技术和生物重复。在mRNA表达的情况下，TH信号基因面板(由Atp2a1，组织，Slc2a4,Ucp3后)Six1或MCT10敲低后，对独立分类变量“Gene tests”和“siRNA duplex used”对因变量“Normalized expression”的影响进行双向ANOVA检验。正态分布和方差齐性假设分别被Shapiro-Wilk和Levene检验证实。P“使用siRNA双工”的效果值是显著的，并有报道。

的ChIP-seq数据Six1基因组结合谱已沉积在NCBI基因表达Omnibus (GEO)上，编号为GSE175999。

方差分析:

方差分析

ATAC-seq:

转座酶可及染色质测定

芯片:

染色质免疫沉淀反应

ChIP-seq:

染色质免疫沉淀，高通量测序

联盟:

指长伸肌

身上:

指短屈肌

走:

基因本体论

GSEA:

基因集富集分析

H3K4me1:

赖氨酸4上组蛋白H3的单甲基化

H3K4me2:

赖氨酸4上组蛋白H3的二甲基化

H3K27ac:

赖氨酸27上组蛋白H3的乙酰化

m:

成肌细胞

磁流变液:

肌源性调节因子

MT:

肌管

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

qChIP:

染色质免疫沉淀，定量聚合酶链反应

存在:

逆转录，然后定量聚合酶链反应

RNA-seq:

RNA序列

rt - pcr:

逆转录之后是聚合酶链反应

siMCT10:

短干扰RNA靶向MCT10

罪:

非沉默短干扰RNA

核:

Short-interfering RNA

siSix1:

短干扰RNA靶向Six1

Six1-cKO:

Six1条件敲除

助教:

胫前肌

TF:

转录因子

TH:

甲状腺激素

Thra-cKO:

甲状腺激素受体α基因条件敲除

混乱关系:

甲状腺激素反应元件

作者要感谢以下个人或团体的贡献:Sarah Hemens和Jack Guthrie的实验协助;渥太华大学动物护理和兽医服务的工作人员提供技术援助;麦吉尔大学和Génome Québec创新中心的ChIP-seq文库制备和高通量测序;加拿大计算和技术人员的高性能计算访问和支持;Warner Simonides(阿姆斯特丹，荷兰)的TRE报告质粒。由M. Klymkowsky开发的E7抗β -微管蛋白杂交瘤从发育研究杂交瘤库获得，由NIH NICHD创建，并保存在爱荷华大学生物系，爱荷华市，IA 52242。作者感谢加拿大卫生研究所的财政支持。

这项工作是由加拿大卫生研究所的运营拨款(MOP 119458)支持给a . B.资助者在研究的设计、数据收集、分析、数据解释或撰写手稿中没有任何作用。

作者及隶属关系

1. 渥太华大学医学部生物化学、微生物和免疫学系，加拿大安大略省渥太华史密斯路451号，K1H 8M5

   John Girgis, Dabo Yang, Imane Chakroun，刘玉兵和Alexandre Blais

2. 渥太华系统生物学研究所，渥太华，安大略省，加拿大

   John Girgis, Dabo Yang, Imane Chakroun，刘玉兵和Alexandre Blais

3. 阿卜杜拉国王科技大学生物与环境科学与工程学部，沙特阿拉伯Thuwal, 23955-6900

   约翰Girgis

4. 渥太华大学炎症、免疫和感染中心(CI3)，渥太华，安大略省，加拿大

   亚历山大Blais

贡献

AB设计了这项研究，获得了资金，进行了基因组学实验，分析了数据，并撰写了手稿。JG进行实验并分析数据，DY进行实验，YL和IC进行实验并分析数据。所有作者都阅读、编辑并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到亚历山大Blais．

伦理批准并同意参与

手术过程遵守渥太华大学动物护理和使用委员会、加拿大动物护理委员会指南和动物研究法案。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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