运动诱导的线粒体p53修复突变小鼠的mtDNA突变gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

人类遗传疾病和转基因小鼠模型表明，线粒体DNA (mtDNA)突变和端粒功能障碍会引发衰老过程。从流行病学角度来看，锻炼与延长预期寿命和降低慢性疾病风险有关。虽然锻炼的有益效果已经得到了很好的证实，但引发这些观察结果的分子机制尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

耐力运动减少mtDNA突变负担，减轻多系统病理，并增加突变小鼠的寿命，校正缺陷线粒体聚合酶γ (POLG1)。我们报告了运动介导的独立于POLG1的mtDNA修复途径的证据，这是一个令人惊讶的概念，因为POLG1通常被认为是唯一的mtDNA修复酶。在这里，我们表明，肿瘤抑制蛋白p53易位到线粒体，并促进mtDNA突变修复和线粒体生物发生，以响应耐力运动。事实上，在肌肉特异性p53缺失的突变小鼠中，运动未能阻止mtDNA突变，诱导线粒体生物发生，保持线粒体形态，逆转肌肉减少症，或降低过早死亡。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的数据确立了p53在运动介导的mtDNA基因组维持中的新作用，并提出了线粒体靶向p53作为线粒体病因性疾病的一种新的治疗方式。gydF4y2Ba

衰老现象的普遍性引起了人们对揭示再生疗法和年轻化药物的极大兴趣，这些药物旨在逃避哺乳动物衰老的分子刺激因素。年龄相关病理的分子研究表明，线粒体DNA (mtDNA)突变是驱动多系统退化、应激不耐受和能量不足的主要诱因之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．我们可以直观地假设，衰老过程中观察到的mtDNA从头突变是由于累积的、未修复的氧化损伤，但一些证据实际上表明，mtDNA复制错误可能是更重要的罪魁祸首。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．在携带易出错线粒体聚合酶γ的突变小鼠中，衰老的多个方面加速，这一证明为mtDNA复制错误在激发哺乳动物衰老中的因果作用提供了支持[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．在端粒酶缺陷小鼠中也报道了类似的表型[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，其中端粒功能障碍与线粒体生物发生受损和代谢失败有关，导致进行性组织萎缩、干细胞衰竭、器官系统衰竭和随着衰老而出现的组织损伤反应受损[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．的确，流行病学研究表明，外周血白细胞端粒长度减少与60岁以上人群的高死亡率有关[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．此外，最近一项针对百岁老人及其后代的研究发现，端粒长度与寿命之间存在正相关;特别是那些端粒较长的人整体健康状况有所改善，与对照组相比，年龄相关疾病的发病率降低，认知功能更好，血脂状况也有所改善[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

现代慢性疾病的流行主要是由于久坐不动的生活方式和过多的能量摄入[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．有无可争辩的证据表明，耐力运动可延长啮齿动物和人类的预期寿命，并降低患慢性疾病的风险[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．我们之前已经证明，耐力运动有效地挽救了突变小鼠的早老性衰老，同时减少了mtDNA突变，尽管线粒体聚合酶γ (POLG1)校对功能存在固有缺陷[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．运动也被证明可以增加端粒酶活性，减少衰老标志。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．这些发现表明运动介导的代谢适应与基因组(核和线粒体)稳定性之间存在联系;然而，这种代谢联系的身份仍然未知。在本研究中，我们利用PolG小鼠研究了早老性衰老背景下的线粒体-端粒功能障碍轴，并阐明了运动如何通过肿瘤抑制蛋白p53的线粒体定位来抵消线粒体功能障碍和mtDNA突变负担。gydF4y2Ba

老鼠的繁殖gydF4y2Ba

杂合子小鼠(C57Bl/6J，gydF4y2BaPolgAgydF4y2Ba^{+ / D257AgydF4y2Ba})是美国威斯康辛大学麦迪逊分校Tomas a . Prolla博士的厚礼[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．我们生成纯合子mtDNA敲入突变小鼠(PolG;gydF4y2BaPolgAgydF4y2Ba^{D257A / D257AgydF4y2Ba})和同窝野生型(WT;gydF4y2BaPolgAgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba)取自麦克马斯特大学中央动物设施的杂合子小鼠源性菌落，如上文所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．肌肉特异性p53敲除小鼠(p53 MKO)是通过杂交p53 flox小鼠(gydF4y2BaTrp53gydF4y2Ba^{tm1BrngydF4y2Ba}肌酸激酶Cre重组酶小鼠(Tg(Ckmm-cre)5Khn/J)，购自Jackson实验室。我们通过杂交杂合子小鼠(gydF4y2BaPolgAgydF4y2Ba^{+ / D257AgydF4y2Ba})与p53 MKO小鼠。在育种过程中，所有动物在12小时的光/暗循环中，每个笼子安置3至5只动物，断奶后自由饲喂(Harlan-Teklad 8640 22/5啮齿动物饲料)。如前所述，证实存在聚合酶纯合敲入突变[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

耐力训练方案gydF4y2Ba

如前所述，采用独立的小鼠队列进行耐力锻炼方案和组织采集[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．简单地说，在3个月大时，将小鼠单独安置在温度和湿度可控的房间内的微隔离笼中，并保持12小时的明暗循环，随意提供食物和水[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．PolG小鼠和PolG-p53 MKO小鼠被随机分配到久坐(PolG- sed或PolG-p53 MKO- sed)或强迫耐力(PolG- end或PolG-p53 MKO- end)运动组(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5 - 20 /组;♀=♂)。这些老鼠之前都没有接受过有组织的锻炼。让耐力训练组的小鼠进行一周的预训练以适应跑步机。耐力运动组小鼠进行强制跑步机运动(Eco 3/6跑步机;Columbus Instruments, Columbus, Ohio)每周三次，以15米/分钟的速度，持续45分钟，持续6个月。还包括5分钟的热身和8米/分钟的冷却。PolG小鼠的年龄和性别与不运动的WT小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 20;♀=♂)，作为对照，以评估耐力运动干预是否能在分子上使PolG小鼠恢复正常。在8个月大时，动物被安乐死，并收集组织进行分子分析。这项研究是由麦克马斯特大学动物研究和伦理委员会根据全球动物利用协议# 12-03-09批准的，实验协议严格遵循加拿大动物保护委员会提出的指导方针。gydF4y2Ba

耐力压力测试gydF4y2Ba

研究人员对小鼠进行了四项独立的耐力压力测试，以间接评估运动对有氧能力的改善，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．简单地说，所有组的动物都被放在跑步机上的单独车道上，并让它们适应30分钟，以消除任何由于新环境带来的压力或焦虑造成的混杂影响。测试开始时，以8米/分钟的速度进行5分钟的热身，然后每2分钟增加1米/分钟的速度，直到小鼠精疲力竭。提供低强度的电刺激以确保依从性。当小鼠坐在跑步机下端靠近电击棒的地方>秒，并且对继续跑步的进一步刺激没有反应时，记录到衰竭的时间(min)。gydF4y2Ba

生存分析gydF4y2Ba

如前所述，使用来自所有组的独立动物队列进行生存分析[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，采用GraphPad Prism 4.0计算Kaplan-Meier生存曲线。gydF4y2Ba

组织收集gydF4y2Ba

如前所述，在安乐死时收集组织[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．颈椎脱位后，立即暴露胸腔，并迅速取出心脏，随后取出骨骼肌(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)．骨骼肌(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba，gydF4y2Ba胫骨前gydF4y2Ba,gydF4y2Ba比目鱼肌gydF4y2Ba)和心脏(i)收集在无rnase的低温容器中，立即浸泡在液氮中，并保存在- 80°C下，以便稍后分析DNA、RNA、蛋白质和酶活性;或(ii)立即用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并用于骨骼肌和心脏线粒体和核分离。gydF4y2Ba

造血干细胞和祖细胞分离gydF4y2Ba

小鼠造血干细胞和祖细胞(HSC)按照Ema等方法进行分离，并稍加修改[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．用25g针头从股骨和胫骨冲洗骨髓，通过50 μm筛子，用血细胞计计数。将细胞与一抗在4℃下孵育90分钟，然后在适当的二抗中在4℃下孵育20分钟。使用EPICS ALTRA™荧光激活细胞分选仪(Beckman Coulter, Mississauga, ON)对富集干细胞的谱系阴性、Sca-1和c-Kit阳性(LSK)群体进行分类，并使用单染色对照建立门控策略。使用了以下抗体:谱系面板(BD Pharmingen™，Mississauga, ON)，抗小鼠Sca-1克隆:E13-161.7 (BD Pharmingen™，Mississauga, ON)，抗小鼠c-Kit克隆:2B8 (eBioscience, San Diego, CA)，和链霉菌亲和素(BioSource, Burlington, ON)。gydF4y2Ba

卫星蜂窝隔离gydF4y2Ba

原代骨骼肌卫星细胞(SC)采用先前描述的方法从WT、PolG-SED和PolG-END小鼠中分离[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，然后通过荧光激活细胞分选进行纯化。简单地说，后肢骨骼肌被仔细解剖，清除脂肪并在冷PBS中清洗。用剪刀覆盖组织释放细胞，在胶原酶/散酶溶液中孵育三次，每次12分钟，37°C，两次孵育之间使用移液器进一步机械破坏。通过70和30 μm过滤器后，使用c-met偶联PE的一抗(1:200,eBioscience, San Diego, CA)对细胞进行染色，并进行FACS分选(EPICS ALTRA™，Beckman Coulter, Mississauga, ON)。SC在不含rnase的低温容器中制成颗粒，立即浸泡在液氮中，并在- 80°C保存以备后续分析。gydF4y2Ba

小鼠胚胎成纤维细胞分离和报告实验gydF4y2Ba

小鼠胚胎成纤维细胞(mef)使用标准技术从WT (p53gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba)和p53敲除(KO)小鼠(p53gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba})．实验中使用的细胞来自传代4-5。PGC-1α启动子序列通过PCR从小鼠肌肉基因组DNA中扩增，并克隆到pGL4荧光素酶报告载体(Promega, Madison, WI)。使用含有13个合成p53 DNA结合位点的pG13-luc质粒作为阳性对照(Jackson等人，2001年和Kern等人，1991年对其进行了全面描述)。用表达GFP的质粒对转染效率进行归一化。p53gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba和p53gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}用空pGL4、pG13-luc(阳性对照)或pGL4- pgc -1α载体转染mef (Lipofectamine 2000, Invitrogen, Burlington, ON)。使用Bright-Glo™荧光素酶报告检测系统(Promega, Madison, WI)检测p53的转录活性。gydF4y2Ba

骨骼肌和心脏的总RNA分离gydF4y2Ba

总RNA从25毫克骨骼肌中分离出来(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)和心脏使用Qiagen总RNA分离试剂盒(Qiagen，密西索加，ON) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．RNA样品在Qiagen旋转柱(Qiagen, Mississauga, on)上用RNase-free DNase处理以去除DNA污染。RNA完整性和浓度使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)进行评估[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．所有样本的平均RIN (RNA完整性数)值为9.64±0.20(量表1-10)，确保了高质量的分离RNA。gydF4y2Ba

从HSC和SC中分离RNA, DNA和蛋白质gydF4y2Ba

根据制造商说明，使用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON)从HSC和SC中分离总RNA、DNA和蛋白质。gydF4y2Ba

微阵列分析gydF4y2Ba

从骨骼肌中提取总RNA (gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)使用Qiagen RNeasy Micro kit (Qiagen, Mississauga, ON)，并使用标准制造商的协议在Qiagen的QIAcube (Qiagen, Mississauga, ON)上进行处理。然后使用Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE)和Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)检查样品的质量。TransPlex全转录组扩增试剂盒(Sigma-AldrichgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba， Oakville, ON)被用于根据制造商的说明从肌肉RNA样本中扩增互补(cDNA)。使用推荐的循环参数对样品进行25个循环放大。所有样品随后使用Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Mississauga, ON)进行纯化，并在Qiagen的QIAcube (Qiagen, Mississauga, ON)上使用标准的“清除QIAquick PCR扩增反应”(Version 4)协议进行处理。样品使用Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE)和Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 7500芯片(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)进行纯化和检测，以确保适当的产量和扩增质量。为了进行微阵列杂交，使用NimbleGen的One Color Labeling kit (Cat。# 05223555001;Roche NimbleGen Inc.， Madison, WI)根据制造商的协议。5微克Cy3标记样品杂交gydF4y2Ba亩骶gydF4y2Ba12x135k, NimbleGen基因表达阵列(Cat。# 05543797001;Roche NimbleGen Inc.， Madison, WI)，根据制造商的协议清洗和扫描。使用Axon GenePix 4200A扫描仪(Molecular Devices Inc.， Downingtown, PA)扫描NimbleGen基因表达阵列，设置为100 POW和300-350光电倍增管(PMT)。使用NimbleScan软件为每个阵列生成对文件(Roche NimbleGen Inc.， Madison, WI)。使用Bioconductor软件(Bioconductor, Seattle, WA)分析得到的阵列数据，其中数据进行归一化，并对基于5%错误发现率(FDR)评估的显著差异表达基因进行测试。本文报道的基因阵列数据保存在gene Expression Omnibus(登录号:GSE75869)公共功能基因组数据存储库中。结果数据输入匠心路径分析(IngenuitygydF4y2Ba^®gydF4y2Ba系统，Redwood City, CA)确定过度代表的基因类别使用严格关联。使用R脚本和Bioconductor软件(Bioconductor, Seattle, WA)在热图中绘制这些类别的标准化表达。gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (PGC-1α)、线粒体转录因子A (TFAM)、雌激素相关受体α (ERRα)、5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)、细胞色素的信使RNA (mRNA)表达gydF4y2BacgydF4y2Ba氧化酶亚基i (COX-I)，细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba氧化酶亚基- iv (COX-IV)，复合体I NADH脱氢酶亚基1 (ND1)，复合体V亚基atp酶6 (ATPase 6)，周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A (p21gydF4y2Ba^{WAF1gydF4y2Ba})，周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A (p16gydF4y2Ba^{INK4AgydF4y2Ba})，使用7300实时PCR系统(应用生物系统公司，福斯特城，CA)和SYBR对生长停滞和dna损伤诱导β (GADD45B)进行量化gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba绿色化学(完美gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba一个SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2BaGreen Supermix, ROX, Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD)，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．使用高容量cDNA逆转录试剂盒，从1 μg总RNA中随机引物进行第一链cDNA合成(Applied Biosystems Inc.， Foster City, CA) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．上述基因的正向和反向引物(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)基于GenBank中可用的序列，使用在线MIT Primer 3设计软件(由Whitehead研究所和Howard Hughes医学研究所开发，由Steve Rozen和Helen Skaletsky开发)设计，并使用基本局部比对搜索工具确认特异性。β-2微球蛋白被用作控制基因，因为其表达不受实验干预的影响(数据未显示)。所有样本同时重复运行，阴性对照不含cDNA。仪器生成的熔点解离曲线用于确认扩增产物的特异性。gydF4y2Ba

组织总DNA分离gydF4y2Ba

总DNA(基因组和线粒体DNA)从大约15毫克骨骼肌(gydF4y2Ba比目鱼肌gydF4y2Ba)和心脏使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen, Mississauga, ON) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．DNA样本用RNase (Fermentas, Mississauga, ON)处理以去除RNA污染。DNA浓度和质量使用Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE)进行评估。gydF4y2Ba

mtDNA拷贝数分析gydF4y2Ba

从骨骼肌定量分析线粒体DNA拷贝数与二倍体染色体DNA含量的关系(gydF4y2Ba比目鱼肌gydF4y2Ba)，心脏，原代造血干细胞，原代卫星细胞和原代成纤维细胞，使用ABI 7300实时PCR(应用生物系统公司，CA) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．引物围绕线粒体基因组的COX-II区域设计(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。核β-珠蛋白基因被用作管家基因(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。gydF4y2Ba

平均端粒长度gydF4y2Ba

如前所述，使用实时定量PCR方法测量心脏、原代造血干细胞和原代卫星细胞基因组DNA中的平均端粒长度[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．该实验的前提是通过特殊设计的引物序列定量端粒DNA，并将其数量除以单拷贝基因的数量来测量平均端粒长度比[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．所有样本都使用7300实时PCR系统(应用生物系统公司，福斯特城，CA)和SYBR运行gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba绿色化学(完美gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba一个SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2BaGreen Supermix, ROX, Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD)。一个编码酸性核糖体磷蛋白PO的单拷贝基因36B4被用作每个样本扩增的对照[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．端粒和36B4的每个PCR反应均含有12.5 μL的1倍SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba绿色主混合(完美gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba一个SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2BaGreen Supermix, ROX, Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD)， 300 nM的正向和反向端粒或36B4引物(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)， 20ng基因组DNA，足够的DNase/RNase-free HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (Applied Biosystems Inc.， Foster City, CA)产生25 μ l反应。端粒的循环条件如下:95°C 10分钟，然后在95°C下收集30次数据，持续15秒，56°C退火-扩展步骤1分钟。36B4的循环条件如下:95°C 10分钟，然后在95°C下收集35次数据，持续15秒，52°C退火20秒，然后在72°C下扩展30秒。每个样品一式两份，计算端粒:36B4之比。这些比率的平均值被报道为平均端粒长度比(ATLR)。gydF4y2Ba

全组织裂解液gydF4y2Ba

如前所述，从组织样本中提取总蛋白[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．简而言之，约30毫克骨骼肌(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)和心脏在2 mL惠顿玻璃均质器(Fisher Scientific，渥太华，on)中进行冰均质，并加入25体积磷酸盐均质缓冲液[50 mM KPi, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 1.15% KCl，每10 mL缓冲液补充一个Complete Mini，无etda蛋白酶抑制剂鸡尾酒片和磷酸酶抑制剂鸡尾酒片(罗氏应用科学，曼海因，德国)]。裂解液在600℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分钟，使细胞碎片颗粒化。将上清液搅拌，在液氮中快速冷冻，并在−80°C保存，直到进一步分析。gydF4y2Ba

核分离gydF4y2Ba

从40毫克新鲜获得的骨骼肌(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)，心脏，原代卫星细胞和原代成纤维细胞，使用市售核提取试剂盒(Pierce NE-PERgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba，罗克福德，伊利诺伊州)，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．简单地说，样品在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的完整的、不含etda的ceri缓冲液中均质，使用电子均质器(Pro 250, Pro Scientific，牛津，CT，美国)。通过16000离心得到含核球团gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下浸泡10分钟，随后在PBS中洗涤四次以去除胞质污染蛋白。核蛋白在添加蛋白酶抑制剂的NER缓冲液中提取[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．正如我们小组先前所示，在Western blot分析中，核组蛋白H2B的丰度和细胞质乳酸脱氢酶的缺失证实了核部分的富集和纯度[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀试验gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀(ChIP)检测使用EZ-ChIP™试剂盒(Millipore, Billerica, MA)进行，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．20毫克一片gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba肌肉在5毫升含1%甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水中交联，室温下10分钟。加入1毫升10X甘氨酸停止固定。然后将肌肉均质于1ml的SDS裂解缓冲液中，该缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒，不含etda (Roche应用科学公司，曼海姆，德国)。染色质是通过使用布兰森数字声纳器在冰上声纳每个样本来剪切的gydF4y2Ba^®gydF4y2Bas - 450d(输出20%，4次20秒，每次暂停20秒;布兰森超声波公司，丹伯里，康涅狄格州)。离心10000倍gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃10 min，将含有1mg蛋白质的上清液用稀释缓冲液稀释至1ml。每个样品添加10微克抗p53 (FL-393)抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.， Santa Cruz, CA)，在4°C下孵育过夜。以抗igg抗体作为非特异性对照。加入60微升蛋白g -琼脂糖，样品在4°C旋转混合1小时。沉淀的复合物在100 μL洗脱缓冲液中洗脱，每个样品加入8 μL的5 M NaCl，在65°C下孵卵10小时，反交联。根据制造商的说明纯化共免疫沉淀的DNA。引物被设计用于扩增PGC-1α启动子的p53结合区域(−564和−954)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。使用7300 Real-time PCR系统(Applied Biosystems Inc.， Foster City, CA)和SYBR定量PGC-1α启动子与p53免疫沉淀的数量gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba绿色化学(完美gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba一个SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2BaGreen Supermix, ROX, Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD)。从输入样本中未进行免疫沉淀的纯化DNA使用β-球蛋白引物进行pcr扩增(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)，用于归一化来自ChIP分析的信号。gydF4y2Ba

线粒体分离gydF4y2Ba

如前所述，使用差速离心分离线粒体片段[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．简言之，骨骼肌(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba胫骨前gydF4y2Ba)、心脏、原代卫星细胞和原代成纤维细胞被细切碎，并在1:10 (wt/vol)的冰冷隔离缓冲液A (10 mM蔗糖、10 mM Tris/HCl、50 mM KCl和1 mM EDTA，以及0.2%不含脂肪酸的BSA, pH 7.4，补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒Complete，无etda[罗氏应用科学，曼海姆，德国])上使用陶特- elvehjem玻璃均质器进行均质。所得匀浆在700℃离心15分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba，随后上清液在12000下离心20 mingydF4y2BaggydF4y2Ba．12000粒线粒体颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba将自旋洗净，然后重新悬浮在小体积的冰冷隔离缓冲液B中(10 mM蔗糖，0.1 mM EGTA/Tris和10 M Tris/HCl, pH 7.4，补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒Complete，无etda [Roche应用科学，曼海姆，德国])。所有离心步骤均在4°C下进行。线粒体颗粒立即在−80°C冷冻，用于进一步的生化分析。线粒体细胞色素的丰度证实了线粒体组分的富集和纯度gydF4y2BacgydF4y2Ba氧化酶亚基IV蛋白，核组蛋白H2B和细胞质蛋白乳酸脱氢酶的缺失，如我们小组先前所示[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

线粒体免疫共沉淀试验gydF4y2Ba

如前所述，使用Pierce co-immunoprecipitation Kit (Pierce, Rockford, IL)对分离的线粒体片段进行线粒体共免疫沉淀试验[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．简单地说，线粒体片段在裂解缓冲液(0.025 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.001 M EDTA, 1% NP-40, 5%甘油，pH 7.4)中均质，补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒Complete，无etda(罗氏应用科学公司，曼海姆，德国)。用100 μL对照琼脂糖树脂孵育2毫克线粒体片段，以减少非特异性结合。40微克抗p53 (FL-393)抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.， Santa Cruz, CA)共价偶联到胺反应树脂上。随后将预先清除的裂解物与抗体偶联珠一起在4℃下孵育过夜。离心收集共免疫沉淀物，在50 μL Laemmli样品缓冲液中煮沸，用于免疫印迹分析POLG1 (William C. Copeland博士，National Institutes of Health)或anti-Tfam (sc23588, a -17;Santa Cruz Biotechnology Inc.， Santa Cruz, CA)抗体。采用抗igg抗体作为非特异性对照。gydF4y2Ba

mtDNA免疫沉淀试验gydF4y2Ba

mtDNA免疫沉淀对骨骼肌线粒体部分进行，如前所述交联和超声检测[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．25%的小鼠预先清除了1毫克的线粒体片段gydF4y2BavgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba预清除矩阵F (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)在4°C过夜。然后用20 μg抗p53 (FL-393)抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.， Santa Cruz, CA)和ExactaCruz™F基质(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)孵育上清[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba在4°C下，在5 μg共享鲑鱼精子DNA的存在下，通过端到端倒置混合过夜(Sigma-AldrichgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba， Oakville, ON)以减少非特异性dna -珠相互作用。采用抗igg抗体作为非特异性对照。基质在16000度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在严格的条件下(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA)洗涤四次，并在65℃下，在1% SDS的存在下孵育过夜，进行交联还原。根据制造商的说明，使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen, Mississauga, ON)从上清液中提取DNA。mtDNA COX-II和细胞色素gydF4y2BabgydF4y2Ba区域(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)使用7300实时PCR系统(应用生物系统公司，福斯特城，CA)和SYBR进行定量gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba绿色化学(完美gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba一个SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2BaGreen Supermix, ROX, Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD)，如前所述[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Western blotting和氧化损伤标记gydF4y2Ba

使用商业测定法(BCA蛋白测定法，Pierce, Rockford, IL)测定全组织裂解物、线粒体和核部分的蛋白浓度。蛋白质被分解在10%或12.5%的SDS-PAGE凝胶上，这取决于感兴趣的蛋白质的分子量。凝胶被转移到Hybond上gydF4y2Ba^®gydF4y2BaECL硝化纤维膜(Amersham, Piscataway, NJ)，并使用以下市售一抗进行免疫印迹:MitoProfilegydF4y2Ba^®gydF4y2BaTotal OXPHOS鼠类鸡尾酒(MS604)抗体(MitoSciences, Eugene, OR);抗pgc -1α(2178)，抗vdac(4866)，抗-α/β-微管蛋白(2148)抗体(细胞信号技术，丹佛，马萨诸塞州);抗p53 (MABE283-PAb421)抗体(EMD Millipore);抗tfam (sc-23588)和抗nrf -1 (sc-33771)抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.， Santa Cruz, CA);抗polg1抗体(美国国立卫生研究院William C. Copeland博士的善意礼物);抗柠檬酸合成酶抗体(加拿大病童医院Brian H. Robinson博士的厚礼);抗4- hne (ab48506)，抗sod2 (ab13533)，抗过氧化氢酶(ab1877)，抗p21gydF4y2Ba^{WAF1gydF4y2Ba}(ab7960)抗体(Abcam, Cambridge, MA);anti-Pax7(发育研究杂交瘤库，爱荷华大学，爱荷华市，IO);以及抗er α (EPR46Y)和抗肌动蛋白(NB600-535)抗体(Novus Biologicals, Littleton, CO) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．利用OxyBlot蛋白检测试剂盒(S7150;Millipore, Bedford, MA)按照制造商的说明。除抗肌动蛋白(1:10 000)外，所有抗体均按1:1000稀释。然后用适当的抗小鼠或抗兔马萝卜过氧化物酶链接二抗(1:10 000)孵育膜，并用增强的化学发光检测试剂(Amersham, Piscataway, NJ)进行观察。使用NIH Image J, version 1.37，分析软件(Scion Image, NIH)对蛋白条带的相对强度进行数字量化。gydF4y2Ba

ROS化验gydF4y2Ba

线粒体HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用Amplex测量产量gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba红色过氧化氢试验(A22188;Invitrogen, Burlington, ON)，按照制造商的说明。简单地说，40 μg线粒体部分在50 μL反应缓冲液(125 mM KCl, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl)中稀释gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 2 mM KgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， pH 7.44)测定线粒体呼吸链复合体I (5 mM丙酮酸/苹果酸)或复合体II (5 mM琥珀酸)驱动HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba添加或不添加抑制剂(0.5 μM鱼藤酮，复合体I抑制剂和0.5 μM抗霉素A，复合体III抑制剂)。线粒体HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入含辣根过氧化物酶和Amplex的反应缓冲液50 μL后，测定产率gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba红色的。在545 nm的激发波长和590 nm的发射波长下，使用荧光微孔板阅读器(Tecan Safire, MTX实验室系统公司，维也纳，弗吉尼亚州)进行5分钟的荧光观察。荧光增加的斜率转换为H的速率gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产与标准曲线。所有实验均在25°C下进行。结果用pmol .min表示gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}.mg蛋白质gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

线粒体呼吸链复合体I和IV酶活性gydF4y2Ba

按照既定规程测定组织裂解液中线粒体ETC复合体I和复合体IV活性[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．所有样品在Cary UV-vis分光光度计(Varion, Inc.， Palo Alto, CA)上进行重复分析。gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性gydF4y2Ba

肌肉总超氧化物歧化酶(Mn-SOD和Cu/Zn-SOD)活性通过测量超氧自由基(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)与细胞色素发生竞争反应gydF4y2BacgydF4y2Ba，如上文所述[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在550 nm处记录吸收，在37°C下每15 s观察2 min。一个单位(U)的SOD活性被定义为对细胞色素还原产生50%抑制作用的酶的量gydF4y2BacgydF4y2Ba．总SOD活性以U.mg蛋白为单位表达gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．在另一个试管中，在0.2 M KCN (pH 8.5-9.5)的存在下，在相同的条件下分析相同的样品，KCN是一种有效的细胞质Cu/Zn-SOD抑制剂[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，用于测定线粒体Mn-SOD活性。Cu/Zn-SOD活性近似于从总SOD活性中减去Mn-SOD活性。mg蛋白中Mn-SOD活性和Cu/Zn-SOD活性均有表达gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．过氧化氢酶活性通过测定HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba如前所述[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．过氧化氢酶活性由960 μL K复配测定gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba缓冲液(50 mM + 50 mM EDTA + 0.01% Triton X-100, pH 7.2-7.4)加30 μL肌匀浆。10微升的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(1 M)加入比色皿，倒置混合，启动反应。每隔15秒测定240 nm吸光度，持续2 min。计算过氧化氢酶活性，单位为μmol·mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·毫克蛋白质gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．所有样品在Cary UV-vis分光光度计(Varion, Inc.， Palo Alto, CA)上进行重复分析。gydF4y2Ba

Caspase-3和caspase-9酶活性gydF4y2Ba

Caspase-3和caspase-9酶活性使用荧光蛋白酶测定法分别测定Caspase-3 /CPP32和caspase-9/Mch6 (Biovision, Mountain View, CA)，根据制造商说明。简单地说，这些分析是基于caspase-3对底物DEVD-AFC (AFC: 7-氨基-4-三氟甲基香豆素)和caspase-9对底物LEHD-AFC (AFC: 7-氨基-4-三氟甲基香豆素)的裂解检测。未裂解的DEVD-AFC和LEHD-AFC在gydF4y2BaλgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}= 400 nm时，caspase-3或caspase-9裂解相应底物时，游离AFC发出黄绿色荧光(gydF4y2BaλgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}= 505 nm)，使用荧光显微板阅读器(Tecan Safire, MTX实验室系统公司，维也纳，弗吉尼亚州)进行量化。结果以每毫克细胞质蛋白的原始荧光单位表示。gydF4y2Ba

凋亡细胞死亡检测ELISAgydF4y2Ba

在骨骼肌中定量检测凋亡DNA片段(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)，心脏，原代造血干细胞和原代卫星细胞，通过使用细胞死亡检测ELISA测量胞质单核小体和寡核小体的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba化验(Roche Applied Science, Laval, QC)，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．简单地说，用单克隆抗组蛋白抗体包被孔并与匀浆一起孵育。核小体在10万下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba接着与抗组蛋白抗体结合，接着加入与组蛋白相关的DNA结合的抗DNA过氧化物酶抗体。以ABTS(2,2′- azinos -双[3-乙基苯噻唑-6-磺酸])为底物，用分光光度法测定免疫复合物中过氧化物酶的含量。结果以归一化到微克的细胞浆蛋白的任意OD单位表示。gydF4y2Ba

mtDNA突变的定量gydF4y2Ba

mtDNA突变用抗错单分子方法定量[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．简单地说，骨骼肌(gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba) DNA进行限制性稀释远程PCR，其中每个阳性PCR反应由单个mtDNA分子启动。PCR被设计用于使用高保真Phusion DNA聚合酶扩增整个线粒体基因组(New England Biolabs)。每只动物获得3到9个扩增分子。每个扩增的分子都在当地的核心设施使用条形码Illumina下一代测序方法进行了整体测序。通过将每个分子的序列与标准C57Bl/6J mtDNA序列(GenBank EF108336)进行比较，确定突变。只考虑100%的突变，这保证了伪影的排除[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．通过将突变总数除以每只动物测序的核苷酸数量来计算突变分数。gydF4y2Ba

P53碱基切除修复活性测定gydF4y2Ba

如前所述，采用体外荧光DNA引物p53修复活性测定方法[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，只做了一些小修改。该实验利用双链脱氧低聚物作为引物模板底物，其序列与mtDNA复制起点的前40个核苷酸相同，引物的3 '端在最后三个核苷酸中包含自我设计的错配点突变(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。引物的5 '端和3 '端被化学连接到黑洞淬灭器上gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba-1和6-羧基荧光素(FAM-1™)荧光团，分别(集成DNA技术gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba，多伦多，ON)。本实验的前提是，在线粒体聚合酶γ缺乏校对能力的情况下，引物扩展需要通过3 '→5 '外切酶活性来去除未配对的核苷酸，而随着时间的推移，这种外切酶活性将被检测到荧光增加。20 μL的反应混合物中含有50 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 5 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、1 mM DTT、100 μg/mL BSA、3 ' -end-FAM1™引物模板底物、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各50 μM、WT、PolG-SED、PolG-END骨骼肌40 μg (gydF4y2Ba股四头肌gydF4y2Ba)线粒体提取物在37°C下孵育40分钟，最后使用iCycler IQ™实时PCR检测系统(BioRad, Mississauga, ON)收集数据。为了评估p53作为辅助mtDNA错配点突变修复蛋白的需求，还在(i) p53免疫缺失后的PolG-END骨骼肌线粒体提取物和(ii)添加重组人p53的PolG-SED骨骼肌线粒体提取物中进行了p53修复活性测定(BD Biosciences, Mississauga, ON)。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

各组(WT、PolG-SED、PolG-END、PolG-p53 MKO-SED和PolG-p53 MKO-END小鼠)之间的所有分子指标均使用双尾Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。采用log-rank检验检验组间寿命分布是否有显著性差异。统计学意义建立在agydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。gydF4y2Ba

耐力运动在PolG小鼠中提供表型保护，减少mtDNA突变，并减弱氧化损伤gydF4y2Ba

老化组织显示mtDNA突变的随机积累，可能使呼吸链缺陷和更大的活性氧(ROS)介导的损伤永久存在[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．为了评估运动对线粒体氧还原状态和mtDNA完整性的潜在保护机制，我们分析了同窝小鼠野生型(WT)、久坐型PolG (PolG- sed)和强迫耐力型PolG (PolG- end)小鼠的“终分化”(骨骼肌和心脏)和“增生性”(Lin−Sca-1+ c-Kit +群体富集的造血干和祖细胞、“HSC”和c-met+、卫星细胞、“SC”)区室。如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，现在在本研究中使用的一个独立队列小鼠中证实，运动可以挽救类早衰(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1A)，延长寿命(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1B)， mtDNA突变减少(图S1B)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)在PolG小鼠中。gydF4y2Ba

PolG小鼠的初步特征显示，尽管mtDNA点突变显著积累，但氧化损伤没有增加[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．我们评估了氧化修饰的存在，发现PolG-SED与WT相比，肌肉、心脏和SC匀浆中的蛋白质羰基(PC)和4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)含量没有差异(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1C)。我们推测，由于PolG组织中没有氧化损伤是由于细胞间的变异性，任何一种修饰都将低于整个组织匀浆中的可检测限度[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，我们测量了线粒体部分的氧化损伤——细胞ROS的主要来源。事实上，来自这些组织的线粒体证明了H的大量增加gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba随着PC和4-HNE含量的升高(图;gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba，和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1C, D，和F)。这些观察结果与最近报道的PolG小鼠心脏线粒体PC水平较高的研究一致[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]和增加线粒体HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在体内使用线粒体靶向质谱探针mitb [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．这种更高的氧化损伤也与PolG-SED与WT中超氧化物歧化酶2 (SOD2)和过氧化氢酶含量和活性的降低一致(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1E)。我们假设，较低的抗氧化能力与PolG-SED线粒体中ROS生成的升高的结合加剧了mtDNA突变的积累。与这一观点一致，Vermulst等人报道了转基因动物心脏组织mtDNA突变频率的显著降低，这些转基因动物在线粒体中过度表达人过氧化氢酶(CAT)，一种ROS清除剂，与年龄匹配(28个月大)野生型小鼠相比[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．我们观察到运动使线粒体H正常化gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1D)和氧化损伤标记物(图S1D)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1F)，并增加SOD2和过氧化氢酶的含量和活性(图S1F)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1E)。总之，我们的数据表明，运动减少mtDNA点突变，至少在一定程度上是通过上调细胞抗氧化能力，从而降低ROS水平。gydF4y2Ba

耐力运动减少PolG小鼠端粒侵蚀，下调异常p53信号通路和凋亡病理水平gydF4y2Ba

持续的内在氧化损伤积累与端粒侵蚀有关，端粒侵蚀导致与年龄相关的组织退化[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．与此一致，我们观察到PolG-SED与WT相比，心脏、HSC和SC中的端粒更短(图2)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．端粒缩短导致的基因组不稳定性激活肿瘤抑制蛋白p53介导的衰老/凋亡信号级联[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．因此，PolG-SED的肌肉、心脏和SC中的核p53丰度增强(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)，同时p53响应性衰老基因:p21的表达水平较高gydF4y2Ba^{WAF1gydF4y2Ba}, p16gydF4y2Ba^{INK4AgydF4y2Ba}，和GADD45B(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1G) vs. WT. PolG小鼠线粒体功能障碍与病理性系统性凋亡相关[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，与这些观察结果一致，我们发现了更高的DNA碎片(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和caspase-3/9活动(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2A和B)在PolG-SED小鼠中。有趣的是，运动消除了端粒缩短(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)，降低p53核积累(图;gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)，规范化p53响应性衰老基因的表达(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1G)，并降低PolG-END细胞的病理凋亡水平(图S1G)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2A及B)。gydF4y2Ba

耐力运动通过降低抑制PGC-1α的核p53来缓解线粒体功能障碍gydF4y2Ba

线粒体诱导的氧化应激和端粒侵蚀的因果作用，继发于mtDNA突变，表明p53激活和线粒体功能障碍之间存在直接联系[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．增加PGC-1α(一种有效的线粒体生物发生调节因子)的表达，正调控抗氧化剂的表达[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]并被吹捧可以减轻与衰老相关的肌肉减少症和代谢功能障碍[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．这促使我们研究p53介导的衰老信号的激活是否会减弱pgc -1α-触发的基因编程。我们进行了硅启动子分析，确定了PGC-1α启动子中假定的p53结合元件。然后将这些启动子区域克隆到pGL4荧光素酶报告载体中，并转染到gydF4y2Bap53gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba而且gydF4y2Bap53gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠胚胎成纤维细胞。PGC-1α-pGL4报告细胞活性明显被抑制gydF4y2Bap53gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba相对于gydF4y2Bap53gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}MEFs(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2C)。这些结果与最近的一项研究一致，即核p53可直接抑制PGC-1α的表达，促进线粒体功能障碍[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．为了进一步验证我们的假设，我们接下来进行了抗p53染色质免疫沉淀试验，结果显示，在PolG-SED小鼠和WT小鼠的PGC-1α启动子上，核p53的物理富集(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．总之，这些数据表明ros诱导的细胞损伤促进了p53的核积累，从而激活p53响应性衰老基因，同时抑制PGC-1α的促代谢活性。gydF4y2Ba

对PolG-SED肌肉、心脏、HSC和SC的qPCR分析证实，PGC-1α表达较低，其代谢网络受到强烈抑制，包括氧化磷酸化、线粒体功能、糖异生和脂肪酸代谢(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba，和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2D-G和表S1)。此外，PolG-SED小鼠组织和干细胞减少了mtDNA拷贝数(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3A)，降低线粒体复合体I和复合体IV酶活性(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3B)，线粒体电子传递链亚基蛋白含量降低(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3C-I)，肿胀、多形性、超大的线粒体堆积(图S3C-I)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．耐力运动降低了p53与PGC-1α启动子的结合(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，这种效应伴随着mtDNA拷贝数的维持，PGC-1α及其下游代谢网络表达的增加，线粒体氧化能力的增强，以及PolG-END中线粒体结构完整性的恢复(图。gydF4y2Ba2汉英gydF4y2Ba，和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图s2a - g、图S3A-I和表S1)。这些观察结果共同表明，在PolG-SED小鼠中积累mtDNA突变导致ROS生成的增加，(i)促进线粒体功能障碍和端粒损伤，(ii)随后触发p53调控的衰老途径，从而通过凋亡增强体细胞和干细胞的损失。相反，运动减少mtDNA突变，维持细胞能量和氧化还原稳态，从而避免端粒侵蚀，最终抑制PolG小鼠加速全身衰老的特征[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

耐力运动介导的mtDNA突变修复依赖于p53gydF4y2Ba

POLG1是唯一的线粒体聚合酶，通过其3 '→5 '外切酶活性对mtDNA复制和修复至关重要[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．由于运动减少了缺乏POLG1校对能力的PolG小鼠的mtDNA突变，这提出了一种有趣的可能性，即运动招募了一个独立于POLG1的mtDNA修复途径[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．我们发现，尽管在PolG-SED中p53核丰度升高，但所有组的肌肉、心脏和SC匀浆中的p53总含量没有改变(补充文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3J)。这表明p53的基础库在细胞内维持，p53在不同亚细胞区室之间的分布依赖于细胞应激环境[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．体外研究表明，在响应细胞内和细胞外的损伤，如ROS, p53易位到线粒体，在那里它与mtDNA和POLG1相互作用[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．对p53的生化分析揭示了一种固有的3’→5’外切酶活性，通过对受损的mtDNA进行碱基切除修复，帮助p53促进和维持线粒体基因组的稳定性[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．迄今为止，线粒体p53在衰老过程中的作用仍然未知。综上所述，这些观察结果使我们推测，在容易出错的POLG1存在的情况下，线粒体p53将在PolG小鼠中作为mtDNA复制机制的辅助保真度增强组件发挥作用。gydF4y2Ba

为了验证我们的假设，我们首先评估了p53在WT小鼠骨骼肌中的亚线粒体定位。骨骼肌线粒体的亚分化表明，线粒体p53主要定位于线粒体基质(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．接下来，我们测量了实验组中p53的线粒体丰度。与PolG-SED不同，在PolG-END小鼠中，p53优先驻留在肌肉和心脏的线粒体中，而不是细胞核中(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．为了确定线粒体ROS水平是否调节p53区隔化，我们用鱼藤酮(一种已知能增加线粒体ROS的复合物I抑制剂)处理原代成纤维细胞，并观察到线粒体p53含量在较低剂量下迅速增加，而不伴随核p53的增加(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4A)。有趣的是，随着鱼藤酮浓度的增加，我们测量到核p53丰度的增加(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4A)及其下游靶标的表达(p16 .gydF4y2Ba^{INK4AgydF4y2Ba}p21和gydF4y2Ba^{WAF1gydF4y2Ba}；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4B)，伴随着线粒体p53含量的降低(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4A)， mtDNA拷贝号(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4C)。核p53的增加与PGC-1α mRNA表达的减少平行(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5A)，进一步支持p53对PGC-1α的抑制作用。此外，在ROS清除剂预处理的成纤维细胞中，鱼藤酮诱导的核p53含量上调被减弱，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰半胱氨酸(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5B)，与更高的PGC-1α mRNA表达(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5C)。因此，p53优先穿梭于线粒体以响应生理ROS水平，这取消了PGC-1α的负调控，因为p53驻留在细胞核中。接下来，我们试图阐明线粒体p53是否与线粒体基质中的POLG1和Tfam相互作用。我们进行免疫共沉淀反应，发现线粒体p53与mtDNA上的POLG1和Tfam复合物形成复合物(图。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)．与PolG-SED和WT相比，PolG-END在mtDNA上的p53-POLG1-Tfam复合物更高。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)．这些观察结果与最近的一项研究一致，该研究报道了WT小鼠急性耐力运动后骨骼肌中p53转位到线粒体并随后形成p53- tfam - mtdna复合物[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．这些结果使我们得出结论，p53优先亚细胞定位于线粒体而非核室是一种“普遍的”运动诱导现象，并可能在调节耐力运动对改善线粒体含量/功能和改善功能障碍的有益作用中发挥作用。gydF4y2Ba

由于PolG-SED和PolG-END小鼠都有缺陷的POLG1校对能力，我们认为在PolG-END小鼠中总mtDNA突变负担的减少。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)是由线粒体p53水平介导的，以应对耐力运动。因此，我们试图评估线粒体p53是否能够修复mtDNA突变，而不依赖于POLG1的校对能力。基于荧光的体外DNA引物延伸-突变修复实验显示，通过人工添加错配点突变，用体外肌肉线粒体提取物PolG-END和PolG-SED培养双链寡核苷酸的有效修复(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在p53免疫缺失时，PolG-END线粒体无法修复这些突变(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，而重组p53的加入增加了PolG-SED线粒体突变修复效率(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6A)。显然，在突变小鼠中存在缺陷POLG1时，线粒体p53在维持mtDNA完整性方面起着至关重要的作用。gydF4y2Ba

然而，为了最终将因果关系归结于线粒体p53在耐力运动中介导mtDNA修复，需要一个“双基因突变小鼠模型”，在p53过表达或敲低的背景下，可以评估mtDNA突变负担的变化。产生p53过表达的PolG小鼠是不可行的，因为先前的工作表明，用p53过活跃等位基因改造的小鼠本身显示出干细胞耗尽和过早衰老的表型[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．另一方面，p53基因敲除小鼠会过早死于癌症[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]并且不能有效地与杂合子繁殖gydF4y2BaPolgAgydF4y2Ba^{+ / D257AgydF4y2Ba}因此不能与PolG小鼠杂交来有效地研究运动的影响。因此，我们创造了一种新的肌肉特异性p53缺失的转基因突变小鼠(PolG-p53 MKO)。在基础水平上，与PolG-SED小鼠相比，PolG-p53 MKO-SED小鼠表现出加速的早衰表型和肌肉中mtDNA随机突变的显著积累(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6B)。令我们惊讶的是，耐力运动不仅不能减少mtDNA点突变，而且也不能挽救PolG-p53 MKO小鼠的早老性衰老、肌肉减少症、运动不耐受、线粒体形态异常以及线粒体含量和功能(如mtDNA拷贝数、线粒体电子传递链蛋白含量和骨骼肌COX活性)的缺陷(图)。gydF4y2Ba4 c ggydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6B-E)。这表明运动介导的体内mtDNA突变修复依赖于线粒体p53辅助修复能力。此外，与PolG-END不同，PolG-p53 MKO的线粒体提取物在引物延伸-突变修复试验中未能在体外修复突变(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6F)。因此，运动诱导的mtDNA稳定性的维持取决于线粒体定位的p53，对于携带已知引起病理的POLG1外切酶结构域突变的症状前患者来说，这是一种可行的治疗方法[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在这里，我们发现运动通过pgc -1α介导的表达网络促进线粒体氧化能力和细胞氧化还原动力学，从而防止氧化损伤的积累，消除遗传毒性损伤，并抑制突变小鼠的凋亡。有趣的是，压力介导的肿瘤抑制蛋白p53的亚细胞定位决定了它的促或抗生存功能，并且似乎是运动介导的mtDNA修复和线粒体生物发生所不可或缺的。这里总结的工作开辟了可行的癌症生物学研究途径，其中线粒体功能障碍和基因组不稳定已被牵连[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．观察运动诱导的线粒体靶向p53是否可能代表一种治疗干预衰老相关病理，如胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病，这将具有潜在的临床兴趣，这些疾病表现为端粒缩短与线粒体功能障碍[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．的确，虽然运动和积极的生活方式是降低糖尿病、胰岛素抵抗和心血管疾病发病率和致病性的最主要疗法[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，这些有望重现运动某些效果的治疗方式值得进一步关注。端粒- p53 - pgc -1α轴为端粒侵蚀和线粒体功能障碍如何调节组织和干细胞区室的系统性衰老提供了分子基础。了解促进p53线粒体定位的上游信号级联和翻译后修饰可能会产生药物类似物，新的治疗策略来对抗线粒体基因组衰退，以及年龄相关病理中的细胞衰老。gydF4y2Ba

• 2021年3月30日gydF4y2Ba

  对本文的更正已发表:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1186/s13395-021-00264-7gydF4y2Ba

4-HNE:gydF4y2Ba

4-hydroxy-2-nonenalgydF4y2Ba

唉:gydF4y2Ba

5-aminolevulinate合酶gydF4y2Ba

腺苷三磷酸酶6:gydF4y2Ba

复杂V亚基atp酶6gydF4y2Ba

COX-I:gydF4y2Ba

细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba氧化酶subunit-IgydF4y2Ba

COX-II:gydF4y2Ba

细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba氧化酶subunit-IIgydF4y2Ba

COX-IV:gydF4y2Ba

细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba氧化酶subunit-IVgydF4y2Ba

结束:gydF4y2Ba

耐力运动gydF4y2Ba

犯错α:gydF4y2Ba

雌激素相关受体gydF4y2Ba

GADD45B:gydF4y2Ba

生长停滞和dna损伤诱发，βgydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

过氧化氢gydF4y2Ba

HSC:gydF4y2Ba

造血干细胞和祖细胞gydF4y2Ba

MEF:gydF4y2Ba

小鼠胚胎成纤维细胞gydF4y2Ba

营销:gydF4y2Ba

阳性基因敲除gydF4y2Ba

mtDNA:gydF4y2Ba

线粒体DNAgydF4y2Ba

ND1:gydF4y2Ba

复合物I NADH脱氢酶亚基1gydF4y2Ba

NRF1:gydF4y2Ba

核呼吸因子1gydF4y2Ba

p16gydF4y2Ba^{INK4AgydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

周期蛋白依赖性激酶抑制剂2AgydF4y2Ba

p21gydF4y2Ba^{WAF1gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

周期蛋白依赖性激酶抑制剂1AgydF4y2Ba

p53:gydF4y2Ba

肿瘤抑制蛋白53gydF4y2Ba

PC:gydF4y2Ba

蛋白质羰基gydF4y2Ba

PGC-1α:gydF4y2Ba

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1 αgydF4y2Ba

PolG:gydF4y2Ba

聚合酶突变小鼠gydF4y2Ba

POLG1:gydF4y2Ba

线粒体聚合酶gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SC:gydF4y2Ba

卫星细胞gydF4y2Ba

对话:gydF4y2Ba

久坐不动的gydF4y2Ba

SOD1:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶1(胞质;铜/ Zn-SOD)gydF4y2Ba

SOD2:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶2(线粒体;Mn-SOD)gydF4y2Ba

TFAM:gydF4y2Ba

线粒体转录因子AgydF4y2Ba

VDAC:gydF4y2Ba

电压依赖性阴离子通道gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型老鼠gydF4y2Ba

我们要感谢已故的Suzanne Southward女士(麦克马斯特大学)在酶测定方面的协助，以及William C. Copeland博士(美国国立卫生研究院)对POLG1抗体的捐赠。这项工作得到了加拿大健康研究所(CIHR)的资助，Warren Lammert先生及其家人对m.a.t.a. Safdar的捐赠由Banting Fellowship (CIHR)和美国老龄化研究联合会和埃里森医学基金会(EMF)奖学金资助。A. Saleem获加拿大自然科学与工程研究理事会博士后奖学金资助。K.K.获得了联合线粒体疾病基金会、美国国立卫生研究院(AG019787)和EMF高级奖学金的支持。作者声明没有竞争利益和经济利益。tap获得了Polg的7126040项美国专利gydF4y2Ba^{D257AgydF4y2Ba}小鼠模型。T.A.P.是LifeGen Technologies(专注于营养基因组学)的部分所有者，也是如新企业的科学顾问委员会成员。M.A.T.是exokine Corporation的创始人、总裁兼首席执行官，也是其科学顾问委员会的成员。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 麦克马斯特大学运动学系，汉密尔顿，ON, L8N 3Z5，加拿大gydF4y2Ba

   阿德尔·萨夫达尔，迈克尔·德·利西奥，亚当·p·w·约翰斯顿和詹尼·帕里斯gydF4y2Ba

2. 麦克马斯特大学儿科系，汉密尔顿，ON, L8N 3Z5，加拿大gydF4y2Ba

   Adeel Safdar, Ayesha Saleem, Yu Kitaoka, Sandeep Raha, Bart P. Hettinga和Mark A. TarnopolskygydF4y2Ba

3. 麦克马斯特大学医学系，汉密尔顿，ON, L8N 3Z5，加拿大gydF4y2Ba

   阿德尔·萨夫达尔，马哈茂德·阿赫塔尔，马克·a·塔尔诺波尔斯基gydF4y2Ba

4. 麦克马斯特大学医学系，汉密尔顿，ON, L8N 3Z5，加拿大gydF4y2Ba

   Imtiaz A. Samjoo和Daniel I. OgborngydF4y2Ba

5. 麦克马斯特大学医学物理与应用辐射科学系，汉密尔顿，ON, L8N 3Z5，加拿大gydF4y2Ba

   詹尼·麻省理工gydF4y2Ba

6. 东北大学，美国马萨诸塞州波士顿02115gydF4y2Ba

   Konstantin Khrapko & Yevgenya KratysberggydF4y2Ba

7. 巴克老化研究所，诺瓦托，CA, 94945，美国gydF4y2Ba

   詹姆斯·m·弗林gydF4y2Ba

8. 英属哥伦比亚大学奥卡那根分校健康与运动科学学院，加拿大BC省基洛纳，V1V 1V7gydF4y2Ba

   乔纳森·p·利特尔gydF4y2Ba

9. 阿拉巴马大学心血管疾病科，伯明翰，35294，美国gydF4y2Ba

   格伦·c·罗gydF4y2Ba

10. 宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院，费城，宾夕法尼亚州，19104，美国gydF4y2Ba

    Zoltan AranygydF4y2Ba

11. 威斯康星大学遗传学系，麦迪逊，威斯康星州，53706，美国gydF4y2Ba

    托马斯·a·普罗拉gydF4y2Ba

12. 威斯康辛大学医学遗传学系，麦迪逊，WI, 53706，美国gydF4y2Ba

    托马斯·a·普罗拉gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaMark A. TarnopolskygydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

AS和MAT设计了研究;AS、KK、JMF、AS、MDL、APWJ、YK、IAS、YK、DIO、JPL、SR、GP、MA、BPH、GCR进行研究;KK、GP、ZA、TAP、MAT贡献了新的试剂/分析工具;AS、YK和BPH分析了数据;阿斯撰写了手稿。所有作者都参与了稿件的起草和修改，并通过了最终稿。gydF4y2Ba

这篇文章已被撤回。详情请参见撤稿通知:https://doi.org/10.1186/s13395-021-00264-7”gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba