pan HDAC抑制剂Givinostat改善了表达不同单倍型的两种杜氏肌营养不良小鼠模型的肌肉功能和组织学参数LTBP4基因

背景

在寻找杜氏肌营养不良(DMD)严重程度的遗传决定因素时，LTBP4作为潜在TGF-β结合蛋白家族的一员，它成为小鼠和人类功能结局轨迹的重要预测因子。中非同义单核苷酸多态性LTBP4基因与DMD患者的长时间下床活动相关，而小鼠的帧内插入多态性LTBP4该基因位点通过改变Ltbp4蛋白的蛋白水解稳定性和转化生长因子-β (TGF-β)的释放来调节小鼠的疾病严重程度。Givinostat是一种泛组蛋白去乙酰化酶抑制剂，目前正处于DMD治疗的III期临床试验中，可显著减少肌肉组织纤维化，并促进肌肉横截面积(CSA)的增加mdx老鼠。在本研究中，我们研究了Givinostat的活性mdx在D2中。B10mice, two mouse models expressing different Ltbp4 variants and developing mild or more severe disease as a function of Ltbp4 polymorphism.

方法

在两种DMD小鼠模型中给予Givinostat和类固醇15周，并通过握力和跑到衰竭功能测试评估其疗效。同时对骨骼肌进行组织学检查，以评估纤维化面积百分比和CSA增加。

结果

Givinostat治疗使两种DMD模型小鼠的最大正常化强度增加到与健康小鼠相当的水平。Givinostat在握力和衰竭试验中的作用在两种菌株中都是剂量依赖性的，在D2中也是如此。在B10小鼠中，Givinostat在最高剂量时表现优于类固醇。Givinostat的体内治疗对改善肌肉形态均有效mdx和D2。B10mice by reducing fibrosis.

结论

我们的研究提供了证据，Givinostat有显著的改善肌肉功能和组织参数mdx和D2。B10murine models suggesting a potential benefit also for patients with a poor prognosisLTBP4基因型。

杜氏肌营养不良症(DMD)是一种致命的x连锁疾病，导致肌肉萎缩，新生儿男性的平均发病率为1:3500。DMD是由于编码营养不良蛋白的基因突变，导致蛋白质的缺失。肌萎缩蛋白的缺乏导致肌纤维变性、慢性炎症通路的激活以及成纤维细胞和脂肪细胞的进行性肌肉组织替换，从而触发导致纤维化发展的过程[1］．在DMD肌肉中，正常的再生途径被破坏，纤维和脂肪组织对受损肌肉纤维的异常替代导致肌肉功能严重下降。DMD患者寿命缩短的主要原因是膈肌(DIA)衰弱导致的严重呼吸功能不全和心力衰竭[2］．

迄今为止，对于DMD患者，还没有导致疾病愈合的标准治疗方法;然而，糖皮质激素(GC)类固醇治疗、矫形外科手术和辅助通气有助于改善患者的生活质量和延缓疾病进展[3.］．针对单个突变的尝试最近导致FDA批准外显子跳过寡核苷酸(Eteplirsen, Golodirsen和Vitolarsen) [4，5，6]和Ataluren用于EMA无义突变患者[7，8］．只有少数患者可以从这些治疗中受益，疾病管理的主要是GC类固醇。GC类固醇治疗(主要是强的松和地马唑克)被证明对DMD患者的所有疾病轨迹都有有利影响，包括生存期和延长下床时间[9，10，11]，但这种好处是以显著的副作用为代价的，如体重增加、生长迟缓、库欣样症状、情绪变化、骨折发生率增加和感染易感[12，13］．矛盾的是，慢性GC类固醇治疗可能促进肌肉萎缩mdx接受慢性GC类固醇治疗的小鼠显示出心脏功能的显著损害和心脏纤维化的增加，这表明长时间的类固醇治疗可能对营养不良的心肌有害[14，15］．因此，显然需要对DMD患者进行广泛积极和耐受性良好的治疗。

近年来，在寻找DMD严重程度的遗传决定因素的过程中，研究人员发现LTBP4基因成为功能结局轨迹的重要预测因子。的LTBP4基因编码潜在转化生长因子-β (TGF-β)结合蛋白(Ltbp) 4，该蛋白与TGF-β结合在细胞外基质中，隔离该细胞因子[16，17，18］．在炎症过程中，TGF-β通过富含脯氨酸的铰链结构域的蛋白水解从Ltbp4复合体中释放出来。这种裂解导致TGF-β的激活[19］．一旦从复合物中解放出来，游离的TGF-β可调节胶原沉积并促进纤维化过程[20.］．在生理愈合过程中，TGF-β的短暂释放是必要的，而持续的促炎细胞因子水平有助于病理组织变性过程，如纤维化[21］．高TGF-β水平已被证明与DMD肌肉纤维化的严重程度相关[21］．

在人类中，已在Ltbp4蛋白中鉴定出单核苷酸多态性(SNPs)，其起源为VTTT和IAAM单倍型[17］．IAAM Ltbp4单倍型纯合子的DMD患者保持不活动的时间明显长于VTTT单倍型纯合子的患者(10.7±2.1年)[17］．此外，与VTTT成纤维细胞相比，暴露于TGF-β的IAAM成纤维细胞表现出phospho-SMAD水平的降低LTBP4调节TGF-β活性[17，22，23］．

有两种小鼠品系模仿了两种不同的人类Ltbp4单倍型:C57BL10ScSn-Dmd^mdx/J(以下简称为mdx)在Ltbp4富含脯氨酸的区域有12个氨基酸插入。这导致了轻微的DMD表型，因为对蛋白水解的敏感性较低，TGF-β的激活减少，因为它发生在人类IAAM单倍型中[16];D2。B10-Dmd^mdx/J(以下简称D2.B10)在相同的Ltbp4区域有12个氨基酸缺失，功能类似于人类VTTT单倍型(由于对蛋白水解的敏感性增加和TGF-β活性增加而导致的严重DMD表型)[16］．Mdx小鼠的抗肌萎缩蛋白基因外显子23发生自发点突变，导致抗肌萎缩蛋白丢失[24]并且通常被用作DMD疾病的啮齿动物模型，尽管与DMD患者相比，它的表型更温和，寿命正常。相对温和的表型mdx小鼠也可归因于肌萎缩蛋白相关蛋白utrophin的代偿功能，其在成体肌肉纤维再生中高度上调mdx除DIA肌外的突变体[24］．D2。B10strain, created by backcrossingmdxDBA/2J背景下的小鼠，可能是一个更好的DMD模型，因为它更好地总结了DMD肌病的几个人类特征(后肢肌肉重量减轻，肌纤维减少和萎缩，纤维化增加，脂肪沉积和炎症浸润，肌肉无力)，与其他遗传背景(如mdx老鼠)[24，25，26］．

组蛋白去乙酰酶(HDACs)的药物阻断可减少纤维化，促进代偿性再生mdx骨骼肌[27，28，29，30.］．HDACs在DMD肌肉中的作用尚不完全清楚;然而，如果比较肌肉mdx与健康C57BL/10 J小鼠相比，可以观察到HDAC活性较高mdx老鼠(28］．Givinostat是一种有效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，目前正处于III期临床试验(www.Clinicaltrials.gov，临床试验标识符:NCT02851797)用于DMD治疗。Givinostat治疗可有效改善小鼠的形态和肌肉功能mdx老鼠。特别是，Givinostat显著减少肌肉组织纤维化，促进肌肉横截面积(CSA)的增加[30.］．此外，对DMD患者的肌肉活检进行的免疫组织化学分析表明，Givinostat可以减少肌肉组织的炎症、坏死和纤维化，并促进占据肌肉组织较大比例的肌纤维的CSA升高[31］．Ltbp4多态性对Givinostat活性的影响尚不清楚。

因此，本研究旨在评估长期口服Givinostat(15周)治疗两种DMD小鼠模型的效果。此外，我们还评估了强的松和德伐沙特对D2的影响。B10mice, since this strain bears a closer resemblance to human DMD pathology [15，32］．为了评估Givinostat和类固醇治疗的疗效，我们使用体内行为测试(即握力和跑步机设备)评估了肌肉功能和小鼠疲劳能力。组织病理学分析也通过组织病理学分析评估Givinostat和类固醇治疗对组织形态的影响，包括CSA、中央核和纤维化。我们发现，在这两种模型中，Givinostat对肌肉功能有显著且剂量依赖的影响，这表明它对预后不良的患者也有潜在的益处LTBP4基因型。此外，我们的剂量反应研究揭示了疗效、组织学参数和药代动力学(PK)分析之间可能的相关性，这可能导致DMD患者治疗的进一步剂量优化。

动物实验

研究批准

涉及动物及其护理的程序是根据国家和国际法律和政策的机构准则进行的(意大利指导法律:D.lgs 26/2014《动物科学研究》2010/63/UE动物protezione degli animali use a fini scientific》)。该研究项目已得到意大利卫生部的授权。

动物和研究设计

将小鼠置于无病原体条件下，光照12小时/暗12小时循环，温度22°±2°，湿度55%±10%。每个笼子里都有一个老鼠屋。老鼠由一名认证兽医定期检查，该兽医负责健康监测、动物福利监督、实验方案和程序修订。所有小鼠均保持受控饮食(VRF1饮食，Charles River)，在整个实验过程中，每日饲料量为4-5克/只[33并免费获得水。

药效研究采用C57BL/10 J(库存号:000665)野生型(wt)和C57BL/10ScSn-Dmd^mdx/J(库存号:001801)7 - 8周龄雄性小鼠，DBA/2J wt(库存号:000671)，D2。B10-Dmd^mdx/J(库存号:013141)6 - 7周龄雄性小鼠购自The Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA)。在动物设施中驯化5天后，小鼠根据体重随机分为不同的治疗组。C57BL/10J wt小鼠被分配到naive wt组(未接受治疗的健康小鼠，但进行了功能测试)，而mdx小鼠分为以下几组(9只/组;4-5只/笼):幼稚mdx(未接受任何治疗，但进行功能测试的小鼠)，载体(0.5%甲基纤维素，p.o.)和Givinostat(0.1, 0.3, 1,5,10,25和37.5 mg/kg, p.o.)。DBA/2J小鼠被分配到naive wt组(未接受任何治疗，但进行功能测试的健康小鼠)，而D2 /2J小鼠被分配到naive wt组。将B10小鼠分为以下几组(12-13只/组;4-5只小鼠/组):载体(过滤自来水，p.o)， Givinostat(1,5,10和37.5 mg/kg, p.o)，强的松1mg /kg，地马唑克1mg /kg (i.p)。

PK研究采用C57BL/10ScSn-Dmd^mdx/J(库存号:001801)9周龄雄性小鼠购自The Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA)。在动物设施中适应了5天之后，mdx小鼠随机分为4个治疗组(28只/组;4只/笼)和1个未处理组(4只/笼)。在给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6 h，给予动物单次口服Givinostat 5、10、25、37.5 mg/kg，并在以下时间点采集样本。

药物治疗

在疗效研究中，Givinostat粉末(ITF2357)悬浮在0.5%甲基纤维素(Sigma-Aldrich)中，以0.1、0.3、1、5、10、25和37.5 mg/kg qdx5x15周(每只小鼠给药量:10 mL/kg) p.o(通过灌胃)给药mdx小鼠(见附加图)1A)。Vehicle-treatedmdx小鼠注射0.5%甲基纤维素悬浮液。Givinostat悬浮液保存于+ 4°C，每7天新鲜配制一次。可能是由于他们的舌头和咀嚼肌受损，口服灌胃程序变得难以执行，以及D2的慢性治疗。经此途径的B10小鼠被认为具有较高的食管损伤风险。因此，Givinostat是在饮用水中使用的。Givinostat溶解在过滤过的自来水中，并在饮用水中给药(持续24小时)，剂量分别为1,5,10和37.5 mg/kg/天，根据每日用水量4 ml/小鼠/天的估计[34］．在整个研究过程中，每周监测水的消耗量，称量每个笼子的瓶子(每个笼子最多4只老鼠)。注射日，将强的松和德马唑克散(Sigma-Aldrich)溶解于2% DMSO (Sigma-Aldrich)中，并稀释于无菌生理盐水中。两种药物均以1mg /kg的剂量每周注射(持续15周)[15]体积为10ml /kg。吉维诺他和类固醇治疗分别在实验计划的第7天和第9天开始(见附加图)1B).每天对所有小鼠进行监测，并根据体重和临床体征评估耐受性。在研究过程中，任何时间点均未观察到与治疗相关的临床体征。

在PK研究中，将Givinostat悬浮在0.5%甲基纤维素中，浓度分别为0.5、1、2.5和3.75 mg/mL。给药量为10 mL/kg，以获得5、10、25和37.5 mg/kg的剂量。

评价治疗效果的功能测试评估

最大归一化强度

在两项疗效研究中，每周通过握力仪测量前肢力量来评估治疗的有效性(Ugo Basile SRL，意大利)。BW的mdx(见附图)2)和D2。B10小鼠(见附加图)3.)也被测量，以标准化每只小鼠相对于其BW的绝对握力。该方案为每只小鼠提供了5次测量(该程序符合TREAT-NMD神经肌肉网络的标准操作程序)[35］．以每只小鼠在所有时间点(从T0到T15)获得的最大归一化强度(FNmax)的最高记录值进行进一步分析。

跑步机锻炼

运行到耗尽的性能mdx和D2。B10mice was evaluated every 14 or 21 days, respectively, using a treadmill apparatus (Ugo Basile SRL, Italy). The exhaustion protocol consisted in an initially horizontal running at 5 m/min for 5 min after which the speed was increased 1 m/min every minute until exhaustion (the procedure was compliant with the standard operating procedures of TREAT–NMD Neuromuscular Network) [36］．当小鼠在冲击板上停留超过10 s时，试验结束(C57BL/10 J和mdx老鼠)或D2。B10mice reached a maximum number of shocks. Due to the excessive stress caused to D2.B10 mice by this functional test, a maximum number of 600 and 150 shocks was set. These experimental conditions were also applied to the DBA/2J wt healthy mice.

在获取行为测定的基线读数(FNmax和动物跑步距离)后，根据这两个参数对小鼠进行重新随机化，同时也考虑了之前对它们的体重进行的随机化。

抓地力和跑到精疲力尽测试在清晨的轻周期阶段(上午8:00-11:30)进行。这两项功能测试分别在3天和4天的训练期后进行，在此期间，小鼠熟悉了程序。功能工具的培训期开始于适应期之后(见附加图)1A和B)。

药代动力学研究

血液，血浆和肌肉收集

小鼠在异氟醚麻醉下维持。从小鼠眶后丛采集血液样本，分成两等份，转入含肝素抗凝血管(100 USPunits/mL)，然后颈椎脱位处死小鼠。用等量水稀释50 μL，立即放入干冰中冷冻。对该血液进行分析，以从肌肉匀浆中减去Givinostat的血液含量。另一组血液在4°C下13000转/分离心10分钟，血浆分离并冷冻在干冰中。取右后肢股四头肌，称重，然后用pH 7.4的1ml PBS冲洗两次，用纸烘干，然后在干冰中冷冻。

等离子体分析

Givinostat在小鼠血浆中(50 μL)经蛋白沉淀(200 μL 1% HCOOH在乙腈中)和Ostro (Waters)平板过滤测定。有机相在氮气流下蒸发;再溶于100 μL 25% CH3CN-75% H的再溶溶剂中₂O-0.05% TFA)， 5 μL。采用LC-MS/MS法测定Givinostat浓度，校准范围0.5-400 ng/mL。

血液分析

吉维诺他在稀释血液(100 μL, 1:2在水中)中采用液-液萃取法测定。样品用2 mL乙醚混合提取，离心，有机相分离，在氮气流下蒸发。再溶溶剂为150 μL 25% CH3CN-75% H₂O-0.05% TFA)，超声，过滤(再生纤维素注射器过滤器)，LC-MS/MS法分析5 μL。方法的校准范围为1 ~ 200 ng/mL。

股四头肌的分析

小鼠股四头肌在pH = 7.4 (1:10 w/v)的PBS中均质，超声均质器(Sonoplus Mini20 - Bandelin)将样品保持在冰浴中。将四头肌匀浆(100 μL)加入200 μL 0.5% TFA于CH3CN中漩涡离心。再用H稀释上清液100 μL₂O(1:2)。用再生纤维素注射器过滤器过滤样品，分析5 μL的样品。采用LC-MS/MS法测定Givinostat浓度，校准范围为1-40 ng/mL。

计算

通过KineticaTM v. 5.1软件，采用传统的非隔区方法在平均曲线上评估PK参数。股四头肌浓度以毫微克/克肌肉表示，该值是通过将获得的匀浆浓度乘以匀浆体积，然后减去残余血液含量得到的，如文献所述[37]，考虑测量到的血药浓度，并除以肌肉重量。

组织学分析

组织准备、切片和染色

在异氟醚麻醉下采集小鼠胫骨前肌(TA)、腓肠肌(GAS)、DIA和心脏，颈椎脱位处死。这些肌肉取自C57BL/10J wt和mdx(5只/组)在治疗结束时，从DBA/2J wt和D2。B10mice (5 mice/group) at two different time points to be examined by a pathologist (for more details see Additional Table1)．由于功能测试的结果，在两种DMD模型中只分析了部分治疗组的肌肉(见附加表)1)．将收集的所有肌肉固定在10%缓冲福尔马林溶液中(Bio-optica, Milan, Italy)，温度为+ 4°C，至少48小时。固定后，肌肉样本横切、笼装，用自动真空组织处理地板(ETP, histoline Laboratories)进行蜡包埋过夜，并放入石蜡块中。用切片机(徕卡RM 2255)切割连续的横切面(4 μm厚)，收集到未涂布的玻片上，并使用标准的苏木精和伊红染色方案(Mayer苏木精和水溶液G伊红1%，Bio-Optica)和天狼星红染色方案(Direct Red 80, Sigma-Aldrich)。为了图像分析和定量，用奥林巴斯BX51光学显微镜检查了苏木精、伊红和天狼星红染色的玻片。使用Image-Pro Plus系统从每个样品中随机收集1 - 3张放大倍数为× 4和× 10 (TA、GAS和heart)或× 20 (DIA)的显微照片。数字图像由病理学家使用ImageJ软件处理(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD, USA)。为了定量苏木精和伊红染色切片上的CSA和中央核(%)，使用平板笔(Wacom Intruos)手动测量每只肌肉/小鼠100条肌纤维，并在线性校准150 μm后用ImageJ软件进行分析。将红色染色区域对应的纤维化区域与组织切片的总面积进行比较，结果以纤维化百分比表示。不同治疗组肌肉的纤维化百分比由每块肌肉的三个值的平均值表示。

在这些实验中，还进行了肌肉炎症浸润、脂肪组织沉积、再生和肌肉组织退变的组织病理学评估。不同肌肉(TA、GAS和DIA)肌营养不良的严重程度通过加权组织病理学方法进行量化，该方法考虑了一些根据损伤严重程度和扩展程度评分的参数:肌肉变性/坏死、再生、炎症浸润、间质反应和脂肪组织沉积。每个参数按严重程度(轻度= 1，中度= 2，严重= 3)和延伸程度(灶性= 1，多灶性= 2，弥漫性= 3)进行分类。计算每只动物的个体严重程度评分，并计算每组的平均评分。

全基因组miRNA表达谱

等离子体集合

血液样本取自异氟醚麻醉下小鼠的眶后丛。血液置于含有50 μL (1 mL总血)EDTA (100 nM)的试管中，然后在+ 4°C下以13300转/分的速度离心10分钟。分离血浆(400 ~ 500 μL)，立即在干冰中冷冻，- 80°C保存，待分析。

这些分析由Biogazelle (Technologiepark 82, 9052 Zwijnaarde, Belgium)进行。

13个小鼠血浆样本(naive wt, n = 3;天真的mdx， n = 3;载具，n = 4;Givinostat 37.5 mg/kg, n = 3)以干冰形式给药。

RNA提取

按照制造商的说明，使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(Qiagen)分离RNA。

小RNA测序及数据处理

使用NEBNext小RNA文库准备试剂盒(New England Biolabs)根据制造商说明制备小RNA测序文库。简单地说，以5 μl RNA洗脱液为输入，进行RNA接头连接(使用3 '和5 ' RNA接头)，然后进行逆转录和条形码引物PCR扩增。在Pippin Prep系统(Sage Science)上进行单个文库的大小选择，以回收包含成熟miRNAs的~ 147-157-nt组分。接下来，使用基于qpcr的归一化技术对单个小RNA文库进行池化。最后，通过乙醇沉淀浓缩得到的小RNA池，并使用Qubit 2.0荧光计(赛默飞世尔科学公司)进行定量，然后在NextSeq 500测序仪(Illumina公司)上测序，读取长度为75 bp。

基于严格的reads质量控制对测序reads进行筛选。使用Trimmomatic修整适配器后，将reads折叠，并使用Bowtie [38］．最多可映射25个核苷酸，没有错配，而更长的读取(主要来自mirna以外的RNA物种)映射最多允许2个错配。利用来自Ensembl(第84版)、UCSC (mm10版)和miRbase(第21版)的基因组注释数据，随后对成熟miRNAs和其他小RNA物种(包括tRNA片段、rRNA、sn(o)RNA和piRNAs)进行了标记。报告每个异构ir和每个成熟miRNA的原始计数数据(从规范成熟miRNA位点读取的所有异构ir之和)。使用DESeq2中实现的基于几何均值的方法对原始miRNA读数进行归一化。光谱图使用mpm R包生成[39]基于DESeq2归一化计数[40］．在本研究中，对比分析如下:naivemdxvs naive wt (T16)和Givinostat 37.5 mg/kg vs对照(T16)。

统计分析

使用GraphPad Prism version 8软件进行统计分析。

所有实验数据均以均数±标准误差(s.e.)表示。采用双向方差分析(小鼠BW、FNmax和长跑)和单向方差分析(细胞核集中和纤维化百分比)进行组间的多重统计比较，采用Bonferroni 's多重比较检验。P≤0.05为有统计学意义，在各图例中均有标注;P值> 0.05认为无统计学意义(ns)。

CSA统计分析

将不同剂量Givinostat处理的动物的CSA十分位数与载药处理的小鼠的相应十分位数进行绘制，并对自然[CSAtreated = b csaccontrol + a]和log_transformed数据[log(CSAtreated) = log(a) + b log(csaccontrol)]进行线性回归分析。如果Givinostat处理未显著改变两个分布的形状，则斜率(b)的值应与1无显著差异;此外，如果截距(a)的值显著不同于零，则可以考虑在两个CSAtreated和csaccontrol分布之间存在移位(S)。untransformed的数据,这意味着Givinostat治疗效果的添加剂和任意等分CSAtreatment分布可能来源于控制数据总结一个常数(S)到每个纤维数量的对照组(CSAtreated = CSAcontrol + S)。在log_transformed数据的情况下,Givinostat的影响必须被视为一个倍增因子在任何通用的肌肉纤维评价,其大小、治疗后,结果与对照组值相比大K倍(CSAtreated S或K值= K × csaccontrol, K = 10^a)。然后，通过基于平方和(SSQ)最小化的迭代估计程序确定S或K参数值，直接将处理动物中观察到的CSA分布与S值相加或乘以对照组CSA值得到的CSA分布进行比较。

差异miRNA丰度使用相同的DESeq2包进行。根据Benjamini和Hochberg方法对p值进行了5%的错误发现率(FDR)调整。

DESeq2应用异常值检测方法[41］．这些miRNAs在至少一个样本中有读数，但在统计检验中被忽略(因此没有p值)。此外，DESeq2对低计数应用滤波;这些miRNAs至少在一个样本中有读数，但平均丰度较低。对这些mirnas应用统计检验——它们收到一个p值，但它们被排除在多次测试校正之外——它们没有收到调整后的p值。

Givinostat以剂量依赖的方式改善mdx小鼠的肌肉功能

为了开始分析Ltbp4多态性对Givinostat在DMD小鼠模型中的疗效的影响，我们首先着手描述我们的HDAC抑制剂在DMD小鼠模型中的作用mdx老鼠。肌肉功能通过握力测试和跑步机衰竭测试进行研究。

控制测试

未经处理的mdx到第21天，小鼠的最大正常化强度较基线值(第0天)略有增加，随后逐渐下降(图2)。1)．Mdx载体处理的小鼠表现为mdx天真的老鼠，清楚地表明载体没有发挥任何作用。在这种情况下，Givinostat治疗诱导了显著的、剂量依赖性的FNmax增加，在37.5 mg/kg剂量时观察到最大疗效。在治疗第49天，该剂量短暂地将FNmax提高到与wt健康小鼠相当的水平(图2)。1)．从这一天开始，动物的发达强度开始下降，但Givinostat的有益作用一直持续到第105天(见附加表2)。

跑步机疲劳试验

给药剂量为37.5 mg/kg的Givinostat显著提高了小鼠第31天的表现，并且在第31 ~ 44天，它们的表现(分别为785±97和693±103 m)与wt小鼠(分别为735±66天和728±76 m)重叠。第94天，小鼠能够跑410±40米(wt小鼠的奔跑距离为657±44米)mdx载药小鼠只跑了92±4 m(图;2A).较低的剂量没有达到显著性，尽管剂量-反应效应的趋势在整个实验期间是明显的(图。2A).除了距离外，我们还分析了最后一个时间点(第94天)到精疲力竭的时间。Givinostat，在最高剂量下，显著延长了衰竭时间(图。2B).低剂量时效果也显著，最低有效剂量为0.3 mg/kg。

Givinostat在C57BL/10 mdx小鼠体内的药代动力学

迄今为止报告的功能数据表明，Givinostat对功能测试有剂量依赖性的改进。接下来，我们通过测量单次口服不同剂量药物后的血液、血浆和肌肉Givinostat水平，研究了与全身和组织特异性药物暴露的相关性。Givinostat在血浆和股四头肌中的平均浓度水平如图所示。3.(无花果。3.A、B)，血浆、血液、股四头肌中PK参数的平均值见表1(表1)．在所有研究剂量口服治疗后6小时，Givinostat在所有血浆、血液和肌肉样本中均可检测到。

血液定量主要是根据文献报道的生理参数，从肌肉匀浆中减去肌肉中残留血液中Givinostat的含量[37］．Givinostat在血液中的水平总是高于血浆，这表明药物分布到血细胞。计算AUC比值，其平均值为1.6。在血浆和股四头肌中也发现了相似的PK谱，没有延迟组织分布的时间。肌组织中Givinostat的AUCs始终高于血浆，说明Givinostat在肌肉组织中有优先分布。

PK研究结果表明，口服给药后，Givinostat的Cmax和AUC均呈剂量依赖性增加，并且该化合物迅速分布到肌肉组织中，其AUC约为血浆中的4.5倍。Givinostat的疗效很可能与肌肉组织中的高暴露水平有关。

组织病理学分析

进行组织病理学检查，以调查吉维诺司他治疗后观察到的功能改善mdx在组织学水平上，小鼠与更好地保存肌肉完整性有关。分析吉维诺他对纤维化的影响。治疗结束时(T16)， GAS、TA、DIA、心脏均为幼稚期mdx与健康肌肉相比，小鼠的纤维化面积明显更高。Givinostat剂量为10和37.5 mg/kg时，GAS中显著减少了纤维化(约30%)，而仅在37.5 mg/kg剂量时观察到对TA纤维化的影响(图5)。4A).在DIA中，所有3个分析剂量的Givinostat均显著减少了约40%的纤维化量(图。4A)在心脏中，纤维化的数量似乎比在其他肌肉中更不稳定。然而,vehicle-treatedmdx与野生型小鼠相比，小鼠似乎有明显更高的纤维化量。与药物治疗小鼠相比，Givinostat在所有3个剂量下都减少了纤维化，但效果不显著(图2)。4一个图。4B显示了一个例子，纤维化减少(可见随着Givinostat剂量的增加，红色减少)，在Sirius red染色的GAS组织学切片上。

还评估了Givinostat治疗对肌纤维横截面积的影响。气体中纤维CSA的测定mdx与载体处理小鼠相比，给予37.5 mg/kg Givinostat治疗105天后，小鼠的纤维尺寸增加。givinostat处理小鼠的GAS CSA值增加了一倍(峰值为1100 μm)²)mdx车用气体(峰值500 μm²)(图。5A).根据统计分析，这一差异可以通过假设1.72 K的乘法模型效应来解释，这为Givinostat以37.5 mg/kg处理后，应用于载药组各纤维CSA值以获得预期的CSA分布提供了乘法因子。有趣的是，这个K值与之前报道的临床研究中观察到的K值非常一致[31］．

在TA中，Givinostat以37.5 mg/kg剂量处理后，纤维CSA与载体处理小鼠相比有有限的增加，并向wt CSA值(1400 μm)转移²)．10和37.5 mg/kg给药组小鼠的TA CSA峰值为900 μm²类似于mdx载具TA (700 μm²)(图。5B).对TA CSA分布的统计分析证实了用加性模型效应观测到的结果，位移效应参数S = 140 μm²．

在DIA中，Givinostat 1,10和37.5 mg/kg处理小鼠的CSA分布与载体处理小鼠相比没有明显变化(载体处理小鼠CSA峰值为550 μm)²37.5 mg/kg的Givinostat组小鼠也有相同的反应)。

并分析了肌组织中细胞核集中的百分比。集中的核被认为是肌纤维再生的正常模式，尽管这一参数很难解释，因为即使在肌肉修复后，集中的核也可能持续存在。24 ~ 25周龄wt小鼠的GAS、TA和DIA肌肉中不存在核集中，而载体处理小鼠的GAS(77%)、TA(66%)和DIA(58%)肌肉中核集中非常分散mdx同龄的老鼠。未观察到与治疗相关的显著效应:Givinostat在1,10和37.5 mg/kg剂量处理的小鼠与载体处理的小鼠表现出相似的核集中(在GAS中分别为67.6±2.4%，58±3%和61.3±3.8%;TA组分别为71±1.6%、73.2±3.7%、60.8±2.5%;DIA分别为57±2.9%、61.4±3.5%、41.4±4.5%)。

据文献报道，在中央核的高百分比mdx小鼠肌肉退化后持续再生的特点[26，也可以解释在治疗小鼠中缺乏显著效果的原因。

肌肉炎症浸润、脂肪组织沉积、再生和肌肉组织退变的组织学评价在治疗组间无显著差异。特别是，在所有样本中，炎症浸润和脂肪组织沉积的程度非常有限，因此，对于区分不同剂量的Givinostat的疗效没有用处(附加表3.)．

功能和组织学的改善作为给药剂量的功能总结在附加表中4(见附加表)4)．

全基因组miRNA表达谱

MicroRNAs (miRNAs)是一种小的，约22 nt的非编码RNA分子，可在翻译后调节基因表达。几种miRNAs被描述参与骨骼肌增殖、分化和再生[42］．此外，miRNAs被认为是肌肉萎缩症有用的血清生物标志物[43］．先前的研究表明miRNAs是外泌体调控生物过程的介质[44，45，46］．外泌体，或细胞外囊泡，由于其在细胞-细胞通信中的作用，在科学界获得了很多关注。纤维成脂祖细胞(FAP)衍生的外泌体积聚在再生肌肉的间隙中，并可介导miRNA转移到musc。据报道，在体内暴露于HDAC抑制剂可导致fap来源的外泌体中特异性mirna的富集，外泌体miR-206水平的升高需要促进MuSC的激活和体外扩张，并刺激体内营养不良肌肉的再生。这些数据指出了研究miRNA水平在体内Givinostat治疗反应中的重要性。为了研究Givinostat对肌肉功能和组织学的影响是否与血浆miRNA水平的变化相关，我们使用RNAseq方法评估血浆miRNA的全基因组表达谱mdxGivinostat给药剂量为37.5 mg/kg。在这项研究中，我们评估了在T16收集的选定样本组之间miRNA的差异表达。每组重复数两两比较。对比条件(即对照)以及上调和下调的mirna数量列在附加表中5(见附加表)5)．

我们重点研究了已知在T16与营养不良疾病相关的高度调控的mirnamdxVs朴素wt对比。对这两组的分析对理解表观遗传治疗是否能改善糖尿病有指导意义mdx通过恢复某些miRNAs改变的表达来实现表型。为了评估Givinostat对miRNAs调节的影响，我们选择了最后一种治疗(T16)和最有效的剂量(37.5 mg/kg)与对照对照。

在T16天真mdx与原始对照相比，小鼠血浆中120个mirna显著上调，66个mirna显著下调mdx老鼠。在上调的miRNAs中，我们发现miR-133a-5p (FC = 5.973;miR-133b-3p (FC = 5.441)、miR-133a-3p (FC = 4.693)、miR-378b (FC = 4.109)、miR-206-3p (FC = 4.065)、miR-1a-3p (FC = 3.423)、miR-22-5p (FC = 2.991)和miR-22-3p (FC = 2.550)(图6)．据报道，所有这些mirna在营养不良小鼠中都升高了[47，48］．此外，在DMD患者血浆中miR-133、miR-1和miR-206水平也被发现升高[49］．

在小鼠中，miR-133a-3p, miR-1a-3p和miR-206-3p是特定的肌肉富集的mirna，在肌肉生长过程中调节肌纤维的增殖和肌原性分化[50，51］．特别是，miR-206-3p在营养不良肌肉再生中发挥关键作用，已知其在肌纤维再生中富集[52，53］．这三种miRNAs的丰度与营养不良病理的进展相关[54］．

在T16 naive中下调最显著的miRNAsmdx与原始wt相比，miR-122-3p和miR-122-5p可能参与肌肉生长和脂质沉积的调节[55]，但是，据我们所知，这些mirna到目前为止还没有被描述为与营养不良相关。

在Givinostat诱导的miRNAs (T16 Givinostat 37.5 mg/kg vs对照对照)中，仅有两个显著上调的是miR-449a-5p (FC = 4.388)和miR-92b-3p。这两个miRNAs的上调mdx已在文献中报道过HDACi治疗后的肌肉(曲古霉素A-TSA) [56，57］．

miR-449a-5p参与不同的通路，如TGF-β、TNF、MAPK、Wnt、FoxO、PI3K-Akt和Hippo信号通路，并被认为与干细胞多能性有关[57］．

miR-92b-3p与miR-133a-3p一起，是参与心力衰竭(即心肌细胞凋亡、肥大和炎症)的心脏特异性mirna之一，在心力衰竭患者的冠状窦中减少[58］．特别是在血管紧张素II拮抗剂治疗后，观察到miR-92b-3p在小鼠肥厚心肌细胞中下降，其过表达可以通过下调肥厚相关基因来减弱肥厚表型[58，59，60］．Mdx小鼠表现出轻度心肌病，根据文献，我们发现在T16, miR-92b-3p在幼稚mdx与原始wt小鼠相比，血浆下调(FC =−0.896，不显著)。在慢性Givinostat治疗后(T16 Givinostat 37.5 mg/kg vs对照)，我们的分析显示miR-92b-3p显著上调(FC = 2.130)，表明可能对心脏功能有有益影响mdxGivinostat治疗小鼠。由于我们专注于血浆miRNA水平，在未来的研究中，研究Givinostat对骨骼或心肌miRNA水平的影响将是有趣的。

每个对比的结果显示为火山图，包括图中所有的mirna。6．我们的结果与文献数据一致，表明骨骼肌中miRNA水平的严重失调mdx老鼠(57］．Givinostat治疗不能使整体模式恢复正常，但特异性作用于两种miRNAs，这两种miRNAs已被报道与肌肉生理学功能相关，更具体地说与心脏病理相关。

D2治疗效果评价。B10小鼠模型

研究了Givinostat在功能、组织学和分子方面的作用mdx有轻度营养不良表型的小鼠，我们接下来在更严重的D2中评估药物。B10模型。我们还将GC类固醇治疗组纳入本实验，以评估Givinostat与临床相关护理治疗标准的疗效。强的松和德伐克拉特均用于此目的。

不幸的是，我们观察到，通过灌胃反复、长期口服Givinostat对这些小鼠来说是困难和不安全的。这种困难可能与D2中更明显的口咽或食管功能障碍有关。与B10小鼠相比mdx老鼠。我们注意到杜氏患者也有进食困难和口咽或食管功能障碍的报道[61］．因此，该药物是在饮用水中给药的(见“材料和方法”一节中的“药物治疗”段)。为了估计使用这种方法给动物的每日剂量，研究期间每周都测量用水量。我们计算了小鼠摄入Givinostat的实际剂量范围:0.8-1.1 mg/kg, 3.6-6 mg/kg, 7.2-11.6 mg/kg, 27.5-41.5 mg/kg。我们注意到，这些数据与预期剂量分别为1,5,10和37.5 mg/kg相符。动物摄取量的增加，以及Givinostat剂量的增加可能是由于动物的生长，因此，随着时间的推移，动物的体重增加。

功能活度测量

类似于在mdx小鼠的肌肉功能D2。B10mice was investigated using both the grip test and the treadmill exhaustion test.

控制测试

在整个实验期间，DBA/2J wt小鼠发育的FNmax增加。7)，而D2中的FNmax。B10vehicle-treated mice tended to decrease starting from day 14 (Fig.7)，显示肌肉功能逐渐受损。Givinostat对FNmax的影响呈剂量依赖性，剂量为37.5 mg/kg时效果最佳。吉维诺司他10和37.5 mg/kg以及强的松治疗可提高D2的FNmax。从第21天到第49-62天，b10处理小鼠与wt健康小鼠的差异(图2)。7)．从第62天开始，D2。B10-treated mice started to diminish the FNmax, but the effect of Givinostat (administered at 5, 10 and 37.5 mg/kg) and prednisone remained significantly elevated until day 104 (see Additional Table6)．从第21天到第104天，对FNmax产生显著影响的最低剂量为10 mg/kg。1 mg/kg剂量的Deflazacort和Givinostat在有限的时间间隔内，即从第28天到第90天以及从第42天到第90/104天，分别显著改善了FNmax(见附加表)6)．在整个治疗期间，强的松对FNmax的影响与Givinostat 5 e 10 mg/kg相当，而Deflazacort的影响较强的松低，与强的松无显著差异。仅在第90天和第97天观察到37.5 mg/kg Givinostat组与强的松组的FNmax值存在显著差异(p < 0.05)，在相同的实验时间点，37.5 mg/kg Givinostat组与Deflazacort组之间也存在显著差异(p < 0.05和p < 0.01)。

跑步机疲劳试验

在疲惫测试评估期间，我们必须根据所适用的方案，在每次测试结束前设置小鼠接受的最大电击次数mdx以避免对动物造成不必要的压力(见“材料和方法”一节中的“评估治疗疗效的功能测试”段)。这种调整导致健康的DBA/2J的性能明显恶化，因此我们将其归因于实验设置的变化，而不是由于疲劳的增加。尽管减少了电击次数，Givinostat在最高剂量下提高了D2的跑步性能。B10小鼠在第63天明显增加(图。8A).这种效果一直持续到治疗期结束，在治疗期间改善有统计学意义。事实上，在第105天，给予givinostat治疗的小鼠能够跑473±22米，而D2。B10vehicle-treated mice ran for only 296 ± 17 m (the distance covered by wt mice was 648 ± 31 m). On the contrary, the effect of Deflazacort, prednisone, and of the lower doses of Givinostat was not statistically significant (Fig.8一个)。

除了距离，我们还分析了最后一个时间点(第105天)到精疲力竭的时间。Givinostat，在最高剂量下，显著延长了衰竭时间(图。8B)。

组织病理学分析

在DBA/2J wt小鼠中，与营养不良肌相比，GAS、TA和DIA在T8(分别为3.0±0.5%、3.0±0.4%和3.9±0.3%)和T16(分别为1.8±0.5%、2.3±0.3%和4.7±0.8%)两个时间点的纤维化面积比例都较低。在GAS (T8)中，与载体治疗的小鼠相比，强的松显著减少了纤维化(约26%)(图8)。9)．在T16时间点，Givinostat或类固醇治疗均未观察到显著影响。在TA (T8)中，类固醇和Givinostat(给予37.5 mg/kg)与载体治疗小鼠相比，显著减少了纤维化(约22%)(图8)。9)．T16时间点对纤维化无显著影响。在T8时，给予Givinostat和强的松治疗的动物的DIA分别显著减少了约33%和45%的纤维化量。Deflazacort无显著影响(图。9)．在T16时，Givinostat (37.5 mg/kg)和强的松的疗效均已丧失，可能是由于随着年龄的增长，再生潜能已耗尽[62］．

DBA/2J wt小鼠GAS的CSA和TA均高于营养不良小鼠(1500 μm²在T8和900 μm处²在气体和1200 μm中T16²在T8和1050 μm处²在TA的T16)。此外，37.5 mg/kg (600 μm²T8和450 μm²在GAS和300 μm的T16处²在T8和300 μm处²在TA中T16)和强的松1mg /kg (600 μm²在T8和300 μm处²在GAS和300 μm的T16处²在T8和300 μm处²在TA的T16)与D2相比。B10vehicle-treated mice (1050 μm²在T8和300 μm处²在气体和600 μm中T16处²在T8和300 μm处²在TA的T16)。

24-25周龄wt小鼠的GAS和TA肌无核集中或极低核集中(约1%)，而D2小鼠的GAS(25.1±1.5%)和TA(21.2±1.0%)的核集中非常弥散。B10相同年龄的载药处理小鼠。未观察到显著的治疗相关效应:Givinostat (37.5 mg/kg)和泼尼松处理小鼠的核集中度与对照组相似(GAS组分别为22.4±2.1%和21.6±1.7%，TA组分别为19.8±2.4%和22.0±2.4%)。

肌肉炎症浸润、脂肪组织沉积、再生和肌肉组织退变的组织学评价在治疗组间无显著差异。特别是，在所有样本中，炎症浸润和脂肪组织沉积的程度非常有限，因此，对于区分不同剂量的Givinostat或类固醇的疗效没有用处(附加表7)．

功能和组织学改善作为给药剂量的函数的统计分析总结在附加表中8(见附加表)8)．

IAAM Ltbp4单倍型纯合子的DMD患者比VTTT单倍型纯合子的DMD患者保持不活动的时间明显更长[17］．这种重要的相关性在其他研究中得到了证实。22，23]，其中还观察到使用皮质类固醇治疗的IAAM表型患者的下床活动丧失延迟。

在我们的研究中，我们观察到Givinostat对这两种都有效mdx和D2。B10murine models which functionally represent the mild and more severe phenotypes of DMD, respectively.

比较Givinostat对本项目中使用的两种小鼠品系的影响是更有趣的。D2。B10mice could not be chronically dosed by daily gavage and received the drug in their drinking water. Even though water consumption measurements have shown that the total doses that D2.B10 mice received were comparable to those of themdx对小鼠来说，在饮用水中进行准确的PK监测基本上是不可能的。然而，在这种给药模式下，Givinostat的血药浓度曲线可能会更平坦，即使预期的AUC值相似，也会达到较低的循环浓度。我们注意到，在该模型中，尽管可以显示出强大的功能益处，但对纤维化只有短暂的影响，对csa没有明显的影响。这种效果的缺乏可能与这些动物所患疾病的严重程度有关，而HDACi可能无法有效地对抗这种疾病。比如药理作用mdx另一种解释可能是，对纤维化和CSA的有效作用需要更高的循环浓度(cmax驱动效应)，而当化合物与饮用水一起给药时，则无法达到这一效果。根据这一推理，当Givinostat与饮食一起使用时，在体内肺纤维化模型中是无活性的(McKinsey TA，未发表的结果)。这种给药方式很可能与D2中饮用水的给药方式相似。B10老鼠。

尽管对其延长DMD患者下床活动的能力、长期使用的利弊以及使用哪种皮质类固醇/方案的选择仍存在疑问，但GC已被常规用于DMD治疗。我们在更严重的DMD小鼠模型中评估了强的松和Deflazacort，我们发现就改善肌肉表现的能力而言，两种GC类固醇之间存在微小差异。强的松和德伐沙科特均不能影响D2的截面积或集中核数。B10肌肉。此外，强的松显著减少TA、GAS和DIA的纤维化，而德伐沙科特仅对TA有效。

最近，Givinostat被证明对两种不同的具有保留射血分数的舒张功能障碍小鼠模型非常有效[63］．在这些实验中，药物被混合到饮食中。在这些心脏模型中，Givinostat阻断了高血压引起的左心室舒张功能障碍，并抑制了正常血压小鼠衰老引起的舒张功能障碍。作者没有观察到对纤维化的影响，但心脏肌原纤维松弛的损害，作为一种以前未被认识到的舒张功能障碍的心肌细胞自主机制被发现，被认为是由肌原纤维蛋白乙酰化调节。因此，我们可以断言，Givinostat在DMD小鼠模型中有效地对抗纤维化，而在肺纤维化和舒张功能障碍小鼠模型中无效。

HDAC2在控制肌原纤维中的特定作用被认为显然已经受到非常低的循环HDACi浓度的影响。研究肌纤维蛋白乙酰化是否也发生在骨骼肌中，以及它在多大程度上影响营养不良肌的功能将是很有趣的。

Givinostat先前已被证明有效mdx目前正在DMD患者的III期临床试验中进行研究。

在这项临床前工作中，我们希望进一步分析分子的药理活性，特别关注功能读数、剂量依赖性和Ltbp4多态性的影响。众所周知，跑步机试验与较大的实验变异性相关。因此，我们首次使用握力测试来监测Givinostat治疗的功能获益。在我们手中，通过该试验监测前肢力获得的数据是可靠的和可重复的，并允许我们建立清晰的剂量-反应关系。使用该读数，Givinostat显示了显著的、剂量依赖性的FNmax改善，最高剂量瞬间接近wt动物的值。在mdx小鼠的跑步距离和耗竭时间也瞬间接近wt值，而D2得到的类似数据。B10mice are more difficult to interpret due to protocol changes that were necessary during the experiment to safeguard animal well-being. Still, also in this case, the top dose showed a statistically significant improvement over vehicle-treated animals in both distance and time to exhaustion evaluations. We conclude that Givinostat improves muscle function, irrespective of the Ltbp4 status. Functional benefits were transient in both mouse strains but even in the decline phase a statistically significant difference with respect to vehicle-treated animals was observed.

HDACis在肌肉再生中的作用机制是复杂的，多方面的，尚未完全了解。纤维成脂祖细胞被认为是这些过程中的关键角色[56，57，62］．在幼小动物中，这些细胞已被HDACis重新编程，以传递促再生因子，并动员肌肉干细胞参与组织修复[56］．在老年动物中不再观察到这种影响，这表明随着时间的推移，再生能力的耗尽可能会发生[56］．这是否是我们实验中观察到的暂时性功能改善的基础，还需要进一步探索。此外，还需要确定这种衰竭过程与HDACis治疗人类疾病的相关性。Givinostat治疗成年贝克尔营养不良患者的临床试验结果(ClinicalTrials.gov标识符:NCT03238235)将在这方面透露。

最高剂量Givinostat诱导TA和GAS肌csa显著升高mdx而对小鼠的核集中没有影响。CSA的增加是由于再生、对抗萎缩过程还是由于保护肌纤维免受损伤，目前尚不清楚。我们注意到Givinostat在体外可有效抑制肌肉萎缩通路(手稿正在制备中)，并具有已知的抗炎活性，可减轻炎症环境中ros介导的组织损伤。这两种作用都有助于保持更大的肌肉纤维。我们还观察到TA, GAS和DIA肌肉纤维化的剂量依赖效应mdx老鼠。抗纤维化作用在最高剂量下是明显的，这与低剂量下功能改善的剂量依赖性形成鲜明对比。下面将进一步讨论这些发现。

进行多剂量PK实验mdx小鼠建立药效/药代动力学相关性。为了将这些数据放在上下文中，我们需要考虑Givinostat是所有11种锌依赖性HDAC亚型的相对非特异性抑制剂。Minetti及其同事已经证明，选择性抑制HDACs 1、2和3的HDAC抑制剂Entinostat (MS-275)与泛hdaci TSA一样活跃[27]，而Colussi和同事已经证明，去除HDAC2的表达可以重现小分子抑制剂的许多特征，证实了抑制该酶在调节HDACis的药理活性方面的关键作用[28］．从机制上看，DMD肌肉中nNOS活性受损导致HDAC2亚硝基化减少，导致其保留在miRNA启动子上，并导致纤维化/氧化应激相关基因表达增加[61］．miR-206被认为受HDAC2控制，并在活化的卫星细胞中表达，在这些细胞中miR-206抑制Pax7因子，从而允许分化进行[64］．最后，HDAC3被证明是巨噬细胞炎症基因表达程序的专性介质[65］．根据这些发现，抑制HDACs 1、2和3可能是Givinostat在DMD中活性的主要驱动因素。

从我们的PK实验中，我们得出结论，Givinostat在肌肉组织中迅速积累，其浓度达到血浆中的4.5倍，HDAC抑制可能是短暂的，因为浓度曲线在几个小时后迅速下降。因此，得到的功能和组织学参数的改善mdx小鼠肌肉组织中Givinostat的高分布水平也可以解释。

由于靶向的HDACs 1、2和3在大多数细胞中是必需的酶，它们的持续、持续的抑制可能是不可容忍的。事实上，试图通过持续输注来输送HDACis，导致其持续抑制，在我们的手中是很不耐受的(c.s.，未发表的观察)。

将我们的剂量-反应曲线与Colussi及其同事在研究中使用Vorinostat报告的剂量-反应曲线进行比较是有趣的mdx小鼠模型[29］．在该报告中，Vorinostat呈钟形剂量-反应曲线，在低剂量1.2 mg/kg时，其功能和组织学效应均达到峰值。我们注意到这种行为与Givinostat的观察结果不同，Givinostat的功能和组织学参数随剂量增加而稳定改善，最高剂量为37.5 mg/kg。Vorinostat和Givinostat具有相似的酶抑制特征[66］．这种差异的一个可能解释可能与两种化合物的不同给药途径有关:Vorinostat在小鼠中的口服生物利用度非常低，Colussi和同事给这种化合物i.p， [29而在我们的实验中，Givinostat采用p.o.给药，I.p.给药有望比p.o.给药产生更高的峰值血药浓度(在I.p.给药5mg /kg剂量后0.25 h, CD1小鼠的Cmax值为123 ng/ml)。值得注意的是，TSA在注射ip后，在mdx尽管该分子在体内的寿命极短，据报道在小鼠体内给药后，其半衰期仅为6.3分钟[67］．然而，ip给药TSA导致微摩尔峰值血浆浓度远高于酶抑制IC50值。综合这些数据，至少在该模型中HDACis的一些药理作用似乎是由瞬时峰值血浆浓度(Cmax值)驱动的mdxGivinostat小鼠:5mg /kg p.o.剂量24 ng/ml;807 ng/ml为37.5 mg/kg p.o.剂量)。

那么问题就变成了:短暂的靶标抑制如何仍然可能导致长期的药效效应?在这方面，最近发表了一项有趣的观察[57]，表明HDACi的药理作用mdx在很大程度上，小鼠是由间充质细胞如纤维成脂祖细胞(FAPs)产生的细胞外囊泡介导的。这些细胞外囊泡参与microRNA向肌肉干细胞的转移，而将营养不良的FAPs暴露于HDACis可增加调节再生、纤维化和炎症等生物过程的microRNA亚群的细胞外囊泡水平。值得注意的是，从暴露于hdac的FAPs中提取的细胞外囊泡能够在营养不良小鼠中单次注射hdac的药理学作用，表明具有持久的药理学作用。

众所周知，HDACi在不同生物途径上的活性可以作为其浓度的函数而大大不同。例如，我们发现HDACi的抗炎活性与抗肿瘤活性所需的浓度相比要低得多[68，69］．因此，一个符合所有这些发现的可能模型可能如下:HDACis可能触发肌纤维自主效应，导致相对低浓度的功能改善，可通过口服灌胃低剂量给药或将药物混合到饮食或饮用水中达到。然而，短暂暴露于高浓度的HDACs，远高于主要目标HDACs 1、2和3的Ki值，可能需要触发促再生和抗纤维化作用。这些药物水平可通过高剂量p.o.给药或低剂量i.p.给药达到。短暂的HDAC抑制可能导致持久的药效学结果是由细胞外囊泡介导的。这一图景需要从额外的临床前实验中进一步证实，并且需要使用相关生物标志物建立定量PK/PD相关性。如果得到证实，这些数据可作为临床优化HDACis给药方案的依据。

虽然导致慢性肌肉损伤的肌萎缩蛋白缺乏是杜氏营养不良的致病因素，但在这些条件下触发的病理修复过程，导致肌肉组织逐渐被纤维化和脂肪组织取代，是一个关键的致病过程。在所有肌肉纤维中恢复抗肌萎缩蛋白的表达理论上可以治愈这种疾病，并且尝试使用外显子跳过寡核苷酸或药物诱导点突变读通至少部分地做到这一点，已经首次批准了针对杜氏患者的靶向治疗[70］．最近发表了关于基于aav的基因治疗的有前景的临床数据，这表明对于那些不能从目前可用的治疗方案中获益的患者来说，进一步迫切需要的治疗改进可能在眼前[70］．尽管如此，所有这些治疗方法都有其局限性，即使目前的基因治疗方法是100%有效的，它们也会导致肌萎缩蛋白的截断型表达，充其量是将致命的杜氏病转变为较温和的贝克尔营养不良类型的疾病。这意味着双管齐下的方法侧重于营养不良蛋白的恢复和修复过程的正常化可能为患者提供最大的利益。

HDACis非常适合这一目的，因为它们通过调节炎症、胶原沉积、脂肪细胞分化和肌肉纤维再生作用于肌肉修复的多个方面[71］．此外，它们可能对肌肉收缩有直接影响。这些理想的活性是由不同的HDAC亚型介导的，这些亚型在不同的细胞类型中表达，并且可能在HDACi浓度和抑制时间方面有不同的要求。还需要进一步的临床前实验来分析单个HDAC亚型在这些过程中的作用，并确定HDAC抑制剂的最佳轮廓和给药计划。

我们的数据表明，无论Ltbp4单倍型如何，Givinostat以剂量依赖的方式提高了功能活性并修改了组织学参数;的确，Givinostat在两种情况下都有效mdx(DMD轻度表型)和D2。B10(DMD severe phenotype) murine models.

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

BW:

体重

客服人员:

横截面积

模式:

杜氏肌营养不良症

迪亚:

隔膜

FNmax:

最大归一化强度

气体:

腓肠肌

GC:

Glucorticoids

HDAC:

组蛋白脱乙酰酶

HDACi:

组蛋白去乙酰酶抑制剂

LTBP4基因:

潜在转化生长因子-β结合蛋白4

microrna:

小分子核糖核酸

ns:

不重要

PK:

药代动力学

助教:

胫骨前

TGF -β:

转化生长因子-β

wt:

野生型

作者非常感谢M. Rochetti对TA、GAS和DIA肌肉横截面积进行的统计分析，并感谢PL Puri和P Bettica对手稿的批判性阅读和有益的讨论。

这项工作得到了伦巴第大区的支持(授予“2014-2020年POR FESR联合金融创新协商会”，CUP: E76D17000080009)。

作者及隶属关系

1. 新药培养箱，Italfarmaco S.p.A，米兰，意大利

   西蒙内塔·安德烈·利桑德罗，吉安卢卡·福萨蒂和克里斯蒂安Steinkühler

2. 米兰-比可卡大学，米兰，意大利

   西蒙内塔·安德里亚·利桑德罗

3. 米兰-比可卡大学医学和外科学院，米兰，意大利

   卢卡Crippa

4. 临床前开发，Italfarmaco s.p.a.，米兰，意大利

   Roberta Pomarico, Raffaella Perego和Flavio Leoni

贡献

SAL、FL和CS构思了这个项目的想法。SAL进行了实验，分析了数据，并撰写了大部分手稿。FL对数据进行了分析。FL、CS、RPo、RPe、LC参与了稿件的撰写。LC和RPo对样品进行分析，对数据进行分析。GF对手稿的批判性阅读做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

作者的信息

不适用。

相应的作者

对应到西蒙内塔·安德里亚·利桑德罗．

伦理批准并同意参与

所有小鼠均按照我们的机构准则进行处理，并遵循国家和国际法律和政策(意大利管理法:D.lgs 26/2014“Attuazione della direttiva 2010/63/UE苏拉protezione degli animali utilizzati a fini scientifici”)。该研究项目已得到意大利卫生部的授权。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

SAL、FL、CS、R Pomarico、R Perego和GF声明，由于他们是Italfarmaco的员工，因此在财务上存在竞争利益。LC声明他没有竞争利益。

出版商的注意

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