氯硝柳胺乙醇胺通过抑制自噬改善糖尿病相关肌肉萎缩gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

糖尿病相关的肌肉萎缩是糖尿病的毁灭性并发症之一，它与胰岛素介导的葡萄糖饥饿引起的肌肉自噬有关。然而，糖尿病相关肌肉萎缩的治疗是有限的。我们之前的研究已经发现氯硝柳胺乙醇胺盐对1型糖尿病小鼠胰岛素缺乏和阿霉素引起的肌肉萎缩有治疗作用。因此，我们旨在研究氯硝柳胺乙醇胺盐对糖尿病引起的肌肉萎缩的治疗作用，并探讨其机制是否与肌肉自噬有关。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

采用链脲佐菌素腹腔注射诱导1型糖尿病小鼠，在正常饮食中添加10 g/kg氯硝柳胺乙醇胺盐。试验期8周。在研究结束时，测量了握力、胫骨前肌、腓肠肌、比目鱼肌和指长伸肌的重量。用PAS染色的胫骨前肌来评估纤维横截面积。采用免疫荧光法检测趾长伸肌和比目鱼肌中肌球蛋白重链的表达，以确定肌纤维类型的组成。应用电镜观察萎缩肌的自噬情况。同时测定血清胰岛素水平和空腹血糖。用腓肠肌组织检测自噬相关蛋白的表达。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现氯硝柳胺乙醇胺盐也可以改善1型糖尿病小鼠的肌肉萎缩，如改善握力下降，改善肢体重量和增加糖酵解肌纤维数量。电镜观察也证实了1型糖尿病小鼠萎缩肌肉中存在丰富的自噬液泡。具体而言，氯氯氨乙醇胺盐可降低1型糖尿病小鼠腓肠肌中p-AMPK (Thr172)、FoxO3a、p-ULK1 (Ser555)、LC3B II和p-p38等自噬相关蛋白的过表达。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

氯硝柳胺乙醇胺盐可改善肌肉萎缩。其机制可能与肌肉自噬抑制有关。gydF4y2Ba

近几十年来，全球糖尿病患病率迅速增加。据估计，2019年有4.63亿人患有糖尿病，预计到2045年，这一数字将达到7亿[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．近年来，关于糖尿病并发症的研究多集中在血管疾病方面[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．越来越多的证据表明，肌肉质量和力量的加速损失也是糖尿病的一个毁灭性并发症[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，可能导致动作缓慢、步态不稳，甚至经常摔倒。此外，由肌肉萎缩引起的足部生物力学的改变可能会增加糖尿病患者患足部溃疡的风险。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．因此，研究糖尿病相关性肌萎缩的发病机制和新药是迫切需要的。gydF4y2Ba

在糖尿病中，肌肉萎缩可能是由于炎症、高血糖、胰岛素缺乏、自噬激活和泛素-蛋白酶体降解引起的。然而，蛋白质降解和肌肉质量的净损失是萎缩肌肉的关键特征。自噬-溶酶体系统是蛋白质降解的主要途径之一，并被证明有助于肌肉萎缩[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．胰岛素是葡萄糖摄取过程中的关键，在肌肉中的蛋白质合成和降解中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．越来越多的证据表明，胰岛素缺乏引起的葡萄糖饥饿可能引发肌肉自噬。gydF4y2Ba

我们前期研究发现，FDA批准的经典驱虫药物氯硝胺乙醇胺盐(NEN)可以改善链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠胰岛素水平下降和体重下降的情况[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．更重要的是，NEN可改善阿霉素引起的肌肉萎缩[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．然而，NEN对糖尿病相关肌肉萎缩的影响尚不清楚。因此，本研究旨在研究NEN对糖尿病性肌肉萎缩的治疗作用，并探讨其机制是否与肌肉自噬有关。gydF4y2Ba

动物模型gydF4y2Ba

动物实验经广州中医药大学动物护理使用委员会批准，并按照相关指南和规定进行。雄性C57BL/6J小鼠购自广东省医学实验动物中心，北京大学深圳研究生院实验动物中心饲养。1型糖尿病(T1D)小鼠通过腹腔内注射溶解于柠檬酸缓冲液的多剂量STZ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (55 mg/kg体重每天)连续5天诱导。正常对照组(T1D-ctrl)小鼠腹腔内注射等量的柠檬酸缓冲液。根据最后一次注射STZ后第9天的空腹血糖，将T1D小鼠随机分为T1D组和T1D + NEN组。T1D-ctrl组和T1D组小鼠正常饲粮，T1D + NEN组小鼠在正常饲粮中添加10 g/kg NEN。全组治疗8周。gydF4y2Ba

握力测试gydF4y2Ba

小鼠在被处死前一天，用测力仪(ZH-YLS-13A，安徽正华生物仪器设备有限公司，中国淮北)测量小鼠肢体握力。根据制造商的说明进行肢体握力测试。PC接口软件自动感知压缩或张力，并记录峰值(mV)。用标准重(1.98 N)测量校正因子，用峰值(mV) ×校正因子计算肢体强度(牛顿)。在本实验中，对每只小鼠进行了三次测量，并将结果的平均值用于分析。gydF4y2Ba

测量血糖和体重gydF4y2Ba

每2周称量每只小鼠的体重，使用血糖仪(Roche, Basel, Switzerland)通过尾静脉穿刺取血样测量血糖。gydF4y2Ba

组织准备gydF4y2Ba

实验结束后处死小鼠，解剖胫前肌(TA)、比目鱼(SOL)、指长伸肌(EDL)、腓肠肌(GAs)，并在纸上吸干，随即称量。用10%福尔马林固定TA肌肉组织，测定纤维截面积。EDL肌肉组织(大小1毫米gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)用2.5%戊二醛固定，1%渗透酸后固定，透射电镜(TEM)检查。GAs肌肉组织立即在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C下，以供后续分析。SOL肌肉和EDL肌肉首先嵌入O.C.T.化合物(Tissue-Tek, Sakura Finetek, USA)中，然后在液氮冷却的异戊烷中冷冻，最后在- 80°C保存以确定纤维类型。gydF4y2Ba

纤维横截面积及纤维尺寸分布的确定gydF4y2Ba

用数码相机拍摄肌肉。石蜡包埋TA肌切片用周期性酸-希夫(PAS)染色。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD, USA)勾画出肌肉横截面内至少40%的纤维(约550-1500根纤维)，以评估肌肉纤维横截面面积和纤维大小分布。gydF4y2Ba

纤维类型测定gydF4y2Ba

用- 20℃低温恒温器(CM1950, Leica, Germany)将制备好的SOL和EDL组织切成10 μm厚的冷冻切片，然后按照前面所述的程序进行MHC表达的免疫荧光分析[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．针对MHC-I (BA-F8)、MHC-IIa (SC-71)和MHC-IIb (BF-F3)的一抗购自发育研究杂交瘤库(美国爱荷华大学国立卫生研究院)，而二抗购自Invitrogen(美国)。由此产生的图像被可视化，并在共聚焦显微镜上捕获(LSM710，卡尔蔡司，Oberkochen，德国)。在整个横截面上拍摄单个图像，然后用Photoshop 7.0 (Adobe, USA)组装成合成全景图像。对整个图像内的所有纤维进行表征，用于纤维类型分析。gydF4y2Ba

电子显微镜gydF4y2Ba

TEM图像由杰姆-1400(JEOL，东京，日本)拍摄。肌原纤维间区和肌层下区均有自噬液泡。gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验(ELISA)gydF4y2Ba

使用酶联免疫吸附测定试剂盒(Merck Millipore, Danvers, MA, USA)根据制造商说明书测量血清胰岛素。gydF4y2Ba

免疫印迹分析gydF4y2Ba

速冻的GAs肌肉组织在裂解缓冲液中均质，并在样品加载缓冲液中制备(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。裂解蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merck Millipore, Danvers, MA, USA)。在含5%脱脂干牛奶的TBS缓冲液中在室温下阻塞1小时后，将膜孵育，并在4℃下用一抗轻轻摇动过夜。用TBS洗涤后，用二抗在室温震动下孵育1 h。清洗后，使用ChemiDoc™MP成像系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)检测和分析蛋白带。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为负载对照。结果表示为相对于GAPDH的集成光密度。以抗GAPDH一抗为加载对照。结果表示为相对于GAPDH的集成光密度。抗p-ULK1(ser555)、ULK1、p-AMPK (Thr172)、AMPK、LC3B、p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)、p38 MAPK和FoxO3a的一抗购自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)。 Primary antibody against GAPDH was from Proteintech Group, Inc. (Chicago, IL, USA).

统计分析gydF4y2Ba

数据以均数±标准差表示。两组间的统计学差异用未配对的Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。对血糖和体重数据进行重复测量方差分析(ANOVA)，影响分为组(T1D-ctrl vs T1D, T1D vs T1D + NEN)和周(第0、2、4、6、8、10周)。事后测试使用gydF4y2BaBonferronigydF4y2Ba．采用SPSS 16.0版统计软件进行统计分析gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

NEN可以预防T1D小鼠的肌肉无力gydF4y2Ba

为了检测NEN是否影响T1D小鼠的肌肉功能，对小鼠进行了握力评估。结果显示，T1D小鼠的握力下降，而NEN治疗可以增强T1D小鼠的握力(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

NEN恢复了T1D小鼠的体重，改善了肢体肌肉萎缩gydF4y2Ba

除增强肌肉力量外，NEN对t1d小鼠骨骼肌萎缩也有治疗作用。注射STZ后第9天，T1D小鼠体重较正常对照组明显下降(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.000 < 0.001)。在NEN治疗后，T1D小鼠的体重逐渐增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.015<0.05)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).实验结束时，T1D小鼠的后肢肌肉比对照组小鼠小，但NEN治疗改善了后肢肌肉(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).对个体下后肢肌肉的分析显示，t1d小鼠的TA、GAs、EDL和SOL的重量较对照组明显降低，而NEN可以增加TA、GAs和SOL的肌肉质量(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba氟)。gydF4y2Ba

NEN增加了t1d小鼠的肌肉纤维大小gydF4y2Ba

我们进一步测量了小鼠骨骼肌纤维的横截面积。同样，T1D小鼠TA肌的平均横截面积明显缩小，NEN确实增加了TA肌纤维的平均横截面积(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, c)。此外，T1D小鼠TA肌肉的横截面积分布向更小的纤维转移，NEN也可以标准化这一变化(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

NEN恢复了T1D小鼠的糖酵解肌纤维gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, c, e, t1d小鼠SOL肌肉中II型纤维数量明显减少，EDL肌肉中无明显变化，NEN可增加SOL肌肉中II型纤维数量。此外，分析了II型糖酵解纤维的组成，发现T1D小鼠的纤维亚型发生了改变。SOL肌肉中IIa型纤维减少(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, e)，而EDL肌中IIb型纤维较少(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba有趣的是，NEN可以恢复这些纤维亚型(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB, d, e)。gydF4y2Ba

NEN改善了T1D小鼠的胰岛素缺乏和能量不足gydF4y2Ba

我们前期研究认为NEN对糖尿病小鼠的保护作用可能是通过改善β细胞功能或诱导α- β样细胞转化[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．与之前的研究一致，T1D小鼠的血清胰岛素水平明显低于对照组，而NEN治疗可以提高其水平(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).因此，T1D + NEN组血糖低于T1D组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.000 < 0.001)(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).胰岛素缺乏导致T1D小鼠肌肉中p-AMPK (Thr172)表达显著增加，提示能量供应不足。NEN可降低p-AMPK (Thr172)的表达(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA, b, c)。gydF4y2Ba

NEN抑制葡萄糖饥饿诱导的T1D小鼠肌肉自噬gydF4y2Ba

电镜显示肌原纤维间区和肌层下区有丰富的自噬空泡。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)。因此，我们接下来研究了自噬相关蛋白的表达，看看T1D小鼠的肌肉中是否存在过度的自噬。结果表明，在T1D小鼠中FoxO3a、p-ULK1 (Ser555)、LC3B-II和p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)的蛋白表达显著升高。此外，T1D + NEN组T1D小鼠中上述蛋白的过度表达减少。这些表明NEN可以改善肌肉自噬(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baⅰ)。gydF4y2Ba

本研究表明，NEN可防止T1D小鼠肌肉萎缩，其机制可能与抑制葡萄糖饥饿引起的肌肉自噬有关。gydF4y2Ba

据报道，体重增加对增强肌肉力量有好处[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．与我们之前的研究一致[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，本研究表明，NEN可以抵消体重和肌肉质量的下降，并增强后肢握力。提示NEN对T1D小鼠肌肉萎缩的影响可能与增加T1D小鼠肌肉重量有关。gydF4y2Ba

骨骼肌纤维的特征是一种慢缩纤维(I型)和三种快缩纤维(IIa型、IIx/d型和IIb型)，其中IIb型纤维主要为糖酵解纤维。糖尿病患者纤维可由快抽动型转变为慢抽动型，II型纤维优先萎缩[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，因为II型纤维更容易营养不足[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．糖酵解肌的丧失可能导致握力下降[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在本研究中，T1D小鼠TA肌纤维几乎由II型纤维组成，出现明显萎缩。我们还发现在SOL肌和EDL肌中，快速/糖酵解纤维减少。综上所述，我们认为NEN对糖尿病相关肌肉萎缩的保护可能部分归因于II型纤维的恢复。gydF4y2Ba

骨骼肌是胰岛素介导葡萄糖摄取的主要器官[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．胰岛素缺乏引起骨骼肌葡萄糖饥饿，可导致肌肉线粒体ATP生成率显著降低[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．有趣的是，自噬可以激活大量蛋白质降解，通过三羧酸(TCA)循环获取氨基酸作为ATP生产的燃料，以维持能量平衡[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．因此，在胰岛素缺乏T1D小鼠中，自噬在肌肉萎缩中起着至关重要的作用，这可能是由于能量不足而激活的，以氨基酸代替葡萄糖。AMPK是一种细胞内能量传感器，可以被任何破坏ATP生成的机制激活[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．研究表明AMPK激活可以通过激活FoxO3a和ULK1促进骨骼肌细胞自噬[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．越来越多的证据表明FoxO3a是自噬的主要转录调控因子，它控制着广泛的萎缩相关基因，包括Fbxo32 (Atrogin-1)和Trim63 (MuRF-1)等自噬基因[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．ULK1是自噬途径的重要诱导因子之一，可启动自噬体的形成[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．我们的研究表明，与T1D小鼠相比，NEN治疗的T1D小鼠的p-AMPK (Thr172)、FoxO3a和p-ULK1 (Ser555)表达更少。gydF4y2Ba

P38 MAPK也被认为可以调节骨骼肌的自噬[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]由于骨骼肌在耐力运动和禁食等多种细胞应激下过度磷酸化[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．我们之前的研究也发现NEN可以通过抑制阿霉素暴露小鼠p38 MAPK/FoxO3a的激活来预防肌肉萎缩[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．同样，如上述结果所示，NEN处理也能抑制T1D小鼠p38MAPK的过度激活。LC3BII是自噬体存在的标志[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]，在本研究中，通过NEN治疗T1D小鼠减少。结果进一步提示NEN抑制了细胞自噬。gydF4y2Ba

综上所述，我们认为NEN可以改善肌肉萎缩。其机制可能与肌肉自噬抑制有关。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

欧宁:gydF4y2Ba

氯硝柳胺乙醇胺盐gydF4y2Ba

STZ:gydF4y2Ba

链脲霉素gydF4y2Ba

近年来:gydF4y2Ba

1型糖尿病gydF4y2Ba

索尔:gydF4y2Ba

比目鱼肌gydF4y2Ba

助教:gydF4y2Ba

胫骨前gydF4y2Ba

联盟:gydF4y2Ba

伸肌远端长肌gydF4y2Ba

气体:gydF4y2Ba

腓肠肌gydF4y2Ba

GAPDH:gydF4y2Ba

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

本研究由国家自然科学基金项目(81673794,82004156)、深圳市科技计划项目(JCYJ20190812183603627)、深圳市三明医药项目(SZSM201512040)资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 蔡宇春和詹宏岳对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 518033广东省深圳市福田区福华路1号，广州中医药大学第四临床医学院，深圳中医医院肾内科gydF4y2Ba

   蔡宇春，詹宏跃，翁文慈，王瑶，韩鹏勋，孙慧丽gydF4y2Ba

2. 汕头市中医院重症医学科，汕头市，中国gydF4y2Ba

   Hongyue詹gydF4y2Ba

3. 518033广东省深圳市福田区福华路1号广州中医药大学第四临床医学院深圳市中医医院病理科gydF4y2Ba

   于学文，邵木敏gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

孙惠丽和邵木敏负责该研究的概念和设计。Yuchun Cai和Hongyue Zhan进行了大部分实验并分析了大部分数据。翁文慈、王瑶和韩鹏勋进行了一些动物实验，并分析了一些数据。于学文对肌肉进行组织学染色。蔡宇春、詹宏岳、孙慧丽负责起草手稿。所有作者都阅读并审阅了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaMumin邵gydF4y2Ba或gydF4y2Ba汇丽的太阳gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

所有动物研究程序均经广州中医药大学动物护理使用委员会批准，并符合相关指南和规定。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

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