SAMHD1在静止CD4中限制HIV-1逆转录⁺t细胞

背景

静CD4⁺由于逆转录受阻，T淋巴细胞对HIV-1感染高度难抗。

结果

SAMHD1在外周血淋巴细胞中的表达检测表明，SAMHD1在CD4+和CD8+ T细胞中的表达水平与骨髓细胞相当。用含有Vpx的病毒样颗粒(VLP)处理CD4+ T细胞会导致SAMHD1表达的丢失，这与HIV-1感染的许可性增加和逆转录病毒DNA的积累有关，而不促进病毒LTR的转录⁺来自Aicardi-Goutières综合征患者的t细胞在SAMHD1基因显示对HIV-1感染的易感性增加，而vlp - vpx治疗并没有进一步增强。

结论

在这里，我们发现SAMHD1是阻止非循环静息CD4有效合成病毒DNA的限制因子⁺t细胞。这些结果强调了SAMHD1在介导抑制静止CD4中HIV-1感染的关键作用⁺t细胞，可能会影响我们对HIV-1介导的CD4的理解⁺t细胞衰竭和病毒库的建立，这是艾滋病的两个标志。

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)主要感染CD4⁺t细胞。激活的淋巴细胞支持病毒复制，非循环的CD4静止⁺t细胞允许HIV-1进入，但不允许有效和完全的逆转录[1- - - - - -6］．然而，在未受刺激的淋巴细胞培养物中加入脱氧核苷可部分克服这一失败[7- - - - - -9]，表明静止t细胞中脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)供应不足可能(至少在一定程度上)导致病毒DNA合成效率低下[8，10］．有趣的是，Aicardi-Goutières综合征基因产物SAMHD1最近被描述为阻止HIV-1感染非循环髓系细胞的限制因子[11- - - - - -13］．SAMHD1是一种dgtp依赖性脱氧核苷酸三磷酸水解酶[14- - - - - -16]可将分化的非循环髓系细胞中dNTPs的细胞池降低到支持HIV-1 DNA合成所需的水平以下[15，17］．然而，SAMHD1在髓系细胞之外的活性谱仍不清楚。

我们首先确定了SAMHD1是否在健康献血者的外周血淋巴细胞中表达。Western blot分析显示两者均CD4⁺和CD8⁺t细胞表达SAMHD1(图1a). SAMHD1在未受刺激CD4细胞中的表达水平⁺t细胞与骨髓细胞中发现的t细胞相似，包括CD14⁺单核细胞，单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)和单核细胞来源的树突状细胞(MDDC)(图1a).此外，流式细胞术分析显示所有循环CD4⁺t细胞亚群，包括naïve (Tn;CD45RA⁺, CCR7⁺)、中央存储器(Tcm;CD45RA^-, CCR7⁺)和效应记忆细胞(Tem;CD45RA^-, CCR7^-)，表达高水平的SAMHD1(图1b)，提高了SAMHD1影响静息CD4敏感性的可能性⁺淋巴细胞导致HIV-1感染。

为了验证这一假设，我们将未受刺激的外周血单个核细胞(pbmc)暴露于含有SIV附属蛋白Vpx的病毒样颗粒中_mac251(VLP-Vpx)，通过触发其蛋白酶体降解来抵消samhd1介导的限制[12，13］．流式细胞术检测经VLP-Vpx或空VLP-Mock处理的pmcs中SAMHD1的表达。平均16%的VLP-Vpx处理静息CD4⁺暴露后96小时t细胞SAMHD1阴性(图1c)，而大多数单核细胞(90.2%)在VLP-Vpx处理48小时后失去了SAMHD1的表达(附加文件1:图S1)。静态CD4中vpx介导的SAMHD1缺失的差异⁺t细胞和单核细胞可能源于核/细胞质交换的差异[18］．事实上，我们最近已经证明，vpx介导的SAMHD1降解需要其核输出[19，20.］．为了支持这一假设，在超过80%的t细胞受体(TCR)刺激的CD4细胞中观察到SAMHD1表达的缺失⁺表达Vpx的淋巴细胞(图1d).接下来，我们评估了SAMHD1缺失对静息CD4的hiv -1抗性表型的影响⁺t细胞。静止t细胞中HIV-1复制的限制归因于逆转录步骤和病毒基因表达的阻断(例如:缺乏病毒转录所需的NF-kB和CyclinT等转录因子)[21，22］．因此，为了绕过转录阻断，我们使用基于HIV-1的慢病毒载体在CMV启动子(HIV-CMV-EGFP)的转录控制下携带EGFP盒进行了单轮感染实验。从健康供体分离的未刺激的pbmc暴露于VLP-Vpx或VLP-Mock 12小时，随后感染HIV-CMV-EGFP。正如预期的那样，当细胞被VLP-Mock处理时，没有检测到EGFP(图2a)，而VLP-Vpx处理导致EGFP在静止状态下表达(HLA-DR^-、CD69^-) CD4⁺t细胞(图2a).平均14%的VLP-Vpx处理静息CD4⁺T淋巴细胞表达EGFP，而暴露于VLP-Mock的细胞中只有不到1%的细胞表达EGFP+(图2a和附加文件1:图S2a)。作为对照，VLP-Vpx处理增强了CD14的允许性⁺单核细胞到HIV-CMV-EGFP(附加文件1:图S3b)。这些结果表明，Vpx可以缓解未受刺激的t细胞进入HIV-1感染后的阻滞。重要的是，VLP-Vpx治疗与CD4无关⁺t细胞激活(附加文件1:图S2c)或增殖(图S2c)2b). Vpx增加了非周期静止t细胞的易感性(eFluor^高)(图2b)而它对激活的分裂t细胞的允许性没有影响(eFluor^低)尽管SAMHD1的高级别表达式(附加文件1:图S2d)。此外，Vpx增加了所有静息CD4细胞的HIV-1感染⁺T亚群，包括高度难熔的naïve细胞(Tn)(图2c)。

然后，我们将注意力集中在病毒逆转录上，这是在大多数HIV-1暴露的t细胞亚群中启动的[6］．然而，在静息的CD4+ t细胞中完成这一步的速度要慢得多[1- - - - - -6］．我们询问SAMHD1是否负责静止t细胞中的高效逆转录阻断，因为它已被证明用于骨髓细胞[13，17］．pbmc暴露于VLP-Vpx或VLP-Mock，并感染HIV-CMV-EGFP。在未受刺激的CD4+ t细胞中，通过定量PCR测定了导致产生全长HIV-1 DNA的逆转录动力学。我们观察到，与VLP-Mock处理的对应物相比，Vpx处理的静息CD4+ t细胞中导致产生全长病毒DNA的逆转录的数量和速率都有所增强(图2)2d).这些结果表明VLP-Vpx克服了HIV-CMV-EGFP感染对静息CD4的限制⁺t细胞通过促进完整的反向转录本的积累。接下来，我们验证了Vpx观察到的效果是否适用于野生型HIV-1。为此目的，用VLP-Mock或VLP-Vpx处理未受刺激的pbmc，随后用表达EGFP的HIV-1感染(HIV-EGFP)(图2e).感染后，我们在VLP-Mock和vlp - vpx处理的静息CD4细胞中均未检测到显著的EGFP表达⁺t细胞(图2e和附加文件1:图S3a)。这与与其静止状态相关的HIV-1 LTR转录阻断相一致，并证实所分析的CD4+ t细胞确实处于静止状态。作为对照，VLP-Vpx增强了CD14对HIV-EGFP的允许性⁺单核细胞群(图2e和附加文件1:图S3a)。排除了潜在的传染性缺陷，因为tcr介导的t细胞激活有效地诱导了EGFP的表达(附加文件)1:图S3b)。有趣的是，虽然在静息的CD4+ t细胞中没有检测到EGFP阳性细胞，但在VLP-Vpx处理的细胞中观察到HIV-1全长DNA的积累(图2e).因此，Vpx促进静息CD4+ t细胞感染后全长病毒DNA的积累，但不能缓解病毒基因表达所需的转录阻滞。Vpx促进感染的能力在另一个静息淋巴细胞模型中得到进一步证实(附加文件)1:图S4)。纯化的CD4+ T细胞被PHA激活，并在IL-2中培养14-20天，直到CD69和Ki67激活标记消失[23］．用VLP-Vpx处理这些细胞会导致SAMHD1在很大一部分细胞中丢失，并且它们对HIV-CMV-GFP感染的敏感性增加了6倍(附加文件)1:图S4)。重要的是，大多数感染的egfp阳性细胞是在samhd1阴性细胞亚群中发现的(附加文件1:图S4)。综上所述，这些结果表明Vpx通过SAMHD1作用，促进静止淋巴细胞中完全逆转录病毒DNA的积累，从而促进静息CD4+ t细胞的感染。

为了证实SAMHD1在Vpx克服静止CD4+ t细胞中HIV-1限制的能力中的作用，我们使用了从4名Aicardi-Goutières综合征患者中分离出来的pmcs，这些患者在CD4+ t细胞中存在纯合失活突变SAMHD1基因(AGS-5，简称SAMHD1^-/-) [24］．杂合子供体SAMHD1突变(称为SAMHD1^-/+)作为对照。我们首先评估了未受刺激的内在易感性SAMHD1^-/-而且SAMHD1^-/+CD4+ t细胞对HIV-CMV-EGFP感染的影响。而杂合缺失SAMHD1没有影响未受刺激的PBMCs对HIV-CMV-EGFP感染的内在抗性，纯合子缺失增加了静止CD4+ t细胞和单核细胞的易感性(图3.a, b, c)，表明SAMHD1在静息CD4+ t细胞中介导HIV-1限制是必需的。值得注意的是，VLP-Vpx处理并没有进一步增强小鼠的允许性SAMHD1^-/-静息CD4+ t细胞(图3.b, d).然而，的限制性表型SAMHD1^-/+VLP-Vpx给药后，细胞的细胞活性得到缓解(图3.a, d)，表明SAMHD1是Vpx克服HIV-1在t细胞中的限制所必需的。总的来说，这些结果表明SAMHD1在非循环静息CD4中是一个有效的HIV-1限制因子⁺淋巴细胞。

SAMHD1在静止的CD4+ t细胞中限制HIV-1复制的证明可能对我们理解HIV-1介导的CD4+ t细胞耗损和病毒库的建立具有重要意义，这是HIV/艾滋病的两个特征。最近研究表明，静息CD4+ t细胞中流产的HIV-1逆转录导致细胞质病毒核酸的积累，从而触发宿主防御程序，引发协调的促凋亡和促炎症反应[25，26］．通过阻止静止CD4逆转录的完成⁺t细胞，SAMHD1可以促进它们的消耗。HIV-1储存库，主要由静止的CD4组成⁺t细胞含有整合的沉默原病毒，是通过抗逆转录病毒疗法根除病毒的主要障碍。最近的研究表明，趋化因子可以促进静息CD4中HIV-1复制的早期步骤⁺t细胞，导致延迟[27］．确定趋化因子是否在体内调节SAMHD1活性并促进潜伏感染细胞的生成将是重要的。SAMHD1活性的调控仍然是一个重要的研究领域。在这方面，我们观察到SAMHD1的限制性内切活性与其表达水平无关。的确，尽管SAMHD1的表达与CD4的激活状态无关⁺t细胞，其限制活动仅当细胞处于静止状态(附加文件1:图S2a和S2d)。SAMHD1活性可以通过翻译后修饰和/或通过非周期细胞(包括静止CD4)中细胞伙伴的表达进行调控⁺t细胞。此外，SAMHD1的活性也可以通过缺乏酶活性的剪接变体的表达来调控[28］．考虑到dN的供应只能部分地挽救静止CD4+ t细胞中的HIV-1逆转录，人们可以问，SAMHD1施加的限制是完全还是部分由于其dNTP三磷酸水解酶活性。有趣的是，最近的研究表明，SAMHD1是一种核酸结合蛋白，它表现出对RNA而非DNA的偏好[29］．需要进一步的研究来阐明SAMHD1在静息CD4+ t细胞中限制HIV-1的机制。破译HIV-1和SAMHD1之间的功能相互作用将有助于更好地理解这种病毒对免疫系统的损害以及艾滋病的发展。

细胞提取和western blot分析

CD14⁺和CD4⁺用CD14纯化t细胞⁺或CD4⁺t细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)。CD14⁺在制备全细胞提取物(WCE)前，用VLP-Vpx处理单核细胞2小时。用含0.5% Triton X-100、150 mM NaCl、10 mM KCL、1.5 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、10 mM β-巯基乙醇、0.5 mM PMSF的缓冲液制备WCE。细胞裂解物在SDS样品缓冲液中煮沸，并在SDS- page凝胶(Biorad)上溶解。在100 V下90分钟，蛋白质在转移缓冲液(20%甲醇，25 mM Tris, 192 mM甘氨酸，0.037% SDS)中液体转移(Biorad)到硝化纤维膜。使用以下抗体进行Western blotting:小鼠抗samhd1 (Abcam #AB67821)和兔抗erk1 /2 (Cell Signaling Technology)。

免疫荧光

纯化CD4⁺用抗cd3、抗cd28和IL-2刺激t细胞3天，并用表达Vpx的逆转录病毒构建物转导[13］．转导两天后，细胞被收集并固定在含有4%多聚甲醛和2%蔗糖的PBS中，并用0.5% Triton X-100、20 mM Tris (pH 7.6)、50 mM Nacl、3 mM MgCl2和300 mM蔗糖渗透。洗涤和抗体培养步骤在pbs -0.1%吐温中进行。细胞用Anti-SAMHD1 (Abcam #AB67821)染色，Vpx用anti-HA (Covance)染色。二抗购自Invitrogen公司。用DAPI在固定介质(vectasshield;矢量实验室)和图像收集在一个蔡司Axioimager apotomome。

质粒

SIV3⁺是由N. Manel提供的。SIV-是鲁班的礼物。HA-Vpx_mac251在pOz-IL2Rα表达载体中亚克隆。pHRET是由C. metttling提供的。pBR-NL4-3-IRES-EGFP是F. Kirchhoff的礼物。psPAX2包装质粒来源于Addgene (D. Trono)。MMLV包装质粒、A-MLV包膜和pMD2-G VSV-G包膜已有报道[13］．

类病毒粒子(VLP)和病毒生产

使用标准的磷酸钙转染方案从293 t细胞中产生VLPs和病毒颗粒。对于VLPs，用8 μg SIV3转染293 t细胞⁺2 μg pMD2-G VSV-G编码质粒(VLP-Vpx)或8 μg SIV-和2 μg pMD2-G (VLP-Mock)。转染16 h后更换培养基，48 h后收获VLPs，以0.45 μm过滤，超离心浓缩100次。在病毒生产方面，通过转染10 μg pBR-NL4-3-IRES-EGFP和1 μg pMD2-G产生HIV-EGFP。通过转染5 μg pHRET、5 μg psPAX2包装载体和2.5 μg pMD2-G获得HIV-CMV-EGFP。对于MLV转导颗粒，用5 μg pOz HA-Vpx转染293个t细胞_mac2512.5 μg MMLV包装质粒，2.5 μg A-MLV包膜编码质粒。必要时，用酶联免疫吸附试验(Innogenetics)测定p24浓度。

感染

通过Ficoll梯度(Eurobio)从血液样本中分离出pmcs，在VLP- Vpx存在下培养12 h_mac251或VLP-Mock，密度为每孔200万个细胞(24个孔板)，添加300 μl 10% FCS补充完全RPMI (R10) (Invitrogen)。分别加入R10稀释HIV-CMV-EGFP (1 μg) 300 μl或HIV-EGFP (800 ng)感染4 d后分析。作为对照组，TCR刺激的pmcs在平板结合抗cd3抗体(5 μg/ml) (Miltenyi Biotec)上培养3天，同时加入1 μg/ml抗cd28抗体和IL-2 (20U/ml) (Roche)，并感染HIV-CMV-EGFP (1 μg)或HIV-EGFP (800 ng) 2天，然后进行分析。采用TCR刺激的pmcs滴定法确定最佳病毒接种量。或者，解冻后，进行台盼蓝活力评估和TURBO^TM在37°C下进行DNase (Ambion)处理1小时，并在上述条件下进行冷冻保存的pmcs培养。

流式细胞术

非循环，静止CD4⁺使用以下抗体和染料分析t细胞和单核细胞:Brilliant-Violet421抗cd3 (UCHT1)， PeCy7抗cd4 (RPA-T4)， PE抗cd69 (FN50)， APC抗hla - dr (TU36)， V500抗cd14 (M5ED)， PeCy7抗ccr7 (3D12)， PE抗cd45ra (HI100) (BD Biosciences)， PerCP抗cd45 (5B1) (Miltenyi Biotec)，细胞增殖染料eFluor®670 (eBiosciences)和Alexa-488抗samhd1 (I-1918) (O. Schwartz)。细胞使用MACSQuant分析仪(Milteny Biotec)进行分析。数据分析在FlowJo (TreeStar inc .)上进行。

病毒全长DNA的定量

在感染之前，用100U/ml TURBO在37°C下处理病毒储存1小时^TMDNase (Ambion)。pbmc (2 × 10⁶细胞)感染1000 ng HIV-CMV-EGFP或热灭活HIV-CMV-EGFP。CD4⁺通过消耗非CD4细胞从培养的pmcs中纯化t细胞⁺t细胞，使用CD4⁺t细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)(平均纯化率97%)。使用QIAmp DNA血液微型试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。引物在5'LTR-U5和中退火，通过定量PCR进行病毒DNA的全长定量呕吐地区。用SYBR Green (Qiagen)进行PCR检测。扩增在LightCycler480 (Roche)中进行。使用比较CT法(2ΔΔCT)将技术重复项的平均值归一化至GAPDH水平。

静息后活化CD4+ T细胞的制备及慢病毒载体转导

CD4+ T细胞经上述阳性选择分离(Miltenyi Biotec)。用1ug/ml植物血凝素(PHA)和100u /ml白细胞介素2 (IL-2)激活静息CD4+ T细胞，在含有IL-2的新鲜培养基中培养14 ~ 20天[23］．pe偶联CD69和fitc偶联Ki67 (BD Pharmingen)染色后，每隔几天用流式细胞仪监测激活状态。静息后活化细胞用Vpx-VLPs或Mock-VLPs处理3小时，清洗后与HIV-CMV-EGFP孵育过夜。第二天，细胞被清洗并在含有IL-2的新鲜培养基中培养96小时。流式细胞术检测EGFP阳性和SAMHD1阴性细胞的百分比。

我们感谢Rosemary Kiernan和分子病毒学实验室的成员对手稿的批判性阅读。我们感谢蒙彼利埃里约热内卢成像设备(MRI)为显微实验提供了足够的环境。我们感谢Clément Mettling为我们提供用于HIV-CMV-EGFP生产的pHRET。这项工作得到了ERC (250333)， Sidaction (fonds de dotation Pierre Bergé)， ANRS和FRM“équipe labéllisée”对MB的资助。BD得到了ERC奖学金的支持;ANRS的AC, SIDACTION的NL和MESR的YA, liliane Bettencourt和FRM奖学金。OS实验室的工作得到了ANRS、Sidaction、Areva、Labex IBEID计划、Areva和疫苗研究所的支持。DA得到了ANRS的支持。

作者及隶属关系

1. 法国蒙彼利埃病毒学实验室Moléculaire，法国蒙彼利埃，Génétique人类研究所，CNRS UPR1142

   Benjamin Descours, Alexandra Cribier, Christine Chable-Bessia, Ahmad Yatim, Nadine Laguette和Monsef Benkirane

2. 英国曼彻斯特大学医学遗传学学术单位

   吉莉安·赖斯和亚尼克·克劳

3. 巴斯德研究所，病毒和免疫部门，URA CNRS 3015，法国巴黎

   戴安娜·艾茵德和奥利维尔·施瓦茨

相应的作者

对应到本杰明Descours或Monsef Benkirane．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

BD完成了大部分实验。AC和CCB，进行了一些实验。OS和DA设计并执行了附加文件中所示的实验1:图S4。GR和YC提供AGS5细胞。BD和MB设计实验并撰写手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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