HIV潜伏期模型中的先天免疫调节gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

先天免疫和1型干扰素(IFN)防御对于CD4 + T细胞内HIV感染的早期控制至关重要。尽管有这些防御，一些急性感染的细胞沉默病毒转录成为潜伏感染并在体内形成HIV库。潜伏感染的细胞通过抗逆转录病毒治疗(ART)持续存在，是艾滋病毒治愈的主要障碍。在这里，我们评估了多种HIV潜伏期T细胞模型中的先天免疫和IFN反应，包括已建立的潜伏细胞系、潜伏感染报告病毒的Jurkat细胞和病毒学抑制的原发CD4 + T细胞模型。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现，虽然潜伏感染的T细胞系具有功能性RNA传感和IFN信号通路，但它们无法诱导特异性干扰素刺激基因(ISGs)来响应先天免疫激活或1型IFN治疗。潜伏感染荧光报告病毒HIV的Jurkat细胞同样表现出对1型IFN的减弱反应。利用大体积和单细胞RNA测序，我们应用了功能基因组学方法，定义了潜伏性HIV感染中ISG的表达动态，包括HIV感染的art抑制的原发CD4 + T细胞。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的观察结果表明，HIV潜伏期和病毒抑制在特异性ISG诱导中都与细胞内在缺陷有关。我们确定了一组isg作为潜伏期限制因子，其表达和功能可能会减轻潜伏性HIV感染的建立。gydF4y2Ba

目前全世界有3700多万人感染艾滋病毒，但没有治愈性治疗方法[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。抗逆转录病毒疗法(ART)有效地阻断了病毒在生产性感染细胞中的复制，但不影响潜伏细胞的储存库，潜伏细胞含有转录沉默但能够恢复病毒生产的原病毒。在停止抗逆转录病毒治疗后，这个病毒库负责病毒反弹，是治愈艾滋病毒的主要障碍。目前正在设计治疗方法，以潜在感染细胞的内在先天免疫为目标，摧毁这个储存库[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，但没有任何一种药物能清除艾滋病毒感染者的病毒。gydF4y2Ba

细胞内先天免疫的激活对控制CD4 + T细胞和髓细胞中的HIV感染至关重要[j]。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。这种反应是由病原体识别受体(PRRs)发起的，该受体识别并结合称为病原体相关分子模式(PAMPs)的病毒复制产物。在产生性HIV感染的背景下，研究表明HIV RNA和DNA产物可以通过包括cGAS在内的多种PRRs的作用被识别为PAMPs [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]， ifi16 [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]， tlr [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]， ddx3 [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]和RIG-I [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。当PAMP与这些PRRs结合时，这些PRRs通过信号激活来指导转录因子的下游作用，如干扰素调节因子(IRF)3和NF-ΚB，它们介导抗病毒和免疫调节基因的表达，包括I型和III型干扰素(ifn)和炎症细胞因子[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。干扰素通过其同源受体发出信号，诱导数百种干扰素刺激基因(isg)，其产物具有抗病毒和免疫调节作用，局部和系统地限制病毒复制和传播[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

许多isg特别发挥HIV限制因子的作用，包括gydF4y2BaAPOBEC3GgydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba(gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，gydF4y2BaBST2gydF4y2Ba(tetherin) [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，以及其他[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。HIV已经进化出无数的机制来阻断和/或逃避这些限制因子，主要是通过病毒蛋白产物的作用，包括HIV蛋白酶、Vif、Nef和Vpu。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。ISG限制病毒复制和随后的病毒逃逸是正在进行的研究的一个重要领域，尽管大部分工作集中在正在进行病毒复制的生产性感染细胞上。目前尚不清楚这些isg的作用如何影响潜伏期的转变或逆转，或者潜伏感染细胞中免疫逃逸的病毒机制可能被采用。gydF4y2Ba

在体内，1型IFN反应显著影响HIV感染的过程，尽管这种反应可能是有益的，也可能是致病的，根据感染的时间而有不同的结果。HIV传播后血浆中可检测到IFNα [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，导致IFN反应，可以限制病毒复制和指导细胞死亡，以限制病毒传播[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。来自浆细胞样dc的IFNα抑制CD4 + T细胞潜伏感染的建立[j]gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。这一初始干扰素反应导致了对干扰素耐药病毒变体的选择[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，然而，这些病毒变异在HIV潜伏期中的作用尚不清楚，IFN耐药性可能只是一种短暂的表型[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。在SIV(猿猴免疫缺陷病毒)模型中，感染前或感染后不久静脉注射IFNα2a与isg升高相关，包括gydF4y2Ba(gydF4y2Ba和gydF4y2BaOAS1gydF4y2Ba，以及在恒河猴中减少病毒传播和减缓疾病进展[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。然而，持续使用IFNα2a治疗导致这些动物ISG表达降低，储存库大小增加，表明慢性感染期间IFN脱敏状态。在人类中，慢性HIV感染期间治疗性给药IFNα未能减少疾病进展[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。此外，在人源化HIV感染小鼠模型中进行的两项独立研究表明，阻断IFNα信号传导后，炎症减少，潜伏库减少[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。这些研究表明，IFN对HIV感染和体内潜伏库具有动态影响，并提示HIV潜伏期可能与先天免疫激活和/或IFN信号传导的易感性降低有关。gydF4y2Ba

最近对来自hiv感染患者的T细胞进行的单细胞测序转录组学研究表明，重新激活的潜伏细胞表达的转录程序与自体未感染细胞不同，包括抑制的ISG表达[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba这表明HIV潜伏期可能会影响PRR应对计划。对各种潜伏感染细胞系和原代CD4 + T细胞中的cGAS/STING途径的检测表明，该途径在HIV感染和潜伏期间保持响应[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。相反，潜伏感染细胞中HIV RNA激活RIG-I需要一种激动剂的额外刺激，该激动剂可上调RIG-I信号蛋白，这表明该途径在潜伏感染中可能普遍受到抑制[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。总之，这些研究表明HIV潜伏性感染可能与病毒RNA传感中断、干扰素信号传导和/或ISG激活有关。gydF4y2Ba

在这里，我们进行了一项研究，比较各种体外模型的HIV潜伏期。我们利用一项综合研究设计检测了对RNA PAMP刺激、1型IFN治疗和ISGs表达的反应，其中包括建立的HIV潜伏期CD4 + T细胞系模型、双色报告病毒的CD4 + T细胞系潜伏感染模型和HIV抑制的原发性CD4 + T细胞模型。我们在这些模型中评估了IFN对一组抗病毒isg的诱导作用，并评估了先天免疫和IFN信号通路关键组分的激活。利用包括大量mRNA测序和单细胞RNA测序在内的功能基因组学方法，我们确定了未感染细胞和潜伏或抑制HIV感染细胞之间先天免疫激活和IFN信号传导的差异。我们的观察结果证明了每个HIV潜伏期模型的特定效用，并总体上支持潜伏HIV感染涉及病毒选择或修饰靶细胞到支持病毒库的先天免疫抑制表型的假设。gydF4y2Ba

1型干扰素在HIV潜伏期细胞系模型中的应答分析gydF4y2Ba

为了研究潜伏细胞的先天免疫景观，我们使用了多种HIV潜伏感染细胞系模型，包括两种不同的Jurkat CD4 + T细胞潜伏期模型，JLat9.2和JLat11.1，以及CEM CD4 + T细胞ACH2潜伏期模型，每种模型都含有沉默的HIV原病毒[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。这些具有良好特征的潜伏细胞系可以与未感染的亲本细胞进行比较，这些亲本细胞来源于未感染的亲本细胞，并且可以作为在生理相关的hiv感染模型中确定进一步检查途径的有用工具。JLat9.2和JLat11.1细胞先前是通过用表达GFP的慢病毒报告细胞转导Jurkat细胞，通过FACS选择GFP诱导，然后培养单细胞克隆扩增到表达低水平残留HIV RNA但未检测到HIV蛋白的潜伏感染群体(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。相比之下，ACH2细胞是通过HIV感染A3.01 CEM细胞，然后挽救潜伏感染的细胞而获得的;这些细胞组成性地表达低水平的HIV RNA、蛋白质和感染性病毒(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab) (gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。与JLat9.2和JLat11.1细胞系不同，每种细胞系都含有一个已知的HIV整合体，而ACH2细胞群具有许多独特的HIV整合体[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。JLat和ACH2潜伏期模型都可以重新激活以诱导HIV蛋白的表达(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa-b附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图s1)。gydF4y2Ba

我们首先测量了这些细胞系中各种isg的静息(基线)mRNA水平，发现大多数isg在潜伏的JLat9.2和Jurkat细胞中以相似的低水平表达，尽管有几种isg在JLat9.2细胞中被抑制或“下调”(gydF4y2BaIfit1, ifit3, isg15)gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).静息JLat11.1细胞类似表达较低gydF4y2BaIFIT1gydF4y2BamRNA比Jurkat细胞要多gydF4y2BaIFITM1gydF4y2BamRNA在基线时升高(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1a)。相比之下，与未感染的A3.01细胞相比，ACH2细胞中大多数isg水平升高，这表明ACH2细胞中持续的低水平病毒产生可能引发持续的先天免疫激活(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

接下来，我们评估了这些潜伏细胞系与各自未感染的对照细胞系的IFN反应。用100 IU/ml的IFNβ处理细胞，并在12 h的时间过程中收获细胞，用于分析一组isg的表达。在我们的对照细胞中，这些isg被1型IFN高度诱导或“上调”，已知对许多病毒具有抗病毒活性，并且已知在rig - i介导的IRF3激活的下游被诱导[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。与未感染Jurkat对照细胞相比，ifn β诱导的JLat9.2细胞中ISG mRNA和蛋白的总体表达明显降低gydF4y2BaMX1, IFITM1, IFIT1, IFIT3gydF4y2Ba诱导明显受损(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba例如，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图s1)。IFNβ治疗没有改变HIV在任何潜伏细胞系中的表达gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1c, d)。gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba在ifn β处理的JLat11.1细胞中，mRNA诱导也被取消(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1b)。相比之下，ifn β-处理的ACH2和A3.01细胞都表达了高水平的大多数isggydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba在ACH2细胞中，诱导受到限制(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).因此，HIV潜伏感染在JLat细胞中与IFN信号的异常调节有关，可能会损害细胞完全激活IFN依赖性抗病毒反应的能力，而ACH2细胞显示先天免疫基因的基础表达升高，并保持对IFN的反应。gydF4y2Ba

接下来，我们评估了IFN信号蛋白的表达，发现IFNα/β受体链IFNAR1的表面表达在所有潜伏和未感染的细胞系之间相似(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1f-h)。当IFNβ刺激时，潜伏和未感染的细胞系也增加了磷酸化STAT1和STAT2的丰度(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1j)，表明在该模型中，HIV潜伏期不会阻断JAK/STAT通路激活的1型IFN信号。有趣的是，JLat9.2细胞比未感染的细胞表达更高的STAT2磷酸化形式的基线水平(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1j)。综上所述，这些数据表明，在这些细胞系潜伏期模型中，HIV潜伏感染与IFN信号的基础激活和异常调节有关。gydF4y2Ba

潜伏的HIV感染破坏了PRR信号下游的IFN反应gydF4y2Ba

为了进一步评估潜伏细胞系的病毒RNA感知和先天免疫激活，我们用仙台病毒(Sendai virus, SeV)感染潜伏的JLat9.2或ACH2细胞，并用仙台病毒(Sendai virus, SeV)控制Jurkat或A3.01细胞。仙台病毒是一种模型RNA病毒，通过多种先天免疫途径驱动强大的IRF3激活。gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。SeV感染不会重新激活JLat9.2细胞中的HIV表达(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图s1)。在SeV感染(100 HAU/ml)后12和24小时，IFNβ在潜伏的JLat9.2和ACH2细胞中的表达低于相应的Jurkat和A3.01对照，表明SeV诱导的JLat9.2和ACH2潜伏细胞系的抗病毒先天免疫反应减弱(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b)。与sev感染的对照Jurkat细胞相比，sev感染的JLat9.2细胞在所有测试的isg中表达了可变但总体较低的mRNA水平(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa). sev感染的ACH2和A3.01细胞转录了相似水平的大多数isg(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)，尽管在ACH2细胞中ISG的基线表达要高得多(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).与非信号xRNA对照相比，我们进一步检测了RIG-I激动剂PAMP RNA转染后Jurkat和JLat9.2细胞的先天免疫激活和ISG表达[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。PAMP RNA而非xRNA在处理后24 h诱导了两种细胞系中IFNβ的表达，并在Jurkat细胞中诱导了一组ISGs的表达;然而，在JLat9.2细胞中，ISG的表达被抑制(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

IRF3激活和IFNβ表达是先天免疫激活的标记，在PRR信号传导后驱动下游ISG表达。生产性HIV感染已被证明可以驱动PRR信号，但抑制IRF3的激活[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。为了评估IRF3在HIV潜伏细胞中的激活，我们在感染SeV后的潜伏JLat9.2和对照Jurkat细胞中检测了IRF3的磷酸化和核易位。IRF3在静息状态下存在，在Jurkat和JLat9.2细胞中含量相似，并且在SeV感染后，这两种细胞系的386丝氨酸(pIRF3 S386)被磷酸化(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, e)。imageststream分析显示，SeV感染在Jurkat和JLat9.2细胞中引发了相似水平的IRF3核易位(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf, g，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2a)。总之，这些结果表明，HIV潜伏细胞在PRR信号或IRF3激活方面通常不会受损，而是表现出IFN产生减少以及IFN产生/信号下游发生的IFN诱导的ISG表达抑制。gydF4y2Ba

潜伏性JLat9.2细胞中先天免疫转录组的全局基因表达及分析gydF4y2Ba

为了全面确定潜伏HIV感染中ISG表达失调的程度，我们分别对JLat9.2和Jurkat细胞进行了大量RNA测序(RNAseq)转录组学分析，分别作为HIV潜伏期和未感染对照细胞的模型。Jurkat和JLat9.2细胞不处理(模拟处理)或用100 IU/ml IFNβ刺激4、8或12小时，然后通过RNAseq分析。每个实验条件下设3个独立的生物重复。所有样品的主成分分析显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S3a，验证了生物复制的相似性，揭示了每个细胞系对IFN的不同转录组反应。我们首先确定了静息(模拟处理)Jurkat和JLat9.2细胞之间的差异表达(DE)基因，并使用基因本体(GO)分析将这些基因分组为功能类别(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).在Jurkat细胞中，这些DE基因聚集成氧化石墨烯类别，通常跨越ISG功能，包括先天免疫激活、炎症反应、细胞因子产生和免疫调节[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。相比之下，在JLat9.2细胞中显著富集的氧化石墨烯类别包括发育和分化程序，但缺乏先天免疫、抗病毒或免疫激活功能。这些观察结果表明，未感染的Jurkat细胞在激活和调节ifn诱导的抗病毒反应方面可能比携带HIV原病毒的JLat9.2细胞更有效。gydF4y2Ba

接下来，我们在Jurkat或JLat9.2细胞中鉴定了IFNβ (ISGs)诱导的基因。这些isg被定义为与模拟处理的细胞相比，在IFNβ处理4、8或12小时后表达显著改变(Log2倍变化> 1.2)的基因。我们在ifn β处理的Jurkat和/或JLat9.2细胞中鉴定了503个DE isg，如图中的热图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab(另见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表1)。发现了显著富集的通路，并将其分为六个主要模块，在图中以不同的颜色表示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab，并使用选择的高度重要的路径进行注释(参见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S1为所有通路)。虽然IFNβ处理诱导了两种细胞系的转录变化，但热图显示Jurkat和JLat9.2细胞之间IFN诱导的基因表达存在广泛差异，表明这些细胞系对1型IFN处理的反应不同。在JLat9.2细胞中，基因表达呈对数倍变化的总体模式，特别是在深蓝色模块中(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab;PRR激活和IFN信号通路)，黑色模块(维甲酸和死亡受体信号通路)和橙色模块(GPCR和TLR信号通路)。此外，我们在JLat9.2细胞中观察到一种增强的免疫调节和炎症基因模式(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab，红色和黄色模块)，其中包括与T细胞衰竭，STAT3信号传导和TNFR2信号传导相关的途径。综上所述，这些发现证明了JLat9.2和Jurkat细胞之间isg的差异调控与该模型系统中的HIV潜伏期有关。gydF4y2Ba

为了确定IFN反应特征在这些潜伏和未感染细胞模型之间的差异，我们鉴定了JLat9.2和Jurkat细胞之间诱导的isg差异。这种“差异表达的差异”(“DDE”)分析揭示了ISG与HIV潜伏期相关。我们鉴定出106个DDE基因(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表1)。值得注意的是，与JLat9.2细胞(66个基因)相比，许多典型的抗病毒isg在Jurkat细胞中表现出更大的诱导作用gydF4y2BaMx1, oas1, ifi27, stat1, mx2, rsad2，gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFITM3gydF4y2Ba，以及其他调节细胞增殖/存活的isg，如gydF4y2BaMT2AgydF4y2Ba［gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。DDE热图显示，与Jurkat相比，JLat9.2细胞中这106个基因的表达减少(见图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba网络分析将这些基因与STAT1和STAT2调控节点联系起来gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3b)。我们还发现，IFN在JLat9.2细胞中上调了一些先天免疫调节基因，但在Jurkat细胞中没有上调，如gydF4y2BaSOCS1gydF4y2Ba这是一种已知的STAT1信号抑制因子，可以阻断gydF4y2BaOAS1gydF4y2Ba和gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba表达式[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。另一方面，IFN处理的Jurkat细胞表达了更高水平的几种免疫激活基因，这可能增强了IFN对JLat细胞的抗病毒作用(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S3b，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表1)。这些包括gydF4y2BaHERC5,gydF4y2Ba它编码一个主要的E3连接酶，支持抗病毒作用gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]gydF4y2Ba，gydF4y2Ba和gydF4y2BaPLSCR1gydF4y2Ba，是ISGs的转录辅助因子[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。总的来说，这些数据表明，与Jurkat细胞相比，JLat9.2细胞诱导了较低水平的许多抗病毒isg，并改变了IFN控制基因的表达。gydF4y2Ba

潜伏感染与高产感染Jurkat细胞中ISG表达的差异gydF4y2Ba

为了进一步研究ISG在不同HIV感染状态下的表达，我们使用了红-绿-HIV-1 (RGH)双色慢载体报告，该报告可以通过流式细胞术区分潜伏和有效感染细胞[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。用复制能力不强的RGH病毒进行转导，为具有不同原病毒整合位点的不同群体的潜伏性和生产性感染细胞提供了一个平台模型，克服了克隆潜伏细胞系模型的许多局限性。用RGH转导的细胞通过巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子组成性地表达mCherry，表明原病毒整合，而在病毒长末端重复序列(LTR)元件控制下的绿色荧光蛋白(GFP)的表达标志着细胞正在进行HIV转录。因此，双色荧光标记了整合了原病毒的细胞正在进行活跃的病毒基因表达(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).先前的研究也表明，rgh转导的细胞在转导后4天就建立了稳定的潜伏期，从而可以在相对较短的时间内对生产性(双荧光)、潜伏性和阴性细胞进行有意义的比较[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为了评估ISG在RGH模型中转导细胞中的表达，Jurkat细胞分别用条件培养基(模拟感染)、RGH病毒(MOI 0.2)或RGH整合酶突变病毒(ΔINT对照，MOI 0.2)处理5天。然后根据mCherry和GFP的表达将细胞分为阴性组、潜伏组和生产性组(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab、c、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2b)。由于这种病毒不能复制，并且使用了低MOI, rgh转导的细胞可能只有1个整合的原病毒，要么是潜伏的，要么是产生的，但不是两者都有。通过DAPI染色鉴定死亡细胞，并从分类群体中排除(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2b)。将分选的细胞置于培养液中，用培养基单独处理(未处理的对照组)，用IFNβ刺激或用PMA和离子霉素重新激活，然后用qRT-PCR分析基因表达。gydF4y2Ba

在基线(IFN治疗前)，ISG表达在模拟细胞、ΔINT细胞、分选阴性细胞和分选潜伏细胞之间大致相似gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFIT2gydF4y2Ba在生产性(双荧光)细胞中水平升高(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae).为了评估IFN对ISG表达的急性影响，而不是对病毒潜伏期的长期影响，我们选择了较短的治疗时间，发现HIV RNA表达总体上不受IFNβ治疗8小时的影响(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)。我们测量了ifn处理的细胞群中ISG mRNA的诱导倍数，与未处理的模拟对照细胞相比，发现IFNβ在模拟细胞和ΔINT-treated细胞中诱导了相似水平的典型ISG，这表明单纯的病毒暴露不会改变ISG的激活(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf).有趣的是，IFN诱导选择的isg (gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOAS1)gydF4y2Ba在潜伏细胞中减少，而在模拟对照细胞中没有减少(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf).这一选择性ISG抑制的发现与我们在JLat9.2和JLat11.1细胞系潜伏性HIV感染中的观察结果一致(见图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)，尽管不同模式的isg受损程度不同。虽然JLat9.2和rgh转导的潜伏细胞都来自相同的Jurkat细胞系，但这些潜伏期模型在群体多样性、整合位点和潜伏期寿命方面存在很大差异，因此这些因素可能导致模型之间的表型不同。有趣的是，高产(双荧光)细胞在基线时均显示isg升高(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae)和IFN刺激后(图3)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf)，表明HIV RNA和/或蛋白产物刺激先天免疫并增强细胞对外源性干扰素的反应。值得注意的是，同样组成性表达病毒产物的ACH2潜伏细胞具有显著升高的ISG mRNA基线水平(见图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

接下来，我们研究了该模型中的潜伏细胞是否可以重新激活病毒转录，以及这种结果是否会影响先天免疫信号传导。用RGH病毒转导细胞，然后按照前面描述的方法进行分类，在培养中休息过夜，然后用PMA/离子霉素重新激活24小时，用qRT-PCR分析。PMA/ iononomycin处理导致潜伏细胞中HIV RNA的强劲增加，但仅在生产细胞中适度增加(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag). HIV再激活导致诱导gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFIT1gydF4y2Ba在这两组中。然而，值得注意的是，相对于有效感染细胞，这些isg的诱导程度在潜伏细胞中显著降低(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag)尽管再激活的潜伏细胞高表达HIV RNA。因此，在RGH感染模型中，HIV潜伏期与IFN治疗或病毒再激活后ISG诱导的选择性减少有关。gydF4y2Ba

ISG在HIV抑制的原发CD4 + T细胞模型中的表达分析gydF4y2Ba

我们在HIV感染的原发CD4 + T细胞模型中评估了art介导的HIV抑制对细胞内在抗病毒反应的影响。我们建立了病毒抑制原代细胞模型[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，这与其他实验室的模型相似[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。该模型允许在低水平或无法检测到HIV RNA表达的情况下分析HIV感染细胞，作为抗逆转录病毒治疗患者HIV潜伏期的代表。我们用稳态细胞因子(IL-2、IL-7和IL-15)处理来自三种不同供体的健康人类CD4 + T细胞5天，以增加细胞的容纳性，然后用具有复制能力的NanoLuc报告病毒感染细胞，该病毒在HIV LTR转录上表达荧光素酶(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).感染后24小时，HIV感染细胞转录HIV RNA(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4a)并产生指示病毒复制的荧光素酶(图S4a)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4b)。此时，我们用ART (10 μM raltegravir和1 μM efavirenz)处理细胞以抑制整合和逆转录。荧光素酶的产量在感染后4天达到峰值，然后在ART治疗7天后与模拟水平相似下降，表明病毒复制受到抑制(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4b)。液滴数字PCR (ddPCR)分析显示，抗逆转录病毒治疗7天后，约3.1%的细胞呈HIV DNA阳性(平均3个供体，见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3)。gydF4y2Ba

为了评估抗逆转录病毒治疗7天后抑制细胞对IFN的反应，将模拟细胞和hiv感染细胞重悬在含有抗逆转录病毒治疗和稳态细胞因子的培养基中，然后用IFNβ(20或100 IU/ml, 8小时)刺激或不处理(单独使用抗逆转录病毒治疗和稳态细胞因子)。采用qRT-PCR分析ISG mRNA的表达，并定量测定相对于未处理细胞的折叠mRNA诱导量。我们发现，与模拟相比，hiv感染的细胞有升高基线ISG RNA水平的趋势，尽管这些差异通常没有统计学意义(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4c)。与未处理的细胞(无IFN)相比，模拟细胞和hiv感染细胞均上调isg以响应IFN。部分isg在hiv感染细胞中被抑制(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad-f)，尽管这些差异相对于我们之前对潜伏期细胞系模型的研究结果来说是适度的(见图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。由于该模型的HIV感染率很低(约为3.1%)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(表S3)，这是有道理的，在模拟和艾滋病毒感染的样本之间，IFN的反应在大小上一般相似。ISG的诱导程度因供者而异，供者1和3的T细胞表现出更大的ISG抑制(gydF4y2BaIFIT1)。gydF4y2Ba

在我们的模型中，我们测量了这些细胞(在ART和IFNβ治疗后)分泌的荧光素酶，以确定IFNβ是否影响ART对HIV复制的抑制。在IFNβ治疗前后，hiv抑制细胞中的荧光素酶表达相似(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(图S4d)，表明IFNβ在该模型中没有改变HIV的复制。我们通过对来自一个供体的抑制细胞进行短期IFN治疗来评估JAK/STAT信号传导，发现与模拟细胞相比，hiv感染细胞在基线和IFNβ治疗30分钟后磷酸化STAT1和STAT2水平升高(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4e)。然而，在IFNβ治疗1小时后，未感染和hiv感染的细胞都经历了相同程度的STAT1和STAT2磷酸化，类似于在Jurkat和JLat细胞中观察到的结果(见图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1j)。gydF4y2Ba

为了进一步验证我们的病毒抑制模型，我们在7天后从培养物中去除ART，让细胞休息24小时，然后测量分泌的荧光素酶。去除ART导致HIV感染细胞中荧光素酶升高，表明病毒反弹，并验证了ART在该模型中积极抑制HIV复制(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S4f)。在这个时间点用PMA和离子霉素再激活进一步增加荧光素酶的表达，表明存在可再激活的原病毒细胞gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S4f)。因此，我们的原代细胞模型忠实地捕获了HIV病毒的抑制和再激活，其中art抑制的HIV感染与选择基因对IFNβ的反应改变有关，类似于我们在HIV潜伏期细胞系模型中的观察(见图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

原代CD4 + T细胞中hiv调控基因的scrna序列鉴定gydF4y2Ba

为了在单个细胞水平上确定被抑制的HIV前病毒与原代细胞内先天免疫防御之间的关系，我们检查了HIV被抑制的原代CD4 + T细胞模型，注意到虽然这些细胞抑制了病毒复制，但它们通常保留低水平的可检测的HIV RNA。我们的培养模型的这些特性可以通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)鉴定感染细胞。CD4 + T细胞从两个健康的人类PBMC捐助者在体内平衡细胞因子培养(- 2,IL-7 IL-15) 5天,然后mock-treated或NanoLuc感染艾滋病毒(MOI 2.0, 24 h)、抑制和依法韦伦raltegravir 7天,当时不及时治疗或治疗干扰素β(100国际单位/毫升)为8 h。在我们之前的实验中,我们选择短疗程的干扰素β治疗,艾滋病毒影响转录和复制在这个模型(见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4d)。然后对培养物进行scRNA-seq分析(每个样本约8000个细胞)。鉴定出含有至少一个HIV-1基因组读图谱(一个UMI计数)的细胞被归类为病毒RNA阳性(vRNA +)。虽然我们分析了每个细胞40,000个reads，但这个mRNA reads的范围可能不能完全代表HIV mRNA的总细胞含量。然而，该方法确实能够合理地区分vRNA +和vRNA-细胞。hiv感染样本含有3.9-9.8%的vRNA +细胞(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3)。CD4 + T细胞亚群分析显示，HIV RNA表达在诱导调节性T细胞中富集(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5a-c)。gydF4y2Ba

来自整个scRNA-seq数据集的vRNA +和vRNA-细胞以均匀流形近似和投影(UMAP)约简的方式显示(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa). vRNA +细胞在UMAP中倾向于彼此靠近聚集，表明这些细胞具有相似的转录组谱。第二个UMAP图显示了vRNA +细胞中不同的HIV RNA表达水平，并揭示了这些细胞倾向于聚集在具有相似HIV RNA丰度的其他细胞附近(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).考虑到HIV RNA的广泛表达以及我们的scRNA-seq方法检测单个病毒转录物的敏感性，我们首先计算HIV细胞中HIV计数的中位数，然后将细胞分类为vRNA，进一步将vRNA +细胞分为高病毒RNA表达亚群和低病毒RNA表达亚群gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba如果HIV计数高于中位数，细胞为vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba如果计数低于中位数(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)。vRNAgydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba来自每个供体的细胞表达的HIV RNA水平(平均4.9和3.4个HIV RNA计数)可能来自经历低水平病毒复制的细胞，而vRNA中HIV RNA丰度降低gydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba细胞(平均1个HIV RNA计数)表明该群体与潜伏细胞一样经历了一定程度的转录抑制。虽然我们不能排除vRNA-亚群中潜伏细胞的可能性，但我们的ddPCR数据显示，只有低百分比的HIV DNA +细胞，这表明真正潜伏HIV感染的细胞是较大vRNA-群体的一小部分。gydF4y2Ba

为了确定HIV在ART抑制的情况下如何影响全球基因表达，我们进行了DE分析来定义HIV调控基因。我们分析了vRNA中的基因表达gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba来自两个供体未经处理(无IFN)的hiv感染样本的细胞，并确定了80个hiv调节基因，这些基因在一个或两个细胞亚群中相对于模拟感染细胞有差异表达(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad、附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。这些基因中有许多参与了与RNA翻译、蛋白质定位和蛋白质靶向相关的过程。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae)，表明在我们的病毒抑制原代细胞模型中，HIV感染调节了蛋白质和RNA的代谢。在两个vRNA中显著升高的基因gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba与模拟感染的细胞相比，vRNA-细胞在基线上的亚群包括gydF4y2BaLAG3 / CD223gydF4y2Ba，一种抑制淋巴细胞活化的受体，已知在HIV感染时被诱导，并导致HIV持续存在[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]，几个颗粒酶编码基因(gydF4y2BaGzma, gzmb, gzmh)， lgal3gydF4y2Ba(编码半乳糖凝集素-3)，已知是由爱滋病病毒诱导的[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba),而gydF4y2BaRNF213gydF4y2Ba， E3泛素连接酶[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。我们发现isg的一个子集在HIV的基线时被抑制gydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba或艾滋病毒gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba细胞与模拟感染细胞的比较，包括gydF4y2BaSTAT1, RPL5, IFITM2, IFITM3, GBP1, IFIT3, ISG20gydF4y2Ba(在下面描述)。gydF4y2Ba

hiv抑制的原代CD4 + T细胞中ISG诱导的scRNA-seq分析gydF4y2Ba

由于潜伏细胞系的大量rna测序显示干扰素转录组的广泛破坏(见图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，接下来，我们将原代细胞scRNA-seq分析重点放在ifn应答基因上。我们首先进行了差异表达(DE)分析，比较了大量ifn处理的培养物(模拟感染或hiv感染)与没有IFNβ处理(未处理)的每个相应培养物。我们发现116个isg在任何样本中都被IFNβ显著诱导，相对于相应的未处理对照，与vRNA状态无关(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).在这116个isg中，98个在模拟感染和艾滋病毒感染的培养物中都被IFN显著诱导，16个仅在模拟感染的培养物中显著，2个仅在艾滋病毒感染的培养物中显著。在hiv感染培养的细胞中，ISG诱导的大小总体上呈现出略微降低的总体趋势，这与我们对该模型的qRT-PCR分析相似(见图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad-f)。这些isg是通过对两个T细胞供体的综合分析确定的。单个供体样本中isg的平均表达见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S6。由于在感染艾滋病毒的培养物中，有一小部分细胞实际上含有艾滋病毒RNA(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(表S3)，由此可见，这种大量的细胞群通常会模仿模拟感染的细胞群，这突出了单细胞方法的价值。gydF4y2Ba

接下来，我们应用我们的单细胞测序方法来评估细胞对IFN的反应如何受到特定HIV感染状态的影响。我们在hiv感染培养物(vRNA)的三个先前鉴定的亚群中测量了单细胞水平上ISG的表达gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba, vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba，或vRNA-细胞;见图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa-c) IFNβ处理8 h后。vRNA中ISG的表达gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba, vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba然后分别将vRNA-细胞与ifn处理的模拟细胞中的基因表达进行比较(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba分别为罪犯)。这三个图中的每一个都表示图中116个isg的同一组的表达动态。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa.每张图的x轴表示ifn处理的模拟细胞与未处理的模拟细胞之间的Log2倍变化(LFC) ISG表达，相当于图中的黑色符号。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa. y轴表示来自hiv感染培养物(vRNA)的经ifn处理的细胞之间ISG表达的LFCgydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba, vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba(或vRNA-细胞)与ifn处理的模拟感染细胞。对于每种情况(IFN治疗HIV vRNA)gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba, vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba(或vRNA- vs IFN模拟)我们对IFN处理与模拟的lfc与lfc进行了线性回归建模，从而定义了HIV对ISG表达的影响，以及这与IFN处理的模拟感染对照细胞中ISG表达的关系。对于每个线性回归模型，我们生成了95%置信区间(CI;如图中灰色阴影区域所示)。CI以95%的置信度描绘了116个ISG中的ISG lfc在IFN存在下的高、低或负水平的vRNA (y轴)，以及它们对IFN的反应(x轴)，预计会下降的位置。正如前面的分析所指出的(见图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，这里我们同样结合了来自CD4 + T细胞供体的数据。gydF4y2Ba

在我们的原代细胞模型中，我们确定了在所有三种HIV vRNA状态条件下ISG的差异和可变表达。ifn处理的vRNA-细胞显示出与ifn处理的模拟感染细胞大致相似的ISG表达模式(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).回归模型斜率为0.04，表明在该模型系统中，暴露于HIV但未检测到感染的情况下，在IFN治疗8小时后，ISG调节没有显著改变。然而，24个isg(21%的isg)落在y轴零线以下。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab，蓝色符号)，表明它们在ifn处理的vRNA-细胞中的表达相对于ifn处理的模拟感染细胞有所降低。在vRNA +细胞中，ISG对IFN反应的总体趋势有很大不同(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, d)。这些图中线性模型的斜率具有更强的正值(vRNA为0.27和0.1)gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba，并在y轴上正移位(vRNA的截距值分别为0.13和0.06)gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba这表明这些基因中的大多数对IFN的反应增强了对HIV的诱导反应。特别有趣的是，isg位于CI之外，位于y轴0线以下，表明它们在ifn处理的vRNA中下调gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba或vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba细胞相对于ifn处理的模拟感染细胞(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, d;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。gydF4y2Ba

对图5所示数据进行更深入的分析。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, d显示不同vRNA之间IFN反应的明显差异gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba细胞。在ifn处理的vRNA中，ISG mRNA的表达总体上显著增强gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba细胞相对于所有其他细胞，表明较高水平的病毒产物可能增强IFN反应，正如在两种ACH2细胞中所证明的那样(见图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和来自RGH模型的生产性细胞(见图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。相比之下，ifn处理的vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba与类似处理的模拟感染细胞相比，细胞具有不同水平的ISG mRNA表达(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).这一结果与我们在细胞系潜伏期模型中的发现形成对比，后者显示IFN治疗后ISG诱导显著受损。然而，我们在hiv感染的vRNA中发现了IFN诱导不良的isg亚群gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和/或vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba)细胞，这可能改变了HIV感染背景下的调节。图中用蓝色符号表示。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC, d和包括gydF4y2BaIfitm1, ifitm2, ifitm3, gbp1, mt2a，gydF4y2Ba和gydF4y2BaLGALS3BP。gydF4y2Ba图中也显示了静息和ifn刺激下这些图中选定isg的表达。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae.总的来说，抗逆转录病毒治疗条件下原发CD4 + T细胞的单细胞转录组显示vRNAgydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba细胞显示基线表达和ifn诱导的部分isg表达改变。gydF4y2Ba

我们整合了转录组学数据集，在各种细胞培养感染模型中鉴定hiv调控基因，总结在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S4。在我们的细胞模型中，这些isg在潜伏细胞或hiv抑制细胞和相应的控制细胞之间被鉴定为显著差异表达。这个基因集包括gydF4y2BaGBP1, IFIT1, IFIT2, IFITM1, IFITM2, IFITM3, ISG15, MT2A, MX1, OAS1, RPL5, RSAD2 (viperin)，gydF4y2Ba和gydF4y2BaSTAT1gydF4y2Ba。因为在我们的培养模型中，这些基因在未感染细胞和潜伏细胞之间表现出显著不同的表达和/或IFN诱导，我们认为这些基因值得进一步研究，以揭示它们的表达可能减轻潜伏HIV感染的建立或持续的新功能。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们检测了HIV潜伏期细胞系和原代细胞模型中的先天免疫激活和IFN反应。先天免疫在体内HIV感染的早期控制中起着重要作用，但目前尚不清楚潜伏感染的细胞是否具有功能性先天免疫和干扰素应答。在这里，我们研究了RIG-I激动剂和1型干扰素在各种不同的HIV潜伏感染或病毒学抑制的体外模型中的反应，包括原发性CD4 + T细胞中的HIV抑制模型。当受到RIG-I激动剂或IFN刺激时，与未感染的对照细胞相比，J-Lat和ACH2潜伏细胞系显示ISG诱导减少，这表明在这些模型中建立的长期潜伏期可能与IRF3激活下游对IFN的失调反应有关。在潜伏感染双色报告性HIV的Jurkat T细胞中观察到类似的结果。在一组116个isg中，与模拟感染的细胞相比，感染HIV并受ART抑制的原发CD4 + T细胞对IFN刺激的反应不同，但有所降低。这些hiv抑制的CD4 + T细胞的单细胞转录组学分析显示，来自同一培养的病毒RNA阳性(vRNA +)和阴性(vRNA-)细胞具有不同的基因表达谱，参与RNA加工、翻译和IFN反应的基因表达发生改变。对vRNA +细胞的进一步分析显示，在表达低HIV RNA (vRNA)的细胞中，IFN刺激后ISG的诱导程度较低gydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba)高于表达较高病毒RNA (vRNA)的细胞gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba)。我们在多个HIV潜伏期模型或经历病毒学抑制的原代细胞模型中观察到，HIV潜伏感染与改变1型IFN反应的转录变化有关，尽管不同模型中特定基因的改变有所不同。gydF4y2Ba

体内的HIV潜伏库是一个多样化的群体，包括多个CD4 + T细胞亚群，分布在不同的组织中，并且具有不同的前整合位点。了解HIV潜伏期的一个主要挑战是体外模型的可用性，这些模型可以捕获HIV储存库的异质性。我们比较了代表潜伏感染或病毒控制的各个方面的各种HIV潜伏期模型，并研究了这些模型中IFN反应与HIV感染的关系。潜伏细胞系是增殖的克隆群体，代表体内克隆扩增可能产生的潜伏细胞，但每个细胞系仅代表具有单一前病毒整合的单一独特潜伏细胞。相比之下，RGH荧光团报告系统通过异质前病毒整合模拟急性感染，并能够比较潜伏细胞和产生细胞，尽管病毒驱动的转录抑制可能会影响荧光团的表达并影响每个群体的完整性。另一方面，我们的原代细胞模型代表了激活的CD4 + T细胞的生产性感染，然后被ART抑制。虽然该模型近似于HIV潜伏期，但它并不代表由完全转录沉默或克隆扩增引起的潜伏感染。然而，该模型代表了不同的原代细胞群，并解释了ART的影响，模拟了在HIV抑制和潜伏期背景下接受ART治疗的患者的不同储存库。我们发现潜伏感染与改变的1型IFN反应有关，尽管表型在不同的潜伏期模型之间有所不同。我们还在每个模型中发现了ifn诱导的ISG网络中不同的转录变化。 Considering the vast biological diversity of the latently infected cell population in vivo [64gydF4y2Ba]， IFN反应调节也可能通过多种机制发生。这些机制并不局限于病毒介导的过程，但也可能与IFN信号和CD4 + T细胞反应程序的内在细胞特异性差异有关，这些差异以HIV选择的方式为支持潜伏性HIV感染提供基础。gydF4y2Ba

我们对潜在细胞系的先天免疫激活和IFN信号传导的分析表明，与未感染的细胞相比，RIG-I激动剂或IFN刺激的潜在细胞诱导的选择isg水平较低gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba。然而，不同的延迟模型的isg变化是不同的。由于仙台病毒在潜伏的JLat9.2和控制的Jurkat细胞中诱导了相似水平的IRF3磷酸化和核易位，我们得出结论，rig - 1信号和IRF3在该模型中起作用。此外，我们在潜伏细胞系中没有观察到IFNAR1表达或JAK/STAT磷酸化的损失，这表明抑制ISG表达的过程可能发生在这些因子的下游，可能在转录水平上。事实上，潜伏的HIV感染驱动了许多细胞变化，可能导致选择性isg的转录抑制，包括转录因子如STAT1、NF-ΚB和IRF1的调节[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，抑制染色质修饰下调原病毒基因[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]，以及核糖体蛋白的改变[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

我们的功能基因组学分析显示，与未感染的细胞相比，潜伏细胞系和HIV抑制的原代细胞中选择的isg的mRNA丰度降低，因此在这些潜伏期模型中，许多isg的表达降至较低的基线水平，并且IFN对其的诱导作用较差，如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。我们的单细胞测序分析还显示，与来自相同人群的模拟感染培养物或病毒RNA阴性(vRNA-)细胞相比，具有可检测的HIV RNA (vRNA +)的HIV抑制细胞具有参与RNA生物发生，RNA代谢和翻译过程的许多基因水平的改变。这些观察结果支持一个模型，即HIV感染和潜伏期驱动RNA转录和翻译机制的变化，可能影响isg的表达。gydF4y2Ba

艾滋病毒感染的一个关键问题是，为什么一些有效感染的细胞死亡，而另一些细胞进展为潜伏期。在特定细胞中受损的IFN信号可能支持潜伏持续，尽管尚不清楚这种表型是由HIV感染驱动还是潜伏前细胞的固有特性。细胞内先天免疫应答的强度和效力取决于许多因素，如信号蛋白(PRRs、STATs、IRFs、IFNAR等)的表达和丰度、这些蛋白的翻译后修饰以及isg的转录调控[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。这些因素因个体细胞而异，可能使细胞对潜伏性感染有较差的抗病毒反应。事实上，我们的单细胞测序研究揭示了vRNA +细胞(包括vRNAgydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和/或vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba亚群)有一个独特的转录程序，抑制细胞增殖的标志物(gydF4y2BaJun, lamp3, rpl5gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]，调控NF-ΚB信号(gydF4y2BaLGALS3, RNF213gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]，并促进T细胞衰竭标志物的表达(gydF4y2BaLAG3gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba59gydF4y2Ba(参见附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。这些特性中的一些可以解释为Tregs对其他CD4 + T细胞亚群的优先感染，这在我们的模型和其他模型中得到了证明，并表明T细胞的表观遗传编程可能会影响潜伏结果。最近的一项单细胞测序研究类似地将原发性CD4 + T细胞中的HIV潜伏期与T细胞亚群身份联系起来，发现HIV原病毒抑制与中枢记忆转录表型相关[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]。因此，具有免疫抑制转录组的细胞，无论是来自抗病毒基因的随机表达还是预定的T细胞命运，都可能是HIV潜伏期的选择。gydF4y2Ba

整合我们测序研究的数据集，确定了isg在潜伏或HIV抑制细胞中被抑制，但在HIV潜伏期中尚未发挥已知作用(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。其中包括vRNA中下调的基因gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba和/或vRNAgydF4y2Ba^罗gydF4y2Ba相对于模拟感染CD4 + T细胞(gydF4y2BaStat1, ifitm1, ifitm2, ifitm3, gbp1, rpl5, is20gydF4y2Ba)，或IFN在一个或多个潜伏期细胞系模型中诱导不良(gydF4y2BaStat1, mx1, ifitm1, ifitm3, ifit1, ifit2, mt2a, oas1, isg15, rsad2)gydF4y2Ba。gydF4y2BaSTAT1gydF4y2Ba在我们评估的所有潜伏期模型中，潜伏或hiv抑制细胞中表达下调。因此，IFN信号传递所必需的这个关键基因的表达会对HIV建立潜伏期的能力产生负面影响。值得注意的是,gydF4y2BaIFITM1gydF4y2BaIFNβ在JLat9.2细胞、RGH潜伏感染Jurkat细胞和vRNA阳性的hiv抑制CD4 + T细胞中诱导不良。单细胞测序分析显示相关gydF4y2BaIFITM2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFITM3gydF4y2Ba在ifn处理的vRNA +细胞中，基因也被抑制，这突出了IFITM家族蛋白在HIV-1潜伏期限制中的潜在作用。我们建议表中所列的基因gydF4y2Ba1gydF4y2Ba应考虑作为候选潜伏期限制因素进行研究。通过HIV直接或间接地调节这些基因的表达可能有助于促进有利于潜伏期的建立和长期维持的细胞环境。通过该模型，预测这些特异性isg的高表达或持续表达将破坏CD4 + T细胞内的一个或多个基本生物学过程，否则这些过程将促进HIV潜伏期的建立和/或持续。gydF4y2Ba

我们在多种不同的HIV潜伏期体外模型中评估了先天免疫激活和IFN反应，并观察到潜伏细胞对某些isg的诱导受损。虽然这些isg在不同的潜伏期模型之间存在差异，但这些基因的核心集在RNA测序研究中表现出保守的调控(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，揭示了与HIV潜伏期或art抑制HIV模型相关的特异性ISG表达的抑制。这项研究强调了1型IFN在HIV病毒库的形成、组成和长期维持中的作用。在这里，我们还确定了isg可能在潜伏感染细胞中具有独特和不同的作用，尽管在潜伏模型中失调的isg也有所不同。需要进一步的研究来阐明这些isg的功能，并确定它们如何作为可能的“潜伏期限制因素”调节HIV潜伏期。我们的观察结果有助于理解HIV如何通过改变ISG表达来选择细胞。我们的观察结果支持这样一种观点，即恢复和/或增强潜伏细胞中的特异性ISG功能可能是任何针对先天免疫程序的潜伏期逆转疗法成功的关键。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

从ATCC获得Jurkat E6-1、HEK-293 T和TZM-bl细胞。JLat9.2、ACH2和A3.01细胞来自NIH艾滋病试剂计划。JLat11.1细胞是来自华盛顿大学Florian Hladik博士的礼物。Jurkat、JLat9.2、JLat11.1、A3.01和ACH2细胞在添加10%牛血清、1% l -谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠和1%抗生素/抗真菌混合物(均为Fisher Scientific)的RPMI中培养，以下称为完整的RPMI。将HEK-293 T和TZM-bl细胞培养在添加10%牛血清、1% l -谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠和1%抗生素/抗真菌混合物的DMEM中。所有细胞在37°C和5% CO2下保存。细胞系从早期传代中解冻，培养时间不超过4周。所有细胞系均未检测出支原体污染。gydF4y2Ba

原代CD4 + T细胞的分离和培养gydF4y2Ba

用Ficoll-Paque梯度离心从半白球包(Bloodworks Northwest)中分离出3名健康献血者的PBMC。简单地说，从一半的白细胞包中收集细胞，用200 ml含2 mM EDTA的完全RPMI稀释。将30ml稀释后的PBMC分层于15ml Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)中的50ml锥形管中，然后在400xG下在20°C下离心30min。收集PBMC，转移到50 ml的锥形管中，用完全RPMI洗涤，然后用红细胞溶解缓冲液溶解残余红细胞5分钟。PBMC用完整的RPMI洗涤并通过网状过滤器。CD4 + T细胞通过CD4 + T细胞分离试剂盒(Miltenyi)使用QuadroMACS分离器(Miltenyi)根据制造商的说明，负磁分离从PBMC中纯化。纯化的CD4 + T细胞在37℃和5% CO2的RPMI培养基中培养，RPMI培养基中添加10% FBS、1% l -谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠和1%抗生素/抗真菌混合物(完全RPMI)。细胞冷冻保存在含有10% DMSO的胎牛血清中，并保存在液氮中。CD4 + T细胞基因分型为CCR5Δ32多态性，并确认CCR5野生型纯合子(供体#1和2)，或CCR5Δ32杂合子(供体#3)。gydF4y2Ba

表达HIV-1报告病毒的nanoluc复制能力的产生gydF4y2Ba

我们获得了HIV-1感染分子克隆(IMC) vnl - snluc . 6atrii - b - bal。Ecto是一种分泌型纳米荧光素酶(sNLuc)报告病毒(以下简称“NanoLuc HIV”)，表达HIV-1的Env外结构域gydF4y2Ba_{落下帷幕gydF4y2Ba}在nl4 -3衍生的前病毒主干中，基于我们之前描述的编码sNLuc的HIV-1前病毒结构。T2A或LucR。6ATRi reporter cassettes [73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]。T2A“核糖体跳过肽”被修饰的脑心肌炎病毒(EMCV) 6ATR内部核糖体进入位点(IRES)元件(6ATRi)所取代，从而实现生理Nef的表达和功能[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。我们替换了gydF4y2BaLucRgydF4y2Ba分泌NanoLuc®[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba),插入gydF4y2BasNLucgydF4y2Ba6ATRi上游的ORF。复制完成后，sNLuc报告基因被分泌到培养上清中，便于对感染进行动态监测[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。报告基因IMC具有复制能力，并对所有病毒开放阅读帧进行编码，从而允许多轮病毒复制。gydF4y2Ba

质粒描述。gydF4y2BaEnv BaL (Genbank登录号:AY426110.1)的外结构域来源于HIV-1分离物BaL。在前面描述的记者IMC中，pnl - lucr . 6ati - b . bal。星质(gydF4y2Ba74gydF4y2Ba),gydF4y2BaRenilla荧光素酶gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaLucRgydF4y2Ba)被InFusion®(Takara Bio)的可溶性纳米荧光素表达克隆方法所取代gydF4y2BasNLucgydF4y2Ba基因。融合gydF4y2BaNLucgydF4y2Ba基因的n端分泌信号产生分泌的，19.1 kDa, NanoLuc®荧光素酶的形式，secNLuc (Promega，在有限使用标签许可下)。在当前的IMC中gydF4y2BasNLucgydF4y2Ba在NL4-3之间插入IRES卡带gydF4y2BaenvgydF4y2Ba和gydF4y2BanefgydF4y2Ba基因。的gydF4y2BasNLucgydF4y2BaORF位于停止密码子(taa)的下游gydF4y2BaenvgydF4y2Ba和一个Kozak序列(ccacc);它后面是一个26英寸的“间隔”，IRES元素和gydF4y2BanefgydF4y2Ba基因。我们使用的IRES来源于脑心肌炎病毒(EMCV) (GenBank: EMCV IRES, NC_001479)，包含“野生型”(A)。gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba(“6A”)分岔环，包含截断的EMCV IRES片段(“TR”，核苷酸399至833)。原病毒质粒由Christina Ochsenbauer博士(阿拉巴马大学伯明翰分校医学系)生成并提供。gydF4y2Ba

病毒库的制备gydF4y2Ba

仙台病毒(SeV) Cantrell株来源于查尔斯河实验室。gydF4y2Ba

红-绿- hiv (RGH)病毒和ΔINT对照病毒是从NIH艾滋病试剂计划获得的以下病毒分子克隆中生成的:pRGH-WT和pRGH-Integrase D116A (ΔINT)。RGH病毒在CMV启动子的控制下稳定表达mCherry，在HIV高效复制时，在HIV LTR启动子的控制下有条件地表达GFP [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。用Fugene HD转染试剂按10:1的比例用病毒分子克隆和pHEF-VSVg转染HEK293T细胞，生成水泡性口炎病毒G (VSV-G)假型stock。感染后48 h收集含病毒的细胞上清液，在TZM-bl细胞上测定病毒滴度。gydF4y2Ba

NanoLuc HIV病毒库是由Fred Hutchinson癌症研究中心(Seattle, WA)疫苗传染病部的Rena Astronomo博士和合作者制作的。病毒库的生成和病毒传染性的计算所用的方法和试剂已在前面介绍过[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。简而言之，vnl - snluc . 6i - b . bal。用Lipofectamine 2000按照制造商的方案(thermofisher)将原病毒DNA转染293 T/17细胞(ATCC)，生成Ecto报告病毒。转染60 h后收集病毒上清液，1200 × g澄清10分钟，- 70°C冷冻。用Nano-glo荧光素酶(Promega)分析病毒库的纳米荧光素酶表达，并在亚融合TZM-bl细胞(NIH ARP)上进行滴度检测。病毒稀释在DMEM补充1%的边后卫和40µg / ml DEAE-Dextran和添加到细胞4 h。生长培养基(DMEM, 10%的边后卫,笔/喉炎,谷氨酰胺)添加到细胞和培养48 h。细胞单层膜固定(DPBS 0.8%戊二醛、2.2%甲醛)8分钟,染色β牛乳糖表达式(4毫米铁氰化钾,4毫米亚铁氰化钾,400µg / ml氯化镁,400µg / ml半乳糖苷DPBS) 2 h。效价(2.5×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba通过计数表达“蓝色”β-gal的细胞计算PFU/ml。gydF4y2Ba

先天免疫刺激gydF4y2Ba

在先天免疫刺激研究中，细胞以5 × 10的剂量接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba完整的RPMI细胞/ml在12孔板中，在37°C下培养过夜。第二天，细胞用含有人重组IFNβ (Toray Industries)、PMA (Sigma)、离子霉素或仙台病毒(SeV)的培养基处理，其量见图图例。在图图例所示的时间点，收集细胞并收集裂解物用于蛋白质或RNA分析，如下所述。gydF4y2Ba

RNA合成和转染gydF4y2Ba

HCV Con1非刺激性RNA (xRNA)和HCV Con1 pU/UC RNA (PAMP RNA)由T7启动子连接的互补寡核苷酸合成(Integrated DNA Technologies)。所有体外转录的rna在5'端都含有一个5'三磷酸(5'-ppp)和三个鸟嘌呤核苷酸，以增强T7聚合酶的转录。根据制造商的说明，使用T7 RNA聚合酶和T7 MEGAshortscript试剂盒(Ambion)生成RNA产物。体外转录后，用DNA酶处理去除DNA模板，用苯酚-氯仿萃取法从反应混合物中去除未结合的核苷酸和蛋白质。然后按照制造商的描述，用乙醇和乙酸铵沉淀RNA，并在无核酸酶的水中重悬。采用纳米滴分光光度计吸光度法测定RNA浓度。对2%琼脂糖甲醛凝胶变性后的RNA质量进行评价[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]。RNA转染实验，细胞以5 × 10倍的倍率接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在12孔板中培养细胞/ml，在37°C下培养过夜。根据制造商的说明，使用10 pmol RNA和TransIT-mRNA转染试剂盒(Mirus)进行转染。gydF4y2Ba

中存在gydF4y2Ba

为了定量HIV RNA或宿主基因表达，细胞裂解物在RLT中消化，根据制造商的说明使用miRNeasy Micro kit (Qiagen)或miRNeasy Mini kit (Qiagen)提取细胞总RNA，并通过DNAse处理去除残留的基因组DNA。采用NanoDrop 2000分光光度计吸光度法测定RNA浓度。利用iScript Select cDNA Synthesis kit (Biorad)合成cDNA。使用SYBR Green PCR主混合物(ABI)和引物(见附加文件)进行实时定量PCR (qRT-PCR)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(见表S4)，使用QuantStudio软件(Applied Biosystems)的ViiA 7 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)。gydF4y2Ba

对于所有qRT-PCR分析，计算相对于管家基因的ΔΔCt值gydF4y2BaRPL13AgydF4y2Ba对照(未处理或模拟感染)细胞，如图图例所示。计算相对于对照细胞的平均折叠变化(FC)，如图图例所示。每项研究均进行了多个独立实验，所呈现的数据为多个联合独立实验或单个代表性实验的生物重复的平均FC±SD，如图图例所示。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

用RIPA缓冲液(25 mM Tris, HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS)添加1%蛋白酶抑制剂，1%磷酸酶抑制剂和0.1%冈田酸制备全细胞裂解液。以等体积装载10毫克蛋白质，在4-20% Mini-Protean TGX预制凝胶(Biorad)上分离，然后转移到硝化纤维素膜上，在室温下用5% BSA (Sigma)在TBST中阻断1小时。用Cell Signaling Technology公司的一抗:兔(Rb)抗mx1、Rb抗oas1、Rb抗phospho- stat1 Y701、Rb抗stat1、Rb抗stat2、Rb抗phospho- stat3 S727或Rb抗stat3、Rb抗phospho- irf3 S386，在4℃下孵育过夜。还使用了以下一抗:Rb抗mx2 (Novus Bio)、Rb抗ifit1 (Cleveland Clinic赠送)、小鼠(Ms)抗ifitm1 (ProteinTech)、Ms抗actin (Sigma)、Rb抗phospho-JAK1 Y1022/1023 (Abcam)、Rb抗phospho-STAT2 Y689 (Millipore)和Ms抗irf3克隆AR1 [gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]。一抗孵育后，用TBST洗涤印迹，然后与相应的辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗(Jackson Immunoresearch Labs)在室温下孵育1小时，TBST洗涤印迹，然后用化学发光试剂盒(ThermoFisher)检测靶蛋白，使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad)和Image Lab Software (Bio-Rad)成像。用ImageJ软件定量靶蛋白相对于肌动蛋白的丰度。gydF4y2Ba

流式细胞术分析gydF4y2Ba

流式细胞术检测未刺激细胞株上IFNAR表面表达。细胞收集于epppendorf管中，在冷FACS缓冲液(含2% FBS和0.02%叠氮化钠的PBS)中洗涤一次，然后用小鼠抗ifnar 4G8抗体(Sigma)或纯化的小鼠IgG2a K同型对照(BioLegend)染色30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤2次，用大鼠抗小鼠IgK轻链APC-Cy7二抗(BD Biosciences)孵育30 min。细胞用冷FACS缓冲液洗涤2次，然后用0.05 μg/ml DAPI (ThermoFisher)染色10 min。细胞在DPBS中洗涤3次，然后在FACS缓冲液中重悬。数据在Canto RUO细胞仪(BD Biosciences)上获取，并使用FlowJo软件(FlowJo LLC)进行分析。gydF4y2Ba

IRF3核易位的ImageStream分析gydF4y2Ba

在仙台病毒感染(100 HAU/ml, 24 h)后，使用ImageStreamX技术在细胞系中测量IRF3的核定位。gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]。短暂,细胞在PBS洗,固定和permeabilized使用BD Cytofix / Cytoperm kit /制造商的指令(BD生物科学),然后沾着鼠标单克隆anti-IRF3 AR1抗体在冰上30分钟。细胞与PBS + 0.1%叠氮化钠洗两次,然后沾AF647 anti-mouse二级抗体在冰上30分钟。与PBS + 0.1%叠氮化钠,细胞被洗沾0.05μg / ml DAPI (ThermoFisher) 10分钟,洗两次与叠氮化钠PBS + 0.1%,然后用50 μl Perm/Wash (BD Biosciences)重悬，用Annis ImageStreamX Mk II成像细胞仪分析。IRF3表达和DAPI细胞核在每个样本的20000个细胞中被测量，并使用IDEAS软件(Luminex)确定任意截止点以上的表达相似性，如图补充图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba

大部分RNA-seqgydF4y2Ba

如图图例所示，Jurkat和JLat9.2细胞用细胞培养基处理4小时(模拟)或100 IU/ml IFNβ处理4、8或12小时。细胞在RLT缓冲液中消化，然后使用miRNeasy Micro kit (Qiagen)提取RNA，如上所述。使用LabChip GXII (PerkinElmer)仪器和基于核糖素的RNA检测分别测定回收RNA的质量和浓度。使用KAPA搁浅mRNA-seq试剂盒(Roche, Indianapolis, IN)按照制造商推荐的方案构建mRNA-seq文库。文库在Illumina NextSeq500测序仪上测序，使用Illumina NextSeq 500/550 High Output v2试剂盒(150循环)，按照制造商的样品处理和上样方案进行测序。使用Illumina的BaseSpace平台可视化测序运行指标以保证质量，使用FastQC 0.11.3版(gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqcgydF4y2Ba)。使用cutadapt以数字方式删除适配器，版本1.8.3 [gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]。随后，将原始RNA-seq读数解复用，用FastQC v0.11.5检查质量[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]，核糖体RNA读取用bowtie2 v2.3.4进行数字去除[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。然后用STAR v2.4.0h1将Reads映射到人类基因组(GRCh37) [gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]，导致每个样本至少有2000万个唯一映射读取。用htseq-count v 0.6.1p1定量基因计数[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba指定- strand = reverse和-mode = intersection-nonempty。使用RStudio v1.2.1335将基因计数加载到R统计编程语言(v4.0.0, R Core Team 2020)中。我们首先去除所有样本中平均原始计数少于10的基因，留下13849个基因用于分析。然后通过在edgeR中实现的M值的修剪平均值将计数归一化，并使用limma包的oom函数将计数转换为每百万log2计数[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba]。然后对样品进行主成分分析，并用ggplot2 v3.3.2将结果可视化[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]。所有差异表达分析均采用limma进行。为了评估Jurkat和JLat9.2模拟样本之间的功能差异，使用WebGestaltR进行基因集富集分析(GSEA) [gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]。通过limma计算的降序t统计值对基因进行排序，并测试KEGG通路和非冗余基因本体数据库之间的富集程度。我们设计了对比基质来测试相对于模拟(例如Jurkat IFNβ 4小时- Jurkat mock 4小时)，并在考虑基线差异的同时直接比较细胞系(例如[(Jurkat IFNβ 4小时- Jurkat mock 4小时)- (JLat9.2 IFNβ 4小时- JLat9.2 mock 4小时)])。如果在至少一个比较中绝对Fold Change > 1.5且benjamin - hochberg校正p值< 0.05，则认为该基因存在差异表达[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]。将所有差异表达基因的结合分为共表达模块(ward)。D聚类，欧氏距离)与WGCNA [gydF4y2Ba90gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]和绘制热图这些模块上传到匠心路径分析软件[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]来评估共表达基因之间的途径富集和上游调控因子。gydF4y2Ba

RGH病毒感染和FACS分选gydF4y2Ba

Jurkat细胞以5 × 10的浓度接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞于6孔板中添加4 μg/ml聚酰胺的完整RPMI中，用HEK-293 T条件培养基(模拟)或vsv伪RGH病毒培养基(MOI 0.2)在500×G上孵育1.5 h。细胞培养24小时，用DPBS洗涤两次，然后在完全RPMI中再培养4天，以建立潜伏期。感染细胞在FACS缓冲液(DPBS + 2% FBS + 0.02%叠氮化钠)中洗涤，用0.05 μg/ml DAPI (ThermoFisher)染色，鉴定死亡细胞，并在FACSAria II细胞仪(BD Biosciences)上根据mCherry和GFP表达进行筛选。分选后的细胞在完全RPMI中重悬，3 × 10次接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ml, 0.5 ml, 12孔板，培养过夜，然后用100 IU/ml IFNβ刺激8 h或用10 nM PMA和1 μM离子霉素重新激活24 h。gydF4y2Ba

NanoLuc HIV感染和ART对原发CD4 + T细胞的抑制gydF4y2Ba

纯化的CD4 + T细胞在10℃解冻培养gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ml在完整的RPMI培养基中培养5天，培养基中添加了有助于稳态增殖和HIV易感性的细胞因子:20 U/ml IL-2, 10 ng/ml IL-7和50 ng/ml重组人IL-15(均来自Peprotech)。然后以2 × 10的浓度接种CD4 + T细胞gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ml于6孔板中，用完整的RPMI培养基(模拟对照)或NanoLuc HIV (MOI 1.0或2.0，见图图例)在2400 rpm下旋压2小时。细胞用RPMI洗涤三次，并在T25瓶中添加20 U/ml IL-2、10 ng/ml IL-7和50 ng/ml IL-15的完整RPMI中培养24 h。然后用含有10 μM Raltegravir (NIH AIDS Reagent Program)和1 μM Efavirenz (NIH AIDS Reagent Program)的ART治疗抑制HIV复制7天。在ART抑制的一周内，每两天将细胞洗涤并在新鲜培养基、细胞因子和ART中重悬。提取等量上清液并在整个抗逆转录病毒治疗过程中冷冻以监测抗逆转录病毒抑制。为了确定感染细胞的百分比，从抗逆转录病毒治疗前(感染后24小时)和抗逆转录病毒治疗后(感染后8天)的细胞中分离基因组DNA，并通过ddPCR测量HIV拷贝数/细胞(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3)。在感染后8天，抑制细胞以5 × 10的剂量接种于12孔板gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ml完全RPMI +细胞因子±ART，并给予或不给予100 IU/ml IFNβ。在IFNβ处理后8小时，将细胞固定在甲醇中进行单细胞测序分析，或收集裂解物进行qRT-PCR或免疫印迹分析。在8 dpi下的再激活研究中，抑制细胞以5 × 10的剂量接种于12孔板中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ml完整RPMI +细胞因子±ART, 10 nM PMA和1 μM iononomycin处理24 h，然后收集裂解物进行qRT-PCR分析。gydF4y2Ba

荧光素酶报告试验gydF4y2Ba

样品置于室温下，每个样品20µl与20µl 1X Nano-Glo®荧光素酶测定试剂(Nano-Glo®luciferase assay System, Promega)在白色平底聚苯乙烯96孔板(康宁，Sigma-Aldrich)中混合。混合物在黑暗中孵育10分钟，在MLX 96孔板发光计(1秒/孔，读取高度:1毫米，Dynex Technologies)上读取发光，并以相对光单位(RLU)报告。gydF4y2Ba

HIV-1前病毒DNA的液滴数字PCR分析gydF4y2Ba

为了量化每个感染细胞的HIV基因组数量，我们使用液滴数字PCR (ddPCR)检测HIV gag基因。使用PureLinkTM基因组DNA迷你试剂盒(Thermo Fisher Scientific)从冷冻细胞颗粒中纯化基因组DNA，遵循制造商的说明。每个样品的DNA浓度使用NanoDrop™One-W (Thermo Scientific)进行测定。每次反应使用5µl未稀释和/或1:10稀释的gDNA。为了使总基因组DNA归一化并估计每次反应的细胞数量，我们使用特异性fam共轭引物/探针测定(cyclophilin A;检测ID: Hs.571 PT.58v.38887593.g;FAM公司/禅/ 3 iabkfq配置)。为了扩增HIV gag区，我们使用了以下引物和探针:gag感5 ' GACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA 3 ';Gag反义5 ' ctaattctcccccgcttaataytgacg3 ';Gag探针5 ' HEX AT + G + GGT + GC + GAGA/3BHQ_1 3 '，其中“+”表示锁定核酸，BHQ表示3 ' Black quencher©-1 [gydF4y2Ba93gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

ddPCR反应在22µl的混合物中进行，其中含有11µl 2X ddPCR Supermix for Probes (BioRad)， 1.1µl 20X六氯荧光素(HEX) HIV gag特异性Taqman assay (Integrated DNA Technologies)， 1.1µl 20X 6-羧基荧光素(FAM)标记的PPIA目标qPCR assay和基因组DNA。将每个组装好的ddPCR反应混合物一式两份装入八通道一次性液滴产生筒(BioRad)的孔中，并加入液滴产生油(BioRad)。生成液滴后，样品在常规热循环仪(C1000, Biorad)上扩增至96孔PCR板，条件如下:在95°C下变性/酶活化10分钟，在94°C下变性30秒，在60°C下退火/扩增60秒，40个循环，然后在98°C下孵育10分钟。PCR后，在QX100液滴读取器(BioRad)上读取液滴。采用qantasoft分析软件1.3.1.0 (BioRad)对ddPCR数据进行分析。加入含有ddPCR反应混合物但不含cDNA的非模板对照孔和模拟感染对照，以调整反应阈值。gydF4y2Ba

单细胞RNA-seq:细胞制备gydF4y2Ba

纯化的CD4 + T细胞解冻，用细胞因子激活，感染NanoLuc HIV，用ART抑制7天，然后用100 IU/ml IFNβ刺激8小时。IFNβ刺激后8 h，用冷PBS洗涤细胞2次，然后用台斑蓝排斥法评估细胞活力。活细胞悬液调整为5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ml加入200 μl冷PBS中，再缓慢加入800 μl冷甲醇。甲醇固定细胞保存在- 20°C，等待进一步的样品处理。2周后，将固定的细胞解冻，离心，去除上清，再悬于补液缓冲液中(SSC缓冲液中添加1% BSA, 20 U/μl Superasein, 1 M DTT)。将单细胞悬液稀释至1000个细胞/µl，用于单细胞RNAseq。gydF4y2Ba

单细胞RNA-seq:文库制备和测序gydF4y2Ba

按照生产商说明书(10 × Genomics)进行单细胞RNA测序。将单细胞悬浮液加载到铬单细胞芯片G上，每个样品的目标捕获率约为8000个细胞。从聚腺苷化的mrna中提取的条形码全长cdna通过反转录得到凝胶珠状乳液(GEMs)。使用Chromium Controller (10 × Genomics)同时处理给定供体的所有样品，以产生纯化的cDNA。使用Chromium Next GEM单细胞3’Reagent kit v3 (10 × Genomics)从10µl cDNA中制备索引文库。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent)评估文库和cDNA质量，使用ViiA 7 Real-Time PCR系统(ThermoFisher)定量。构建的文库在Illumina NextSeq 500/550 High Output v2试剂盒(Illumina)上测序。每个样本的测序深度为每个细胞40,000个reads。gydF4y2Ba

单细胞RNA-seq:数据处理和分析gydF4y2Ba

使用CellRanger v4.0.0将单细胞reads与hg19基因组对齐[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba]。在hg19基因组中，我们整合了HIV-1载体PNL4-3 (GenBank AF324493.2)，并计算了映射到HIV的读取数。我们使用Seurat 3.2.3进行归一化，执行降维(UMAPs)，并识别差异表达基因[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]。使用Seurat，我们从分析中过滤出检测到的基因少于200个或大于2500个且线粒体DNA百分比大于10%的细胞。如果细胞至少有一个读取映射到HIV基因组(一个UMI计数)，则将其分类为HIV +。通过Seurat使用MAST进行差异基因分析[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba，gydF4y2Ba97gydF4y2Ba]，显著差异表达基因的绝对对数倍变化gydF4y2Ba≧gydF4y2Ba1.2，调整后P值小于0.05。利用非冗余生物过程基因本体术语对病毒诱导基因进行过表示分析(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)使用基于web的基因集分析工具包(gydF4y2Bahttp://www.webgestalt.orggydF4y2Ba)。使用Monocle3/Garnett方法将细胞分为T细胞亚型[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba使用附加文件中列出的标记gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S7b。使用R内的lm()函数进行线性回归模型，并使用ggplot2绘制。此分析的代码可从以下网址获得:gydF4y2Bahttps://github.com/galelab/Olson_Latent_HIV_InfectiongydF4y2Ba。gydF4y2Ba

量化和统计分析gydF4y2Ba

qRT-PCR分析及蛋白丰度定量采用Prism 8.0软件(GraphPad)进行统计检验。数据以数值±标准差(SD)表示。统计显著性采用双尾多重比较Student's t检验(Holm-Sidak后验检验)或多重比较的双向方差分析(Holm-Sidak后验检验)确定，如图图例所示。对于这些检验，p < 0.05被认为具有统计学意义。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。对于bulk RNA-seq和scRNA-seq分析，使用RStudio v1.2.1335 (R Core Team)进行统计分析，方法见相应章节。在本研究中，n被定义为单个代表性实验中独立的、非技术性的生物重复的数量，或者是数据集中包含的独立实验的数量，详见图例。gydF4y2Ba

本研究中分析的数据集可应通讯作者的合理要求提供。转录组数据集可通过基因表达综合数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)，检索号为GSE174380(散装RNA测序)和GSE176386(单细胞RNA测序)。单细胞RNA测序分析代码可从以下网址获得:gydF4y2Bahttps://github.com/galelab/Olson_Latent_HIV_InfectiongydF4y2Ba。gydF4y2Ba

艺术:gydF4y2Ba

抗逆转录病毒疗法gydF4y2Ba

巨细胞病毒:gydF4y2Ba

巨细胞病毒gydF4y2Ba

DDE:gydF4y2Ba

微分表达式的微分gydF4y2Ba

ddPCR:gydF4y2Ba

液滴数字聚合酶链反应gydF4y2Ba

德:gydF4y2Ba

微分表达式gydF4y2Ba

EMCV:gydF4y2Ba

脑心肌炎病毒gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

艾滋病毒:gydF4y2Ba

人类免疫缺陷病毒1型gydF4y2Ba

干扰素:gydF4y2Ba

干扰素gydF4y2Ba

IRF3:gydF4y2Ba

干扰素调节因子3gydF4y2Ba

研究小组:gydF4y2Ba

干扰素刺激基因gydF4y2Ba

LTR:gydF4y2Ba

长端重复gydF4y2Ba

NanoLuc艾滋病毒:gydF4y2Ba

分泌型纳米荧光素酶报告基因人类免疫缺陷病毒1gydF4y2Ba

PAMP时:gydF4y2Ba

病原体相关分子模式gydF4y2Ba

PRR:gydF4y2Ba

病原体识别受体gydF4y2Ba

RGH:gydF4y2Ba

红绿hiv - 1gydF4y2Ba

RNA-seq:gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

ScRNA-seq:gydF4y2Ba

单细胞RNA测序gydF4y2Ba

塞:gydF4y2Ba

仙台病毒gydF4y2Ba

猴免疫缺陷病毒:gydF4y2Ba

猿猴免疫缺陷病毒gydF4y2Ba

VSV病毒:gydF4y2Ba

水泡性口炎病毒gydF4y2Ba

我们感谢Rena Astronomo博士准备了本研究中使用的nanolac - hiv病毒库，感谢Allison Kell博士制作了XRNA和PAMP合成rna。我们也感谢Michelle Carlson协助处理大量RNA-seq样品，以及Michele Black协助ImageStreamX数据收集和分析。gydF4y2Ba

本出版物中报道的研究由美国国立卫生研究院资助R01AI127563, R01AI118916和P51 OD010425 (MG)以及Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖资助T32 AI07140 (RO)支持。这项工作也得到了美国国立卫生研究院国家促进转化科学中心的支持，奖励号为KL2 TR002317 (GG)。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 华盛顿大学医学院免疫学系先天免疫与免疫疾病研究中心，美国华盛顿州西雅图市gydF4y2Ba

   丽贝卡·m·奥尔森、琳恩·s·惠特莫尔、丹·纽豪斯、詹妮弗·蒂松西克-戈、伊莉斯·史密斯和小迈克尔·盖尔gydF4y2Ba

2. 美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心疫苗和传染病部gydF4y2Ba

   Germán Gornalusse, Christina Ochsenbauer和Florian HladikgydF4y2Ba

3. 美国华盛顿州西雅图市华盛顿大学妇产科gydF4y2Ba

   Germán Gornalusse & Florian HladikgydF4y2Ba

4. 美国华盛顿州西雅图市华盛顿大学医学系gydF4y2Ba

   Florian HladikgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

RMO和MG设计了这项研究。RMO和GG进行了实验和数据分析。JTG建立单细胞测序cDNA文库。ES进行测序。DN分析了大量RNA测序数据。LW分析了单细胞RNA测序数据。FH和CO提供原代CD4 + T细胞和Nanoluc HIV病毒库。RMO写了手稿。MG, FH, GG, JTG, DN, LW编辑稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba小迈克尔·盖尔gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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