2022年KT Jeang逆转录病毒学奖:Florence margotin - goguet

Florence margotin - goguet在巴黎的皮埃尔和玛丽居里大学学习细胞和分子生物学。1989年至1993年，作为一名博士生，她在巴黎附近萨克雷(Saclay) André Sentenac指导的实验室工作。森特纳克的实验室是国际公认的转录研究领域使用酿酒酵母作为一个模式生物。具体而言，该实验室专注于分离转录机制的基本成分以及阐明转录激活的机制。Florence最初在Geneviève Dujardin博士和André Sentenac博士的指导下工作。她参与发现了tat结合因子(TBP)是启动RNA聚合酶3介导的转录所必需的，因此它不仅是当时认为的RNA聚合酶2的辅助因子[1］．后来，TBP被发现是基因转录的一个重要因素，而与所涉及的RNA聚合酶的类型无关。

在她的博士学习期间，弗洛伦斯还与Anne-Françoise Burnol合作。他们共同表明，TFIIIC，一种将RNA聚合酶3募集到基因所需的多亚基复合物，参与了染色质对转录抑制的缓解[2］．这项工作是在Geneviève Almouzni和Marcel Méchali的专家指导下进行的，是Florence第一次介绍染色质环境中基因表达的调控。总之，在她职业生涯的开始，弗洛伦斯经历了生物化学家的共同命运:长时间在寒冷的房间里，将蛋白质提取物装载到各种类型的色谱柱上，收获大量的蛋白质馏分，随后在体外转录实验中监测其活性。在此期间，她有机会结识了诸如Sylvie Camier、Geneviève Dujardin和Anne-Françoise Burnol等基础研究爱好者。这些研究人员无疑影响了弗洛伦斯对研究实践的看法:假设驱动的研究和精心设计的实验会带来很多乐趣。在此期间，弗洛伦斯也遇到了她未来的丈夫，在获得博士学位后不久，他们都加入了法属圭亚那卡enne巴斯德研究所的分子寄生虫学实验室。在这个实验室里，针对疟疾的候选疫苗被监测。在这段时间里，弗洛伦斯进行了一种完全不同的研究。在法属圭亚那的这段时间里，她在实验室内外都有很多发现，她和她的丈夫非常喜欢乘独木舟沿着河流漂流，发现美丽的热带雨林。这是她多次环球旅行的第一次，也是她在研究之外的第二爱好。

1994年回到巴黎，弗洛伦斯希望回到基础研究领域。她一直坚信，基础研究是应用科学的沃土，尤其是在医学领域。因此，她选择研究艾滋病的病原HIV-1和HIV-2病毒，以及相关的猿类病毒(SIV)。她获得了SIDACTION(一个资助广泛艾滋病研究项目的法国协会)的博士后奖学金，并加入了科钦研究所(Institut Cochin)由理查德·贝纳鲁斯(Richard Benarous)领导的实验室。该研究所提供了一个令人振奋的环境，因为几个小组正在研究艾滋病毒生物学的各个方面。理查德·贝纳鲁斯(Richard Benarous)分享了他对自己开发的一个项目的热情，该项目旨在识别一组HIV蛋白的宿主细胞伙伴，以阐明它们的作用机制。所谓的“双混合筛选”策略特别适合这种方法，在法国，Richard的实验室是发展这种方法的先驱，由Fields和Song [3.］．弗洛伦斯被指派寻找HIV-1 Vpu蛋白的伴侣，作为一个研究项目。她记得她在细胞培养室的第一步，因为她以前从未培养过细胞!她还记得团队之间关于病毒学领域双杂交屏幕相关性(或者说是缺乏相关性)的激烈讨论!

长期以来，研究表明HIV-1 Vpu促进CD4细胞受体的降解，尽管其潜在机制仍不清楚[4］．Florence进行的双氢筛选产生了几种vpu相互作用的候选物，包括爪蟾βTrCP蛋白的人类同源物。翻阅附近实验室图书馆的不同论文，Florence发现人类βTrCP与泛素连接酶的亚基共享一个序列基序，该亚基涉及蛋白质靶向泛素介导的蛋白水解途径[5］．此外，1993年，Martin Scheffner的开创性工作发现，乳头瘤病毒E6蛋白利用泛素连接酶诱导p53肿瘤抑制蛋白的降解[6］．综上所述，这些发现使Florence推测Vpu连接CD4和βTrCP通过泛素介导的途径促进其降解。在大量的生化实验证明了Vpu/CD4/βTrCP三元复合物的存在之后，这一假设在与美国国立卫生研究院克劳斯·斯特雷贝尔(Klaus Strebel)团队的合作下得到了完全证实。“Vpu-βTrCP的故事”确实提供了泛素连接酶被HIV辅助蛋白劫持的第一个例子[7］．随后发现，劫持泛素连接酶是几乎所有HIV辅助蛋白都采用的一种方法，它被病毒广泛用于优雅地摆脱对其生命周期有害的宿主因子。在这种机制中，病毒蛋白将宿主泛素连接酶与不是其天然底物的特定宿主蛋白连接起来。随后，HIV辅助蛋白对泛素连接酶的劫持成为弗洛伦斯最喜欢的研究主题。

βTrCP是第一个被发现的F-box蛋白家族的人类成员，该家族是Cullin 1泛素连接酶复合物的适配器。这个家族的每个成员都有自己特定的目标。在Richard Benarous的宝贵指导下，Florence帮助鉴定了βTrCP选择用于后续降解的第一批天然底物:IκBα、βCatenin、ATF4，分别参与癌症、炎症和应激反应[8，9，10］．提示是在这些细胞底物中存在类似于HIV-1 Vpu中β trcp结合基序的序列，即“DSGXXS基序”(及其衍生物)。这种线性基序的存在成为βTrCP结合的一个很好的指标，导致数百个βTrCP宿主靶点的鉴定。基于这个例子，Florence喜欢指出病毒学的发现如何有益于与不同疾病相关的其他领域。

1998年，Florence在INSERM(法国国家医学研究所)获得了永久职位。2000年，她与丈夫和小女儿搬到帕洛阿尔托，加入斯坦福大学彼得·杰克逊(Peter Jackson)的实验室，研究细胞周期领域。在获得永久职位后出国进行博士后培训并不常见，但这是如此美妙:获得职位没有压力!但是没有压力并不意味着什么都没有发生。在两年半的时间里，弗洛伦斯在彼得·杰克逊的伟大指导下发现了一种进入有丝分裂的新机制。她还在美丽的国家公园旅行中发现了美国西海岸，并在斯坦福医院生下了她的第二个孩子。她的研究项目是阐明有丝分裂抑制剂Emi1的降解机制，这是进入有丝分裂的关键步骤。当弗洛伦斯离开法国时，她没有预料到她会在Emi1蛋白序列中发现β trcp结合基序，但这一发现确实有帮助!βTrCP很快被鉴定为Emi1的泛素连接酶受体[11，12］．

2005年，弗洛伦斯得到了她自己的实验室，这要归功于两笔专门用于初级研究人员的赠款，一笔来自INSERM，名为“Avenir”(法语“未来”的字面意思)，另一笔来自巴黎市政厅。她希望利用她以前工作中获得的知识来研究HIV辅助蛋白对细胞周期进程的干扰。Vpr是HIV病毒的一种辅助蛋白，自1995年以来已被发现可导致细胞周期阻滞，特别是在G2期(文献综述[13])。Florence决定解决关于vpr介导的细胞周期阻滞的两个悬而未决的问题:潜在机制和病毒周期的意义。很快，凯瑟琳·特蕾西(Catherine Transy)加入了她，两人共同指导团队，直到2010年。弗洛伦斯和凯瑟琳对病毒蛋白劫持泛素连接酶的机制有共同的兴趣。如前文所述，Florence发现vpu介导的CD4降解依赖于其通过与βTrCP适配器相互作用而吸收Cullin 1泛素连接酶的能力，而Catherine则表明乙肝病毒在体内感染需要HBx病毒蛋白与Cullin 4泛素连接酶的核心成分DDB1直接相互作用[14］．

一方面，该团队提供了Vpu和Vpr病毒辅助蛋白可以与两种不同的泛素连接酶相互作用的证据，它们要么是这些酶的适配器，要么是这些酶的底物[15，16］．另一方面，研究小组发现了Vpr诱导的细胞周期阻滞中缺失的一环:Vpr和DCAF1 (Cullin 4泛素连接酶的适配器)之间的直接相互作用[17］．到目前为止，只有vpr介导的细胞周期阻滞的下游步骤被描述。

弗洛伦斯和凯瑟琳都相信，彻底的科学监测往往是有益的。他们最初对Landau的小组报告感兴趣，Vpr促进了参与DNA修复的两种尿嘧啶DNA-糖苷酶的降解，并与Cullin 1和Cullin 4泛素连接酶复合物相互作用[18］．这是否是Vpr可能劫持Cullin 1或Cullin 4泛素连接酶以促进有丝分裂进入所需宿主蛋白的降解的线索?另一个提示来自他们的日常习惯，即仔细审查任何关于Cullin-based泛素连接酶的新出版物。原来，在最近描述的Cullin 4连接酶适配器的DCAF家族中[19，20.](其他引用于参考文献。[17])， DCAF1早在1994年就被Zhao等人分离为vpr结合蛋白[21] !团队中的每个人都卷起袖子，DCAF1在vpr介导的细胞周期阻滞中发挥关键作用的证据迅速积累起来。

该研究结果发表在《细胞周期》杂志上，此前其他期刊的编辑在任何审查程序之前都拒绝了该手稿。当时，《细胞周期》(Cell Cycle)是一份最近出版的杂志，刊登了快速审阅“热门”手稿的广告。事实证明，弗洛伦斯的论文确实非常热门，因为同年发表了五项类似的研究[13］．然而，在这些已发表的研究中，只有《细胞周期》发表了Vpx是否与DCAF1相互作用，Vpx是一种只在HIV-2和猿类病毒中发现的Vpx相关蛋白。在这种情况下，这是有趣的:Vpx，与Vpr相比，对细胞周期没有影响，但被认为在静息骨髓细胞的生产性感染中起着重要作用。因此，Florence和Catherine提出假设，Vpr和Vpx在进化过程中保持了对DCAF1泛素连接酶的使用，但在降解目标宿主蛋白的选择上存在分歧，从而保证了不同的生物活性。Skowronski和Stevenson的团队进一步证明了DCAF1对Vpx活性的依赖性，然后由Florence的团队与Gianfranco Pancino的团队合作[22，23，24］．Florence很喜欢讲这个“细胞周期的故事”:期刊的影响因子很小，但在随后的激烈竞争中具有很高的影响力!尽管如此，该小组在获得认可和资金方面遇到了一些困难;期刊影响因子的压路机是有害的!幸运的是，法国的两个艾滋病机构SIDACTION和ANRS一直在提供财政支持。

目前的观点是(现在仍然是)，在病毒与其宿主之间的所谓军备竞赛期间，后者产生了内源性因素，有时非常有力地限制了生产性感染。在这种选择压力下，病毒反过来进化出对抗措施来逃避宿主的限制。在HIV领域，Malim的团队是识别这种宿主-病毒关系的先驱:Vif辅助蛋白以APOBEC3G为目标进行降解，从而逃脱了APOBEC3G介导的病毒基因组编辑[25，26］．对病毒提供先天防御的宿主蛋白质被称为“限制因子”[27］．

如前所述，Vpr/Vpx领域的竞争变得非常激烈，有几个团队致力于识别Vpr和Vpx宿主目标，预计这些目标将成为新的限制因素。

换句话说，Vpr/Vpx的寻宝活动已经开始了!弗洛伦斯记得冷泉港实验室会议期间在酒吧里的讨论，以获得骨髓限制因子(被Vpx降解)或G2抑制靶标(被Vpr降解)的线索。

当时，“Tap-Tag”(串联亲和纯化)被认为是识别给定(病毒)蛋白的细胞相互作用伙伴的选择方法。使用这种方法，她的团队成功地拉下了Vpr劫持的E3泛素连接酶的所有亚基，但没有发现令人信服的宿主底物。

与此同时，在2009年，凯瑟琳提出了“dNTP假说”:如果Vpx可以通过增加脱氧核苷酸库来增强巨噬细胞感染呢?

再次，调查文献，在这种情况下相当古老，是鼓舞人心的:它表明在静止的髓细胞- Vpx的作用-脱氧核苷酸(dNTP)的短缺是HIV-1感染的限制因素[28，29］．另一方面，Cimarelli团队的出色工作表明，将含有SIV Vpx的病毒伪颗粒添加到细胞培养基中，可强烈增强HIV-1对树突细胞的感染[30.］．考虑到HIV-1基因组中缺乏Vpx基因，这是一个意外而有趣的观察结果。弗洛伦斯的团队进行的实验很快证实，当外源提供dNTPs和Vpx时，它们具有非常相似的效果，即受感染细胞的数量和反转录步骤的速度以及作用于不同病毒的能力显著增加。

该研究正在进行中，以证明Vpx增加巨噬细胞中dNTPs的内源性池，这要感谢比克·金的专业知识。然而，当Benkirane和Skowronski的小组在2011年的冷泉港研讨会上报告发现SAMHD1是Vpx降解的靶细胞限制因子时，研究小组大吃一惊[31，32］．研究小组随后立即注意到SAMHD1显示了一个HD结构域，这表明dNTPase活性支持他们最初的假设。同年，两项研究证实了SAMHD1在体外的dNTPase活性[33，34］．弗洛伦斯的团队和金、本基拉内、兰道和卡纳德的团队急于进行体内实验。他们共同表明，SAMHD1耗尽dNTP池，从而抑制巨噬细胞中病毒DNA的合成，vpx介导的SAMHD1降解，增加了核苷酸池，取消了限制[35］．这项开创性的工作在HIV社区受到了广泛的关注:SAMHD1限制除HIV以外的其他病毒/病原体(一些通过DNA中间体在非分裂细胞中复制)，并通过多种机制(包括调节dNTP水平的能力)在致癌过程中发挥作用[36］．后来，Florence提出了SAMHD1可能是干扰素早期抗病毒作用的原因。然而，弗洛伦斯的团队和马里姆的团队在逆转录病毒学中同时表明，情况并非如此[37，38］．

2012年，Florence和Claudine Pique合并了他们的团队，在科钦研究所创建了一个新的研究部门，命名为“逆转录病毒、感染和潜伏期”。该团队专注于两种人类致病性逆转录病毒，HIV和HTLV-1，后者是唯一与癌症发展相关的人类逆转录病毒，特别是成人t细胞白血病。

弗洛伦斯的团队继续寻找新的限制因素。当时，弗洛伦斯认为Vpx的作用几乎被完全理解。与此形成鲜明对比的是，Vpr在病毒感染中的真正功能以及Vpr介导的细胞周期阻滞的确切机制仍有待阐明:Vpr靶向降解的相关宿主蛋白仍然缺失。因此，Florence并不想放弃Vpr，并牢记一个特定的病毒蛋白可能被赋予针对多个宿主蛋白的能力，从而获得对病毒有益的不同功能。

然而，从大规模免疫沉淀和双杂交筛选中分离出的潜在Vpr宿主靶点均不符合预期标准(如其耗竭引发G2阻滞，并在巨噬细胞中为病毒提供优势)。因此，研究小组转向了另一种被称为SILAC(细胞培养中氨基酸稳定同位素标记)的方法。这种方法的目的是识别蛋白质的水平显着变化，以响应特定的处理，这里与含有Vpr的病毒伪颗粒孵育。用含有vpx的病毒伪粒子治疗是为了解决方法的敏感性和特异性。结果令人鼓舞，因为SAMHD1不仅被回收，而且显示出最佳的下降率[39］．

然而，与Lehner团队最近发表的观察结果相比，SILAC产生的vpr诱导降解的候选物非常少[40］．尽管如此，Florence的团队确定HLTF DNA转位酶是vpr诱导降解的直接靶点，Skowronski的团队同时报道了这一结果[41，42］．有点令人失望的是，HLTF的下调并没有像预期的那样导致G2在这次vp活动中的直接参与者被捕。此后，一些细胞蛋白被Vpr降解，其中一些参与Vpr介导的G2阻滞，尽管总体情况仍不清楚[40，43，44］．

虽然Vpr让所有人都非常头疼，但Vpx再次带来了惊喜。弗洛伦斯实验室的一名研究生，Ghina Chougui，因为疼痛的手肌腱炎而免于工作，被分配到一个项目，根据特定的标准对实验室产生的大量SILAC数据进行重新分类。结果强调，宿主蛋白FAM208A(后来重命名为TASOR)的排名仅次于SAMHD1。这种蛋白质之前在McKnight团队设计的用于识别新的HIV-1限制因子的筛选中被提取[45］．弗洛伦斯立即假设TASOR是一种被Vpx抵消的限制因子:TASOR结合了抗病毒活性和被一种已知使用这种机制对抗SAMHD1限制的蛋白质靶向降解的特性。研究小组很容易就证实了vpx介导的TASOR降解，但缺乏关于它可能给病毒带来的优势的线索。2015年，由TASOR、MPP8和周围亲和素组成的HUSH复合物被Lehner的小组报道，在潜伏期模型中介导HIV-1原病毒的表观遗传沉默，以及细胞基因和反转录转座子的沉默，揭开了面纱的一角[46］．利用这种HIV-1潜伏期模型，Florence的团队表明Vpx以及基因相关的SIV蛋白能够通过HUSH降解重新激活潜伏病毒[39］．由于Lucie Etienne的专业知识，系统发育和进化分析强调了HUSH的拮抗作用是慢病毒物种特异性的，这是限制因子和病毒拮抗剂之间典型的分子军备竞赛，并确定了潜在的“遗传冲突”特征，如HUSH的多个异构体[39］．总的来说，在宿主方面，HUSH已经成为对抗病原体的先天反应的关键角色，而在病毒方面，令人惊讶的是，Vpx在病毒逃离宿主限制中的作用并不局限于休息细胞。该团队在该领域再次经历了激烈的竞争，因为几乎在同一时间，另外两个小组发表了关于HUSH是慢病毒蛋白的新靶点的类似结论[40，47］．

今天，该团队正在研究hush介导的限制机制。实验室博士后Roy Matkovic正在领导这个项目。该团队最近发现，HUSH将hiv衍生转基因上抑制性表观遗传标记的沉积与新生转录本的识别和降解联系起来，首次在哺乳动物细胞中描述了一种同时参与RNA降解和表观遗传沉默的抑制复合体[48］．目前正在探索另一个研究轴:HUSH是否与HIV携带者所谓的储库细胞中的病毒持久性有关[49] ?该项目是由最近加入Florence团队的Véronique Avettand-Fenoel领导的几位医生和医学病毒学家组成的小组合作开展的。最后但并非最不重要的是，佛罗伦萨不禁想知道，对Vpr和Vpx目标的寻宝活动是否已经结束，还是才刚刚开始……让我们看看!