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在Matrigel上使用低融合培养改进的CRISPR/Cas9基因编辑原代人成肌细胞gydF4y2Ba

骨骼肌gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba11gydF4y2Ba、物品编号:gydF4y2Ba23gydF4y2Ba（gydF4y2Ba2021gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用本文gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

CRISPR/Cas9是研究细胞生物学和开发分子疗法的宝贵工具。然而，CRISPR/Cas9组件进入某些细胞类型仍然是一个主要障碍。原代人成肌细胞是肌肉研究中一种有价值的细胞模型，但众所周知难以转染。目前还没有针对原代成肌细胞量身定制的商业脂肪转染方案，大多数通用指南只是推荐转染高流畅度的健康细胞。这项研究旨在最大限度地在原代人成肌细胞中转染和编辑CRISPR/Cas9。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

由于细胞增殖的增加与转染效率的提高有关，我们研究了已知影响成肌细胞增殖的两个因素:细胞合流性和基底膜基质Matrigel。CRISPR/Cas9编辑是通过脂肪转染将Cas9核糖核蛋白复合物传递到原代人成肌细胞中，在有或没有Matrigel涂层的孔中培养，以低(~ 40%)或高(~ 80%)的合流度进行。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在低融合度转染的细胞中，转染水平最高，并且在三个不同的目标位点上进行了最有效的编辑，最高编辑效率为93.8%。平均而言，在这些条件下，与商业推荐(高流畅度、未涂覆的井)相比，编辑效率提高了40倍。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究提出了一种简单、有效和经济的方法，最大限度地利用CRISPR/ cas9介导的人原代成肌细胞进行基因编辑。该方案可能是改善培养的人类骨骼肌细胞的遗传操作的有价值的工具，并有可能适用于其他细胞类型。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

CRISPR/Cas9现在是基因组学领域的重要工具。2012年首次提出[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]，该系统使用可编程向导RNA (gRNA)将Cas9内切酶靶向到特定的DNA序列进行切割。这种对基因组的精确编辑加速了疾病模型、基因疗法和我们对整个基因组的理解的发展。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Cas9可以作为DNA(通过质粒)、mRNA或蛋白质传递到细胞中。后一种方法由Kim等人于2014年首次描述。[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，涉及递送纯化的Cas9酶与gRNA预络合以形成Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物。由于与基于质粒或mRNA的传递相比，该方法具有更高的编辑效率和更少的脱靶效应，因此在许多情况下受到青睐[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．尽管CRISPR/Cas9是一个相对简单和灵活的系统，但将这些成分有效地递送到某些细胞类型中仍然是一个主要挑战[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．最常用的转染方法是基于脂质(lipofection)，因为它易于使用和经济[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．然而，对于不同的细胞类型，并没有放之四海而皆准的协议。一些细胞非常适合转染，而另一些细胞则是难治性的和/或转染后死亡率很高[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在神经肌肉疾病的背景下，培养成肌细胞是研究细胞生物学和疾病机制的有价值的工具。两种最常用的体外肌肉模型是永生化C2C12成肌细胞和干细胞来源的肌肉培养[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．然而，C2C12s来源于小鼠[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba因此，它们与人类有不同的肌肉形成机制——例如，敲除gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba不影响gydF4y2BaMYF5gydF4y2BaMyf5蛋白在人成肌细胞中表达，而Myf5蛋白在gydF4y2BaMyod1gydF4y2Ba-null小鼠成肌细胞[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．虽然人类基因组背景是一个有效的模型，但它与基因组编辑研究特别相关。此外，C2C12s通常基因组不稳定，核型异常[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．由于DNA修复机制经常出现缺陷，干细胞同样容易发生突变和非整倍体[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．虽然C2C12s和干细胞都是肌肉研究的宝贵工具，但我们希望扩大骨骼肌模型的武器库，这些模型(i)在人类基因组背景下保持稳定的基因表达谱，(ii)可以有效地转染和/或编辑分子研究。因此，我们专注于提高原代人成肌细胞的转染和编辑效率。gydF4y2Ba

虽然通常被认为是对体内环境的更好反映，但原代细胞的性质存在许多实际限制。与已建立的细胞系不同，它们的寿命有限，不能连续传代[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．尤其是原代成肌细胞难以转染，特别是与永生化成肌细胞如C2C12s相比[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．成肌细胞的转染传统上是通过传递DNA质粒进行的，在这里，脂肪转染效率通常< 10%，很少超过50% [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．使用RNP货物的肌肉研究主要是在肌源性分化之前的干细胞上进行的，和/或使用其他递送方法。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．许多研究尝试使用各种转染方法和细胞选择过程来提高成肌细胞转染效率[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．例如，与脂肪转染相比，电穿孔和核转染可以提高转染效率。然而，相比之下，这些方法比较昂贵，需要专门的设备和更多数量的CRISPR/Cas9试剂[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．荧光活化细胞分选(FACS)可用于富集含有荧光标记的CRISPR/Cas9组分的细胞[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．编辑后的细胞也可以进行单细胞克隆，以生成包含所需编辑的同质(克隆)细胞群。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．然而，原代成肌细胞在单细胞克隆后失去了分化潜力，而那些已经成功编辑的细胞通常无法在分选的压力下存活(我们自己未发表的研究结果)。没有克隆群体的选择，从大量群体中获得可靠和信息丰富的数据需要尽可能高的编辑效率。因此，我们使用了一种系统的方法来确定影响原代成肌细胞转染和编辑效率的因素。gydF4y2Ba

细胞增殖率以前与转染效率有关，其中转染成功是基于转基因表达来衡量的[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．因此，操纵影响增殖率的因素有可能提高转染效率。成肌细胞培养物的增殖速率与融合性有内在联系[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．大多数伴随流行转染试剂的方案推荐在转染时相对较高的细胞融合度- 60 - 90%的融合度用于Lipofectamine™2000,3000和RNAiMAX (Invitrogen™)，Fugene®(Promega)和Alt-R®CRISPR/Cas9 RNP (Integrated DNA Technologies)。然而，成肌细胞开始融合形成肌管，融合度约为70%，并停止增殖[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，因此变得难以转染。在较低的细胞密度(例如，在成肌细胞增殖最大的时期)转染可能提高转染效率。Jackson等人也支持这一观点，他们报道C2C12成肌细胞质粒转染的最佳合流度为40% [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．另一个促进成肌细胞增殖的已知因素是细胞外基质的使用，如Matrigel，一种主要由层粘连蛋白、IV型胶原和肌动蛋白组成的制剂[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．因此，Balci和Dincer发现，在Matrigel上播撒C2C12成肌细胞增加了它们的增殖，并将脂质介导的质粒摄取提高了2倍[qh]gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然低细胞融合度和Matrigel分别被证明可以提高C2C12成肌细胞转染效率，但尚未有研究将这些策略联合使用。了解Matrigel、confluent、转染效率和CRISPR/ cas9介导的编辑之间的关系，可能有助于在大量原代成肌细胞中最大限度地进行编辑。这反过来又可以增强研究人类骨骼肌功能对基因操纵的反应的能力。gydF4y2Ba

在这里，我们报告了一种优化的转染方案，该方案使用Lipofectamine™CRISPRMAX™有效地将CRISPR/Cas9 RNPs传递到三种主要的人成肌细胞系。与大多数商业方案相反，CRISPRMAX™建议在更广泛的细胞密度范围内优化转染(30-70%合流度)，使我们能够在光谱的低端和高端测试细胞密度。因此，我们比较了在低或高confluent转染细胞的转染和编辑效率，无论是否使用Matrigel。通过测试这些组合，我们建立了一种方案，使人类原代成肌细胞的编辑率平均为50%，最高可达93.8%。我们描述的工作流程可用于优化其他难以转染的细胞类型的转染和编辑条件。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

人原代成肌细胞培养gydF4y2Ba

从Cook MyoSite®中获得3个原代人骨骼肌细胞系(skMDCs)。所有细胞系均来自健康供体的腹直肌:一名18岁高加索男性(18M;供体产品批号01236-18M)， 32岁白人女性(32F;供体产品批号01034-32F)和一名42岁白人女性(42F;供体产品批号01269-42F)。g显带法证实正常二倍体核型(PathWest诊断基因组实验室)。SkMDCs在37℃和5% CO下保持gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在MyoTonic™基础培养基(Cook MyoSite®)和生长补充剂(Cook MyoSite®)中，添加10%牛血清(Gibco)， 50 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素。如有需要，细胞培养板涂上在Dulbecco改良eagle培养基F12 (DMEM/F12，内部)中稀释1:100的Matrigel(标准无ldev配方，康ning®)，并在37°C下孵育1小时。使用前立即抽吸剩余培养基。gydF4y2Ba

skmdc的转染gydF4y2Ba

转染前一天，将细胞(传代7或以下)接种于matrigel包被(MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba)和未涂层(毡)gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba) 12孔板。使用血细胞计和标准台盼蓝染色人工计数细胞。然后在高/商业推荐的合流度(Hi， ~ 4.8 × 10)下进行电镀gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞/;~ 1.4 × 10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或低合流(Lo， ~ 2.4 × 10)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞/;~ 6.8 × 10gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，使用连续稀释。转染时(播种后~ 24 h)细胞融合度为~ 80% (Hi)或~ 40% (Lo)。gydF4y2Ba

在转染之前，使用相衬显微镜(Olympus IX71显微镜，Olympus CellSens Standard 2.3软件)在4倍物镜下对每个孔的中心进行成像。在所有条件下的所有时间点对井的中心区域进行成像。使用ImageJ 1.52i (ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)对每张图像中的细胞数量进行计数。简单地说，将所有图像转换为8位灰度，并将像素阈值限制设置为0和165以检测成肌细胞。使用“Analyze Particles”工具对面积为> 200 μm的颗粒进行计数，计数细胞数量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。最终的计数是根据井的表面积进行缩放的。gydF4y2Ba

为了评估CRISPR/Cas9编辑，我们针对两个已被充分表征的肌生成调节因子(gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba)，以及最近发现的肌生成调节剂;高度保守的骨形态发生蛋白激动剂;gydF4y2BaGREM1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．Alt-R®CRISPR/Cas9 tracrRNA ATTO™550 (IDT)和带有XT修饰的引导rna (IDT)，参见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在Nuclease-Free Duplex Buffer中重悬至浓度为100 μM。每个导片(crRNA)与tracrRNA 1:1混合，95℃加热5 min，室温慢速冷却。所得的单导RNA (sgRNA)复合物在Opti-MEM (Gibco™)中以1:100稀释至1 μM。Alt-R®s.p. Cas9 Nuclease V3 (IDT)在使用前立即用Opti-MEM稀释至1 μM。gydF4y2Ba

使用Lipofectamine™CRISPRMAX™Cas9转染试剂(Invitrogen™)将CRISPR/Cas9组分递送至skMDCs。转染按照IDT手册“Alt-R®CRISPR/Cas9系统:CRISPR核糖核蛋白复合物进入哺乳动物细胞的阳离子脂质递送”中的描述进行[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．体积扩大了8倍，用于12孔板。未经治疗的对照组(UT，gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba无RNP)和阴性对照(NC，即混乱的指南)包括每个细胞系和条件。实验首先在单个细胞系上进行优化，然后在所有三个细胞系上重复。对一些指导和条件进行了重复实验，以证实研究结果。gydF4y2Ba

转染24小时后刷新培养基，在成像前去除细胞碎片和细胞外荧光复合物。48小时后再次成像并采收。用1倍Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)冲洗细胞，用0.05%胰蛋白酶- edta(室内)在37℃下孵育5分钟，300倍离心成球gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。将颗粒快速冷冻在干冰上提取DNA或重悬在FACS缓冲液中进行分选。gydF4y2Ba

荧光活化细胞分选(FACS)和分析gydF4y2Ba

每孔总细胞重悬于200 μL FACS缓冲液(25 mM 1 M HEPES, pH 7.5;2 mM 0.5 M EDTA, pH 8;用BD FACSDiva™软件(版本6.1.3)在BD FACSAria™II上处理。在每个细胞系未处理的样品上设置门，用550 nm激光检测ATTO 550，用640 nm激光检测APC-Cy7作为阴性对照。使用FlowJo (Version 10.0.7)进行数据分析。在单个细胞上计算ATTO 550的中位荧光鉴定(MFI)(基于FSC和SSC进行门控)。转染效率以ATTO 550阳性百分率(ATTO 550)计算gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)细胞数除以被分析细胞总数(gydF4y2BangydF4y2Ba=每个样本10000个细胞)。ATTO的阈值gydF4y2Ba+gydF4y2Ba根据匹配的未处理样本设置细胞。在流式细胞仪下，每个样品在300倍离心下成球gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟提取DNA。gydF4y2Ba

skmdc的DNA提取gydF4y2Ba

按照制造商的说明，使用QIAamp DNA迷你试剂盒(QIAGEN)从skMDC细胞颗粒中提取DNA，但进行了轻微修改。简单地说，细胞微球在100 μL PBS中重悬，随后的试剂盒体积相应缩放。采用QIAamp MinElute自旋柱(QIAGEN)进行DNA纯化，洗脱体积小(10 μL)，可最大限度地提高提取DNA的浓度。DNA在10-15 μL UltraPure™DNase/RNase-Free蒸馏水(Invitrogen™)中洗脱。使用NanoDrop™One分光光度计(ThermoFisher)测量DNA浓度和纯度。gydF4y2Ba

聚合酶链反应(PCR)和桑格测序gydF4y2Ba

所有PCR反应均按照制造商的说明使用GoTaq®2x无色主混合物(Promega)进行，每次反应50 ng DNA。gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba反应中含有20%的q -溶液(来自QIAGEN)gydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶试剂盒)。gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba反应中加入5% DMSO。引物序列和热循环条件在附加文件中列出gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。PCR扩增子在1%琼脂糖凝胶上分析，以确定其大小和特异性。扩增子纯化和双向Sanger测序在珀斯的澳大利亚基因组研究设施进行。gydF4y2Ba

定量聚合酶链反应(qpcr)gydF4y2Ba

按照制造商的说明，使用Rotor-Gene SYBR®绿色PCR试剂盒(QIAGEN)进行所有qpcr。在Rotor-Gene Q 5plex HRM PCR循环仪上进行反应，使用Rotor-Gene Q Series Software, Version 2.3.1将结果可视化。一个管家基因，gydF4y2BaEEF2,gydF4y2Ba用于归一化。引物序列和热循环条件在附加文件中列出gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

数据分析与统计gydF4y2Ba

使用在线工具TIDE (Tracking of indes by Decomposition)从桑格色谱图计算编辑效率[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．采用GraphPad Prism 8.0.1进行统计学分析。所有报告的值都是每个实验至少三个重复的平均值±SD。采用单因素方差分析(ANOVA)，然后采用Holm-Sidak或Tukey事后检验(视情况而定)来检验三人或三人以上组之间的差异。采用双向重复测量(RM)方差分析和Sidak的多重比较检验来评估细胞计数随时间的差异。使用线性回归分析确定两个变量之间的关系。配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试用于评估阴性对照和敲除组之间基因表达水平的差异。所有统计检验的显著性阈值定义为gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Matrigel增加skmdc的增殖gydF4y2Ba

Matrigel对细胞增殖的积极作用已得到证实[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．我们执行了一个小实验，以确认在skMDC行中也会看到相同的效果。我们通过计算Mat中未经处理的细胞数量来实现这一点gydF4y2BaposgydF4y2Ba和垫gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba电镀后24,48和72 h的井(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。24 h时，两组细胞数量无显著差异gydF4y2BaposgydF4y2Ba和垫gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba条件(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.41)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).然而，在48小时内gydF4y2BaposgydF4y2Ba孔的细胞数量是Mat的1.5倍gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba井(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0067)。随着融合度的增加，增殖速度减慢，到72 h时，两种情况之间的差异不再显著(差异约1.2倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.27)。为了支持之前的报道，这些数据表明，与未涂膜的细胞相比，在Matrigel上播种的skmdc具有更高的增殖率。此外，这表明skMDCs遵循哺乳动物细胞的典型s型生长曲线[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，随着细胞数量的增加，增殖速度减慢。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

基质上电镀可增加原代人成肌细胞(skMDCs)的增殖。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba未处理细胞在Matrigel包被(MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba;iv, v, vi)和未涂层(MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba;I、ii、iii)播种后24、48和72 h的井(~ 6.8 × 10gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2BaBgydF4y2Ba三个skMDC细胞系的增殖率，相对于细胞数(0 h时的值= 1)。数据以平均值±SD报告。采用Sidak多重比较的双向重复测量方差分析进行统计。gydF4y2Ban =gydF4y2Ba5 (1× 18米，1× 32f, 3× 42f);gydF4y2Ba** = p < 0.01。gydF4y2Ba比例尺= 1mmgydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

使用Matrigel和低细胞合流达到最大转染gydF4y2Ba

为了评估confluent和Matrigel对转染效率的影响，我们测量了不同条件下转染后gRNA-ATTO 550阳性的成肌细胞比例。Lo/Mat下转染的细胞gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件具有最高的中位荧光强度(mfi)(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA, B)，明显大于Lo和Hi/MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba条件(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.039和gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.028)，而不是Hi/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba（gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.28)。这表明成功转染了Lo/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba与在其他条件下转染的细胞相比，每个细胞含有更多的RNP复合物。以及在单细胞水平上较高的转染率，Lo/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba在所有三个skMDC供体系中转染的细胞比例最大(95.1%±2.58)。这明显大于Lo/MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba(74.4%±2.17;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0088)和Hi/MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba条件(75.4%±6.26;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0098)，而不是Hi/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba条件(87.97%±5.07;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.26)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC). Hi/Mat之间无显著差异gydF4y2BaposgydF4y2Ba或者是Lo/MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba或嗨/垫gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba条件(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.26gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.061)。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

使用Matrigel和低细胞融合度实现了skMDCs的最大转染。采用荧光活化细胞分选法(FACS)分析atto550的比例gydF4y2Ba+gydF4y2Ba不同转染条件下的细胞。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaskMDC-42F的图像显示为所有三条线的代表图像。550年阿gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在未处理的样品(i)上设置门。X轴显示低(ii)和高(iii)合流转染的细胞中ATTO 550的中位荧光强度(MFI)。细胞中atto550的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba为Mat所示gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba(红色)和MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba(蓝色)条件。gydF4y2BaBgydF4y2Ba以Lo/Mat转染的细胞MFI最高gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件。箱形图显示了3个细胞系的最小、最大和中位数mfi。gydF4y2BaCgydF4y2Ba在不同条件下，对三个skMDC细胞系的转染效率进行了量化。数据代表平均值±SD。采用Holm-Sidak多重比较检验进行单因素方差分析;gydF4y2Ba每种条件n=3 (1× 18M, 1× 32F, 1× 42F);** = p < 0.01gydF4y2Ba。gydF4y2BaDgydF4y2Ba转染的skMDCs相对于细胞数的增殖率(0 h归一化为1)。报告的数据为平均值±标准差。采用Sidak多重比较的双因素方差分析，gydF4y2Ban = 5 (1× 18M, 1× 32F, 3× 42F);* = p < 0.05;** = p < 0.01;**** = p < 0.0001。UT =未经治疗;Lo =低流畅性，Hi =高流畅性;垫gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba=未涂覆井;垫gydF4y2BaposgydF4y2Ba=基质涂层井gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

先前的研究也将脂肪感染效率与多种细胞系的毒性增加联系起来[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．为了评估这是否适用于skMDCs，我们在转染时计数细胞数量，然后在转染24小时和48小时后计数。无论在低和高合流条件下，Mat的数目gydF4y2BaposgydF4y2Ba转染后24小时内，细胞开始衰退，而转染后24小时内gydF4y2Ba负的gydF4y2Baskmdc继续呈上升趋势(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaD).转染后48 h, Lo/Mat中细胞数量gydF4y2BaposgydF4y2Ba与Lo/Mat条件相比，显著降低gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba条件(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。在所有3种供体人成肌细胞系中，转染与细胞活力之间也存在同样的负相关关系。gydF4y2Ba2gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba

总的来说，我们的结果表明，与Matrigel阴性条件相比，在低融合度条件下将成肌细胞播种在Matrigel上可产生更高的转染水平。gydF4y2Ba

在低合流性和矩阵阳性条件下，编辑率高达93.8%gydF4y2Ba

为了确定当细胞以低合流度播种在matrigel包被的孔上时，CRISPR/Cas9编辑效率是否也会提高，我们转染了所有三个skMDC系，并针对三个不同的基因(gydF4y2BaMYF5 MYOD1,gydF4y2Ba和gydF4y2BaGREM1gydF4y2Ba)。每个导体应诱导单个dsDNA断裂，随后通过非同源末端连接修复。利用TIDE自动计算编辑效率、突变类型和频率。最常见的结果是在目标切割部位出现单个indel。一个指南设计，PCR，测序和TIDE分析的例子显示在附加文件中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

对于每个skMDC系中的所有三个靶点，在Lo/Mat转染的肌母细胞中实现了最高的编辑效率gydF4y2BaposgydF4y2Ba(52.4±17.8%;gydF4y2BangydF4y2Ba≥11个条件)，最大编辑率为93.8%(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).这明显高于下一个最佳条件组Hi/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba(32.8±7.1%;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0007)，以及Hi/MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba:(12.2±7.0%;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和Lo/MatgydF4y2Ba负的gydF4y2Ba(10.8±5.4%;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。在比较单个目标时也可以看到相同的模式，尽管不同导线的绝对编辑效率不同(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC).平均编辑效率gydF4y2BaGREM1gydF4y2Ba在所有条件下都明显高于两者gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba（gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0002)gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba（gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0012)。这种差异在罗/马特时期最为明显gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件下，其中平均编辑效率为gydF4y2BaGREM1gydF4y2Ba分别为69.65±11.79%和39.48±7.66%gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba（gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， 43.90±13.49%gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba（gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0029)。虽然融合并没有影响Mat的编辑gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BaRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.030,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.63)，转染时的细胞数与Mat下的编辑效率呈显著负相关gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件(gydF4y2BaRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.75,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0012;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB).总的来说，这些数据表明，与其他条件相比，转染低融合度的成肌细胞产生的编辑量要高得多。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

矩阵和低合流条件下的编辑效率最高。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba所有编辑实验的编译结果。在不同的条件下，用三种向导中的一种转染三个skMDC系的重复。gydF4y2BaBgydF4y2Ba编辑效率与转染时细胞数量的相关性。细胞计数与编辑效率之间存在明显的负相关关系gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件(gydF4y2BaRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.75;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0012)。gydF4y2Ban /条件= 5 (1× 18M, 1× 32F, 3 × 42F)gydF4y2Ba。gydF4y2BaCgydF4y2Ba各工况下导轨的编辑效率比较。不同的skMDC供体细胞系用不同的符号表示。实验采用Lo/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba为了证实我们的发现，我们重复了实验条件。gydF4y2BaDgydF4y2Baatto550百分比的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞和gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba三个skMDC株系在不同转染条件下的编辑效率。gydF4y2BaEgydF4y2BaMFI与gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba三个skMDC株系在不同转染条件下的编辑效率。gydF4y2Ba所有数据点都代表单独的重复。误差条显示平均值±SD。** = p < 0.01;*** = p < 0.001;**** = p < 0.0001。NC =阴性对照;Lo =低流畅性，Hi =高流畅性;垫gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba=未涂覆井;垫gydF4y2BaposgydF4y2Ba=基质包覆井;MFI =中位荧光强度gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

编辑的性质在细胞系、转染条件和编辑效率上是相似的gydF4y2Ba

我们使用由TIDE算法生成的数据来评估skmdc中编辑的性质。TIDE可以识别不同大小的索引(默认参数< 10 bp)，并且在单次插入的情况下，计算四种可能插入的碱基(A,G,C,T)中的每一个的频率[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．为此，我们研究了发生在每个目标基因中的编辑的性质。无论细胞系、编辑效率和转染条件如何，每种指南的索引性质都是相似的(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA).单核苷酸插入和/或缺失最为常见，占所见编辑的83.95±17.43%。大多数gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba编辑后的细胞含有单个核苷酸插入，占鉴定的索引的82.05±3.62%，最常见的是胸腺嘧啶(c.249_250insT;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)。单个缺失和/或插入分别占74.34±3.08%和95.37±2.03%gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba和gydF4y2BaGREM1gydF4y2Ba分别编辑单元格。在这两种情况下最常插入的碱基都是单个胞嘧啶(gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba: c.426_427insC;gydF4y2BaGREM1gydF4y2Ba: c.312_313insC)。这些指数的非随机性与以往的研究结果一致[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．预计所有这些编辑都会在转录本的早期引起移码，因此应该通过无义介导的衰变导致基因表达的下调。gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

编辑的性质在细胞系、转染条件和编辑效率上是相似的。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而在Lo/Mat下转染的细胞中，显示某种形式indel的序列百分比明显更高gydF4y2BaposgydF4y2Ba出现索引的条件、比例和类型都是相似的gydF4y2Ba(每种条件n = 3 - 1× 18M, 1× 32F, 1× 42F)gydF4y2Ba。gydF4y2BaBgydF4y2Ba最常插入的单个核苷酸在细胞系和每个目标条件之间遵循类似的模式。由于较低的编辑水平，在矩阵负条件中存在较大的可变性gydF4y2Ba(每种条件n = 3 - 1× 18M, 1× 32F, 1× 42F)gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

编辑效率的差异不能仅仅用转染效率的差异来解释gydF4y2Ba

基于CRISPR的编辑需要成功传递CRISPR/Cas9组件;然而，编辑效率和转染效率之间并不总是直接相关的[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．我们在用荧光标记(ATTO 550)编辑的成肌细胞中评估了这种关系gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)针对已知肌肉基因的指南(gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba)，使用FACS定量转染效率。转染效率与三种细胞系在所有条件下的编辑均呈正相关(gydF4y2BaRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.85,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD);然而，编辑程度不成比例地高于仅用转染效率可以解释的程度。例如，ATTO 550多1.26(±0.01)倍gydF4y2Ba+gydF4y2Ba罗/马的细胞gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件与Lo/Mat相比gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba的比例，但编辑的Lo/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba细胞数增加4.67±0.50倍。这些结果表明，编辑效率受转染效率以外的因素影响。gydF4y2Ba

针对gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba与CRISPR/Cas9的联合使用会导致gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba以及它的下游伙伴gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba

MYF5gydF4y2Ba是已知的gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba表达式[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．先前的一项研究表明，沉默gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba表达导致gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．为了证实CRISPR/Cas9编辑在我们细胞中的有效性和相关性，我们测量了gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba转录水平gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba敲除线(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3;1gydF4y2Ba×gydF4y2Ba18米,1gydF4y2Ba×gydF4y2Ba32个f, 1gydF4y2Ba×gydF4y2Ba42度)。的水平gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba在基因敲除样本中显著低于阴性对照(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0023)gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba（gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0097;未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

的表达gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba都减少了gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba编辑单元格。水平的gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba在gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba-编辑单元格(gydF4y2BaMYF5 -gydF4y2BaKO)相对于阴性对照(NC)的平均表达。与转染了混乱的NC向导的细胞相比，这两个基因的表达明显减少gydF4y2Ba(每种条件n = 3 - 1× 18M, 1× 32F, 1× 42F)。误差条显示平均值±SD。** = p < 0.01gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

本研究旨在解决CRISPR/ cas9介导的人原代成肌细胞基因编辑缺乏有效方案的问题。我们工作的基础是细胞增殖与转染效率正相关，因此可能提高编辑效率。我们评估了细胞融合性和细胞外基质膜(Matrigel)的不同组合如何影响原代人成肌细胞的转染和编辑效率。我们发现skmdc在低合流度(~ 40%;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在这些条件下，我们在没有使用细胞分选或选择的情况下，在给定人群中平均编辑了52.4±17.8%的skmdc。在一个实例中，编辑效率达到93.8%。在Lo/Mat下编辑gydF4y2BaposgydF4y2Ba条件平均比商业供应商目前提供的大多数协议(Hi/Mat)高4倍gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba)，建议在高融合度(60%-90%)转染，并没有提到基底膜基质的使用。事实上，对于所有三个指南，最低的编辑效率达到了Lo/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba条件仍然优于使用Hi/Mat达到的最高编辑效率gydF4y2Ba负的gydF4y2Ba条件。虽然我们在本研究中测试了每个靶标的单个指南，但已经确定不同grna的编辑活性是不同的[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．因此，通过测试每个目标的多个指南，可以进一步改善结果。无论如何，使用我们的方法仍然可以提高表现不佳的grna的活性。这在gRNA位置受限的研究中尤其有用(例如，等位基因特异性缺失，致病变异的功能分析)。总的来说，这项技术在临床(例如，基因治疗)和研究(例如，疾病基因表征)中都有多种下游应用。gydF4y2Ba

我们的结果一致表明，在测试的四种条件中，转染在低conconfluent上播种的细胞时实现了最佳编辑。这可能是由于剂量效应反应，其中RNP复合物与每个细胞的较大比例增加了一个或多个RNP复合物进入细胞的可能性。然而，初步实验优化了Lo/Mat条件下成肌细胞的细胞:RNP比gydF4y2BaposgydF4y2Ba不同条件下的编辑效率无显著差异。CRISPR/Cas9浓度的增加也与更高水平的细胞死亡有关。虽然这些实验没有在高密度培养中进行，但建议将成肌细胞保持在50-60%以下，以防止自发分化。因此，低CRISPR/Cas9浓度的低融合转染在促进最佳生长条件的同时最小化转染后毒性。gydF4y2Ba

有效的基因编辑需要Cas9 RNP复合物进入细胞核。核膜在很大程度上对RNP复合物是不渗透的，因此是有效编辑的主要障碍。然而，在细胞分裂过程中，核膜在子细胞中重组之前被迅速分解[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．在这个过程中，附近的转染复合物可以被整合到重组的细胞核中，在那里它可以进入并操纵基因组[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．因此，RNPs在最能促进增殖的条件下传递到转染的细胞中，即Lo/MatgydF4y2BaposgydF4y2Ba-可能会增加核内rnp的递送，从而增加编辑成功的可能性。gydF4y2Ba

这项研究有几个局限性。转染效率仅根据tracrRNA的存在来量化，并不能保证所有其他成分也已被传递。因此，一些细胞可能转染了任何剩余的未结合的tracrRNA，而不是整个Cas9-RNP复合物，这将影响RNP转染效率的测量。此外，编辑细胞与未编辑细胞的比例可能会随着时间的推移而减少，因为未经编辑的细胞更好地保留了它们的增殖能力[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．此外，初步研究表明，即使在没有RNP复合物的情况下，转染CRISPRMAX试剂的skmdc的分化潜力也会降低。这可能限制了这一过程的使用，仅对成肌细胞进行研究。尽管如此，我们相信这仍然是研究基因编辑对成肌细胞影响的可行方法。我们的qPCR结果支持了这一点(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，显示了预期的下游效应gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba可拆卸的上gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba表达，如前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．虽然蛋白质表达研究本可以进一步了解编辑的最终结果，但基因的低内源性表达gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYOD1gydF4y2Ba(那些具有有效抗体的目标)使得它们不适合精确量化蛋白质丰度的变化。在转染诱导的应激反应中，转录和翻译机制的抑制使情况进一步复杂化[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．因此，未经处理的样品中低丰度的蛋白质在转染了混乱阴性控制指南(NC)的样品中进一步减少，使得难以辨别NC和编辑细胞之间蛋白质水平的差异。使用验证抗体的初步western blot研究对NC样品中MYF5和MYOD1的检测不够敏感，即使实验规模扩大到5倍以上(数据未显示)。虽然蛋白质分析不太适合本文分析的靶标，但这种基因编辑方法仍然适用于许多可能更适合蛋白质分析的高表达基因。gydF4y2Ba

使用原代细胞作为生物模型所带来的好处很容易被使用它们所固有的困难所抵消。这反映在为永生化而不是原代细胞系优化的资源和试剂的优势上。例如，在由Invitrogen™开发的154种细胞特异性转染方案中，只有6种是为原代细胞设计的，而在这6种方案中，只有1种是为人类细胞设计的[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．没有一种是专门为原代成肌细胞量身定做的。通过提高CRISPR/ cas9介导的skMDCs基因编辑的效率，我们已经使原代成肌细胞成为研究人类肌肉遗传学的可行和有吸引力的选择。在种群中实现高比例的编辑细胞减少了对下游细胞选择过程的需求，因为对于某些应用，可以对大量种群进行稳健分析。这并不适合需要同质细胞群体的情况，尽管更高的编辑效率本质上使选择编辑细胞更容易实现。gydF4y2Ba

更高水平的编辑也增加了纯合编辑的可能性。因此，单细胞RNA测序等工具[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba可以用来描述编辑细胞的转录组。虽然该方法对原代成肌细胞编辑非常有效，但我们建议在解释下游分析时要谨慎。例如，已知以脂质为基础的复合物可以改变转染细胞中的基因表达模式，特别是那些涉及细胞应激反应途径的基因表达模式[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．此外，由于Lipofectamine™CRISPRMAX™是一种相对较新的试剂，尚未有研究评估其改变基因表达谱的程度。我们建议使用一个混乱的指南作为控制，以解释细胞的变化，从转染过程本身产生的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究已经确定了一种简单、有效和经济的技术，可以最大限度地提高CRISPR/ cas9介导的人原代成肌细胞的基因编辑效率。我们已经证明，成功编辑原代成肌细胞需要的条件与大多数商业指南推荐的条件相反。本文提出的方案可以证明是了解人类骨骼肌生物学和遗传学的有价值的工具;并且有可能适用于其他难以转染的细胞类型。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充文件中。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

  1. 李建军，刘建军，李建军，等。一种可编程双rna引导DNA内切酶在细菌免疫中的应用。科学。2012;337(6096):816 - 21所示。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1126/science.1225829gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  2. 用于基因组编辑及其他领域的CRISPR工具包。Nat Commun。自然出版集团，2018;9:1-13。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41467-018-04252-2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  3. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE，等。rna引导的Cas9人类基因组工程。科学。2013;339(6121):823 - 6。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1126/science.1232033gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  4. Pellagatti A, Dolatshad H, Valletta S, Boultwood J. CRISPR/Cas9基因组编辑在疾病研究和治疗中的应用。中华毒物杂志，2015;89:1023-34。施普林格-。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1007/s00204-015-1504-ygydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  5. 丛丽，冉芳，Cox D，林世生，Barretto R, Habib N，等。使用CRISPR/Cas系统的多重基因组工程。科学。2013;339(6121):819 - 23所示。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1126/science.1231143gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  6. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS。通过递送纯化的Cas9核糖核蛋白在人类细胞中高效rna引导的基因组编辑。基因工程学报，2014;24(6):1012-9。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1101/gr.171322.113gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  7. 李建平，李建平，李建平，等。在多种细胞和生物体中使用Cas9核糖核蛋白增强基因组编辑。[J] .视觉实验，2018;25(135):2018(135)。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.3791/57350gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  8. 刘超，张磊，刘宏，程凯。CRISPR-Cas9基因编辑系统在治疗应用中的传递策略。J控制释放。Elsevier B.V. 2017; 266:17-26。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.jconrel.2017.09.012gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  9. 王丽，郑伟，刘松，李斌，姜霞。CRISPR/Cas9基因治疗的新策略。ChemBioChem。中文信息学报。2019;20:634-43。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1002/cbic.201800629gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  10. 李建军，李建军，李建军，李建军。基因编辑技术在生物体内的应用。Nat Rev Mater。自然出版集团。2019;4:726-37。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41578-019-0145-9gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  11. Lino CA, Harper JC, Carney JP, Timlin JA。提供CRISPR:挑战和方法综述。药物Deliv。科学通报，2018;25(1):1234-57。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1080/10717544.2018.1474964gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  12. 王涛，李立明，马磊，韦德荣。系统筛选常用的商业转染试剂，以高效转染单链寡核苷酸。分子。2018;23(10)。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.3390/molecules23102564gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  13. Neuhaus B, Tosun B, Rotan O, Frede A, Westendorf AM, Epple M.纳米颗粒转染剂:10种不同细胞系的综合研究。海洋学报，2016;6:18102-18112。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1039/c5ra25333kgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  14. Hagan M, Ashraf M, Kim IM, Weintraub NL, Tang Y.利用自体ipsc衍生祖细胞和CRISPR-Cas9介导的精确校正有效再生营养不良肌肉。医学假说。2018;11:97 - 100。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.mehy.2017.11.009gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  15. 李建军，李建军，李建军，等。肌营养不良患者的多能干细胞研究进展。细胞。2019;8(1):20。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.3390/cells8010020gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  16. 高志刚，小泉纯一郎，陈志刚，陈志刚，等。利用CRISPR/Cas9技术对myogenin基因突变的人iPS细胞进行分化。干细胞学报，2017:9210494。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1155/2017/9210494gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  17. 李建军，张建军，张建军，等。诱导多能干细胞对杜氏肌营养不良的影响。细胞。2018;7(12):253。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.3390/cells7120253gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  18. 闵玉林，李辉，Rodriguez-Caycedo C, Mireault AA，黄军，Shelton JM，等。CRISPR-Cas9可纠正小鼠和人类细胞中的杜氏肌营养不良外显子44缺失突变。科学通报，2019;5(3):851 - 856。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1126/sciadv.aav4324gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  19. 王晓明，王晓明，王晓明，等。肌营养不良小鼠肌源性细胞的连续传代和分化。大自然。1977;270(5639):725 - 7。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/270725a0gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  20. Sabourin LA, Girgis-Gabardo A, Scale P, Asakura A, Rudnicki MA。成人骨骼肌原代MyoD-/-肌源性细胞分化潜能降低。中国生物医学工程学报，1999;19(4):631 - 631。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1083/jcb.144.4.631gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  21. 刘建平，李建平，李建平，等。人和小鼠骨骼肌干细胞:肌肉形成的趋同和分化机制。科学通报，2014;9(2):e90398。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1371/journal.pone.0090398gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  22. Kikuchi K, Hettmer S, Aslam MI, Michalek JE, Laub W, Wilky BA，等。细胞周期依赖的易位介导的融合癌基因表达介导横纹肌肉瘤的检查点适应。科学通报，2014;10(1):e1004107。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004107gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  23. Burattini S, Ferri R, Battistelli M, Curci R, Luchetti F, Falcieri E. C2C12小鼠骨骼肌发育模型的形态学功能表征。中国生物医学工程学报，2004;33(3):444 - 444。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.4081/891gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  24. 李建军，李建军，李建军，等。Dnmt1在G2期和M期染色质的表达。EMBO, 2004; 5:1181-6。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/sj.embor.7400295gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  25. Henry MP, Hawkins JR, Boyle J, Bridger JM。人类多能干细胞的基因组健康:基因组不稳定性及其对核组织的影响。前沿医学，2019;10(623)。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.3389/fgene.2018.00623gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  26. 王张M, L, K, Cai J,李G,杨C, et al。诱导多能干细胞较低的基因组稳定性反映了非同源末端连接增加。癌症杂志，2018;38(1):49。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1186/s40880-018-0313-0gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  27. 杨春华，杨春华，李春华，等。诱导多能干细胞基因组稳定性的研究进展。干细胞学报，2017;13:7-16。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1007/s12015-016-9680-6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  28. 李志强，冯海龙，杨杰杰，李志强，等。人诱导多能干细胞的体细胞编码突变。大自然。2011;471(7336):63 - 7。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/nature09805gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  29. McMillan J, afrozen D, Hindi S, Kumar A.成年小鼠骨骼肌原代成肌细胞的分离、培养和分化。生物学报，2017;7(9)。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.21769/bioprotoc.2248gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  30. 刘建军，刘建军，刘建军。用高血清浓度的DODAC:DOPE脂质体转染培养成肌细胞。中国生物医学工程学报。1998;5(10):1306 - 1306。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/sj.gt.3300729gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  31. 戴军，李建平，李建平。非病毒基因转移试剂转染效率的比较。中国生物医学工程学报，2010;46(3):287-300。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1007/s12033-010-9302-5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  32. Dodds E, Dunckley MG, Naujoks K, Michaelis U, Dickson G.脂肪转染小鼠肌肉细胞:脂质胺和DOSPER的直接比较。中国生物医学工程学报。1998;5(4):542 - 551。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/sj.gt.3300604gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  33. 脂质体介导的基因转移到正常和肌营养不良蛋白缺乏的小鼠成肌细胞。中华神经科杂志。1995;32(5):563 - 568。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1046/j.1471-4159.1995.64052230.xgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  34. van Agtmaal EL, andr LM, Willemse M, Cumming SA, van Kessel IDG, van den Broek WJAA，等。1型肌强直性营养不良基因座中CRISPR/ cas9诱导的(CTG·CAG)n重复不稳定性:对治疗性基因组编辑的影响中华医学杂志，2017;25(1):24-43。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.ymthe.2016.10.014gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  35. Dastidar S, Ardui S, Singh K, Majumdar D, Nair N, Fu Y，等。高效CRISPR/ cas9介导的编辑在肌强直性营养不良患者衍生的iPS和肌原性细胞中三核苷酸重复扩增核酸学报，2018;46(16):8275-98。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1093/nar/gky548gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  36. 王晓明，王晓明，王晓明，王晓明。一种新型原代肌卫星细胞培养系统的研究进展。中国生物医学工程学报;2013;29(3):827 - 839。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1111/febs.12072gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  37. 潘pinella F, Lechardeur D, Zanetti E, MacLachlan I, Benharouga M, Lukacs GL，等。原代和成肌细胞吸脂效率差异分析。中华医学杂志。2002;5(2):161-9。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1006/MTHE.2002.0528gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  38. 利用基质基膜基质高效转染小鼠源性C2C12成肌细胞。生物工程学报，2009;4(7):1042 - 1045。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1002/biot.200800269gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  39. Neuhuber B, Huang DI, Daniels MP, Torgan CE。脂质试剂高效转染原代骨骼肌细胞。肌肉神经学报。2002;26(1):136-40。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1002/mus.10171gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  40. 刘建辉，刘建辉，刘建辉，等。非病毒dna介导的细胞电穿孔基因转染。神经肌肉疾病。2001;11(4):341-9。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/s0960 - 8966 (00) 00204 - 2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  41. 刘建军，刘建军，刘建军，等。siRNA在人原代成肌细胞中的传递及其电穿孔参数的优化。Bioelectromagnetics。2015;36(8):551 - 63。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1002/bem.21936gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  42. Quenneville SP, Chapdelaine P, Rousseau J, Beaulieu J, Caron NJ, Skuk D，等。φC31整合酶对肌源性干细胞和成肌细胞的核转染:人成肌细胞稳定表达全长肌营养不良蛋白融合基因。中华医学杂志，2004;10(4):679-87。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.ymthe.2004.05.034gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  43. 李建军，李建军，李建军，等。心肌细胞非病毒转染与腺相关病毒转导的比较。生物化学学报，2004;28(1):21-31。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1385/MB:28:1:21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  44. Kim TK, Eberwine JH。哺乳动物细胞转染:现在和未来。中国生物医学工程学报，2010;39(8):373 - 378。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  45. Kang C.基因治疗应用。点播图书;2011; 143 - 144。gydF4y2Ba

  46. 刘勇，刘勇，王晓明，王晓明，等。绿色荧光蛋白标记原生质体的荧光激活细胞分选改进CRISPR/Cas9基因编辑。生物医学工程学报，2019;19(1):36。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1186/s12896-019-0530-xgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  47. Nasri M, Mir P, Dannenmann B, Amend D, Skroblyn T, Xu Y，等。CRISPR/Cas9 RNP荧光标记HSPCs和iPSCs基因敲除揭示了GADD45b在应激反应中的重要作用。中华血液学杂志，2019;3(1):63-71。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1182/bloodadvances.2017015511gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  48. 朱利安诺CJ，林A, Girish V, Sheltzer JM。利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中产生单细胞来源的敲除克隆。中华生物医学杂志，2019;28(1);gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1002/cpmb.100gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  49. Mortimer I, Tam P, MacLachlan I, Graham RW, Saravolac EG, Joshi PB。培养细胞的阳离子脂质介导转染需要有丝分裂活性。[j] .中国生物医学工程学报。1999;6(3):403-11。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/sj.gt.3300837gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  50. Chowdhury SR, Muneyuki Y, Takezawa Y, Kino-oka M, Saito A, Sawa Y，等。人骨骼肌成肌细胞在融合培养状态下的生长和分化潜能。中国生物医学工程学报，2010;39(3):391 - 391。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2009.09.042gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  51. 田中K，佐藤K，吉田T，福田T，花村K，小岛N，等。细胞密度影响C2C12肌发生的证据:细胞间通讯可能调节肌发生。肌肉神经。2011;44(6):968-77。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1002/mus.22224gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  52. 陈建军，陈建军，陈建军，陈建军。在体外维持肌源性细胞分化能力的是基质，而不是胶原I。生物材料学报，2012;7(5):055004。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1088/1748-6041/7/5/055004gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  53. Shahini A, Vydiam K, Choudhury D, Rajabian N, Nguyen T, Lei P等。高效高产分离骨骼肌成肌细胞。中国生物医学工程学报，2018;30(3):391 - 391。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.scr.2018.05.017gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  54. 刘建军，李建军，李建军，等。运动训练后，GREM1在肌肉细胞中进行表观遗传重编程，并控制肌肉发生和代谢。bioRxiv。2020:2020.02.20.956300。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1101/2020.02.20.956300gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  55. 集成DNA技术。Alt-R CRISPR- cas9系统:CRISPR核糖核蛋白复合物进入哺乳动物细胞的阳离子脂质递送。Coralville:整合DNA技术;2017.gydF4y2Ba

    谷歌学者gydF4y2Ba

  56. Brinkman EK, Chen T, Amendola M, Van Steensel B.基于序列痕量分解的基因组编辑定量评估。核酸学报，2014;42(22):e168。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1093/nar/gku936gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  57. Toloudi M, Ioannou E, Chatziioannou M, Apostolou P, Kiritsis C, Manta S，等。肿瘤细胞与肿瘤干细胞生长曲线的比较。中国生物医学工程杂志，2014;9(2):112-6。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.2174/1574888X0902140121163539gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  58. 寿杰，李军，刘勇，吴强。精确和可预测的CRISPR染色体重排揭示cas9介导的核苷酸插入原理。生物质化学工程，2018,31(4):498 - 509。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.021gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  59. Lemos BR, Kaplan AC, Bae JE, Ferrazzoli AE, Kuo J, Anand RP，等。出芽酵母中的CRISPR/Cas9裂解揭示了模板插入和链特异性插入/删除谱。中国科学:自然科学版，2018;15(9):E2010-47。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1073/pnas.1716855115gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  60. van Overbeek M, Capurso D, Carter MM, Thompson MS, Frias E, Russ C，等。DNA修复分析揭示了cas9介导断裂的非随机结果。生物质化学学报，2016;63(4):633-46。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.06.037gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  61. 李建军，李建军，李建军，等。预测cas9诱导的双链断裂修复所产生的突变。生物工程学报，2019;37(1):64-82。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/nbt.4317gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  62. Taheri-Ghahfarokhi A, Taylor BJM, Nitsch R, Lundin A, Cavallo AL, Madeyski-Bengtson K，等。解码Cas9靶向位点的非随机突变特征。核酸学报，2018,46(16):8417-34。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1093/nar/gky653gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  63. standerbeier K, Tekel SJ, Brookhouser N, Schwarz G, Nguyen T, Wang X，等。人类细胞中编辑富集(TREE)的瞬时报告基因。核酸学报，2019;47(19):e120。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1093/nar/gkz713gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  64. Myf5、MyoD、Myogenin和MRF4在骨骼肌、卫星细胞和再生肌发生中的作用。中国生物医学工程学报，2017;32(2):391 - 391。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/J.SEMCDB.2017.11.011gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  65. 李建军，李建军，李建军，等。非编码rna在肌肉营养不良症中的表达。中华医学杂志，2013;14(10):681 - 694。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.3390/ijms141019681gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  66. Buckingham M, Rigby PWJ。控制肌肉发生的基因调控网络和转录机制。生态学报，2014;28(3):225-38。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/J.DEVCEL.2013.12.020gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  67. Hernández-Hernández JM, García-González EG, Brun CE, Rudnicki MA。肌生成调节因子，肌肉发育，细胞身份和再生的决定因素。中国生物医学工程学报，2017;32(2):1010 - 108。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/J.SEMCDB.2017.11.010gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  68. Moreno-Mateos MA, Vejnar CE, Beaudoin J-D, Fernandez JP, Mis EK, Khokha MK，等。CRISPRscan:设计高效的体内靶向CRISPR/ Cas9的sgrna。2015; 12(10): 982 - 8。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/nmeth.3543gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  69. Allen F, Behan F, Khodak A, Iorio F, Yusa K, Garnett M，等。Jacks: CRISPR/Cas9基因敲除筛选的联合分析。基因工程学报，2019;29(3):464-71。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1101/gr.238923.118gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  70. 李建军，李建军，李建军，等。热休克诱导的基因表达调控机制的研究进展。中华生物医学工程学报，2019;26(2):137-46。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41594-018-0182-xgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  71. Vihervaara A, Mahat DB, Guertin MJ, Chu T, Danko CG, Lis JT，等。对压力的转录反应是由启动子和增强子结构预先连接的。生态学报，2017;8(1):1 - 16。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41467-017-00151-0gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  72. 李建军，李建军，李建军，李建军，等。扫描起始因子快速位移对应力诱导翻译抑制的影响。生物质化学工程学报，2010;30(5):481 - 483。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.09.021gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  73. 翻译的关闭:致命还是保护?未折叠蛋白反应与细胞凋亡。[J]中华血液学杂志，2003;23(7):773 - 779。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1097/01.WCB.0000075009.47474.F9gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  74. Paschen W, Proud CG, Mies G.翻译关闭，全局神经元应激反应:机制和病理相关性。中国医药杂志，2007;13(18):1887-902。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.2174/138161207780858401gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  75. 张建平，张建平。基因重组对基因表达的影响。中国生物医学工程学报，2008;20(2):229 - 229。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1016/J.CEB.2008.01.013gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  76. 细胞特异性转染协议| Thermo Fisher Scientific - AU。gydF4y2Ba

  77. 1.夏皮罗E, Biezuner T, Linnarsson S.单细胞测序技术将彻底改变整个生物科学。学报，2013,14(9):618-30。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/nrg3542gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  78. 费泽- kierzkowska A, Vydra N, Wysocka-Wycisk A, Kronekova Z, Jarzab M, Lisowska KM，等。脂质体DNA载体可诱导细胞应激反应，改变转染细胞的基因表达模式。中华生物医学杂志，2011;12(1):27。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1186/1471-2199-12-27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  79. 李建军，李建军，李建军，等。转染介导的细胞毒性-基因表达和细胞毒性分析。Mirus Bio LLC, 2012。访问:gydF4y2Bahttps://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/the-impact-of-transfection-mediated-toxicity.pdfgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  80. Bauer M, Kristensen BW, Meyer M, Gasser T, Widmer HR, Zimmer J，等。脂质介导的基因转移在腹侧中脑外植体培养中的毒性作用。中华检验医学杂志，2006;31(4):394 - 394。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1111/j.1742-7843.2006.pto_310.xgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  81. Jacobsen LB, Calvin SA, Lobenhofer EK。转染的转录效应:对瞬时转染细胞产生的基因表达数据的潜在误解。生物学技术。2009年,47(1):617 - 24。gydF4y2Bahttps://doi.org/10.2144/000113132gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

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致谢gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

HG由澳大利亚政府提供的研究培训计划奖学金支持。NGL (APP1117510)和GR (APP1122952)由澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)支持。这项工作由NHMRC项目拨款APP1146321资助给ARRF, GR和NGL。ARRF由NHMRC奖学金APP1154524支持。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

  1. 西澳大学卫生与医学科学学院医学研究中心，西澳尼德兰，澳大利亚gydF4y2Ba

    Hayley goull， Rhonda L. Taylor, Alistair R. R. Forrest, Nigel G. Laing, Gianina Ravenscroft和Joshua S. ClaytongydF4y2Ba

  2. 哈里·珀金斯医学研究所，凡尔登街6号，尼德兰，西澳，6009，澳大利亚gydF4y2Ba

    Hayley goull， Rhonda L. Taylor, Alistair R. R. Forrest, Nigel G. Laing, Gianina Ravenscroft和Joshua S. ClaytongydF4y2Ba

  3. 西澳大学卫生与医学科学学院生物医学学院，西澳尼德兰，西澳，澳大利亚gydF4y2Ba

    海莉·古尔梅和朗达·l·泰勒gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 海莉GoulleegydF4y2Ba
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  2. 朗达·l·泰勒gydF4y2Ba
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  3. 阿利斯泰尔·r·r·福雷斯特gydF4y2Ba
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  4. 奈杰尔·g·莱恩gydF4y2Ba
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  5. Gianina RavenscroftgydF4y2Ba
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  6. 约书亚·s·克莱顿gydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba

该研究的概念和设计是由JC构思的。GR和RLT对研究设计有贡献。HG进行了实验、统计分析、稿件准备和修改。JC协助生成和分析数据。JC、GR、RLT、NGL和ARRF对稿件进行了批判性阅读和反馈。资金由HG、GR、NGL和ARRF获得。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba约书亚·s·克莱顿gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

附加文件1:表S1。gydF4y2Ba

GuideRNAs (gRNAs)。关于grna的信息，包括商业名称、序列和位置。gydF4y2Ba

附加文件2:表S2。gydF4y2Ba

Sanger测序的PCR条件。包括引物序列和热循环条件。gydF4y2Ba

附加文件3:表S3。gydF4y2Ba

qPCR条件。包括引物序列和热循环条件。gydF4y2Ba

附加文件4:图S1。gydF4y2Ba

MYF5gydF4y2Ba引物设计，PCR，序列痕量和痕量分解。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba所有目标的引物都设计在距离gRNA至少100 bp的地方，以确保在预测切割位点上的高质量读取。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba聚合酶链反应的gydF4y2BaMYF5gydF4y2Ba样品(产品尺寸= 630 bp)。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba显示切割位置和主要编辑的样本痕迹(单个T插入)。这在罗/马特最为显著gydF4y2BaposgydF4y2Ba样本，其中插入的T等位基因(红色峰)的信号几乎等于野生型C等位基因(蓝色峰)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba对照(黑色)和处理(绿色)样品的序列可视化。蓝色虚线表示预期切割位置。绿色的峰表示在编辑过的样本中与相同位置的对照核苷酸不同的核苷酸比例。剪切位置后的绿色峰值越高，则认为发生了更多的编辑。gydF4y2Ba

权利和权限gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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古尔萨梅，H.，泰勒，r.l.，福雷斯特，A.R.R.gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba在Matrigel上使用低融合培养改进的CRISPR/Cas9基因编辑原代人成肌细胞。gydF4y2Ba骨骼肌gydF4y2Ba11gydF4y2Ba， 23(2021)。https://doi.org/10.1186/s13395-021-00278-1gydF4y2Ba

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关键字gydF4y2Ba

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  • 基因编辑效率gydF4y2Ba
  • 原代人成肌细胞gydF4y2Ba
  • 基底膜基质gydF4y2Ba
  • ConfluencygydF4y2Ba

骨骼肌gydF4y2Ba

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