内源性MurineViral基因组电包使用XMRV标准素数放大

实验性研究调查日本慢性疲劳综合症(CFS)患者Sera中病毒相关病毒病毒的病毒性RNA检测时,常检测负控样中预期产品大小检测到正带盖格XMRV区域使用单步RT-PCR工具箱并试图在两个独立实验室评价工具箱质量从Invitrogen、TaKara、Promega和QIAGEN购买四套单步数包放大偏差盖格XMRV或其他MLV相关病毒基因素集(419F和1154R以及GAG-I-F和GAG-I-R)被广泛使用核电解序列确定并比较多热带内生MLV、XMRV和CFS病人生成的内生MLV病毒我们发现Invitrogen单步RT-PCR工具包的酶混合物受PmERV衍生RNA污染核子偏序盖格RT-PCR放大的污染物区域近似染色体7的PmERV(99.4%特征),高度相似性(96.9-97.6%)与最近发现的CFS病人生成的MLV类病毒相似性(96.9-97.6%)核极偏序env并发现它与PmERV几乎完全相同(99.6%)研究者在调查CFS和前列腺癌患者XMRV感染时,应谨慎评价测试包,在PCR和RT-PCR测试前发现MLV和XMRV基因组

前列腺癌患者2006年发现前列腺白血病毒相关病毒XMRV相似MLV一号,2..2009年,美国慢性疲劳综合症(CFS)患者中记录到高发XMRV3..自那以来,若干国家都对CFS病人XMRV感染情况进行了调查[4-九九万事通然而,CFS病人结果冲突激烈辩论10-12..最近Lo等检测到MLV病毒不同于XMRV,但类似于CFS病人和健康献血者多热带内生MLV13..

研究XMRV感染时常用PCR方法检测病毒RNA一号,3-6,8,13-15..研究日本前列腺癌和CFS患者以及健康献血者XMRV的流行XMRVRNA从CFS病人的等离子体中研究,我们选择商业单步RT-PCR工具箱实验研究中,我们遇到了一个令人费解的结果常检测到正带负控件中预期产品大小时使用素数组检测局部盖格XMRV区域测试箱本身可能被微小微粒MLV基因组或XMRV污染,并试图在京都大学JRC和病毒研究所两个独立实验室评价工具箱质量

超Script^®三级单步RT-PCR系统^®高菲力工具号12574-030)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)存取快速TMRT-PCRSYTERM号A1701(Promega, Madison,WI,USA)单步RT-PCR工具号PRO24A)单步RT-PCR工具号210) (QIGENGmbH,Hilden,德国)

放大偏差盖格XMRV或其他MLV相关病毒基因419F素数(5'ATCACTACCAGGAC-3')和1154R5'GCCCCTTCTC3'3GAG-I-F5'TOCGATGAGA3'和GAG-I-R5'AGGGGGGGGAGTA3'一号曾用过放大偏差envenv1r 5'-TBACACAGTACTCT-3's/env3f5'GGGGGGGGGGATGGTATS3's/env5r5'GATGAGGGGGGGGATS3'musculus染色体7提高单步RT-PCR响应量:QIAampUltraSensTM病毒盒号53704(QIAGEN)加进一步RT-PCR响应响应组合一号.检验污染物是否RNA2ml10mg/mlRNaseA号stepRT-PCR反应混合1C.RT-PCR按制造商指令以25微l(KitI、KitT和KitQ)或25.5微l(KitP)处理

通过在样本中加载运量RNA增强RT-PCR响应,我们一贯检测出正带使用KitI负控用两枚素集(419F和1154R和GAG-I-F和GAG-I-R)1A)实验条件相同的两个独立实验室(JRC和IVR)确认这些结果在所有四批测试中都观察到正反应(取自四批不同批量测试)。排除水、载波RNA或原素受XMRV类基因组污染的可能性,我们测试了两家不同厂家多步数包KitP和KitT无法检测出使用这些工具包的正带1B强力表示KitI组件中含有XMRV式病毒基因组大部分污染物似乎是RNA,因为正波段从KitI反应混合中添加RNaseA后消失1C)

深入调查KitI中污染物核酸净化塔克市脱氧核糖核酸聚合物和装箱中的缓冲测试方法,将单个组件加到三种单步RT-PCR包中(KitT、KitP和KitQ)2A-C)结果,当核酸从KitI增入RT-PCRKTTKTP或KitQ时,我们检测到正带使用两枚素集(419F和1154RGAG-IF和GAG-IR)。反之,我们检测不到MLV基因组 插件I缓冲这些数据显示KitI酶混合受XMRV病毒RNA污染

PCR产品使用素数419F和1154R复制成pCR4Blunt-TOPO三克隆(JRC二克隆和IVR一克隆)测序并发现近似完全相同数列中观察到9核化删除数列多发替代XMRV24核化删除5'盖格近似多边内生MLV编译C57BL/6J鼠标基因组多染色体代表克隆核子序列[GenBank:AB597300]与沉入GenBank的序列对齐如下:CFS1型、2型和3型像MLV病毒[GenBank:HM630562、HM630558和HM630559]13XMRV株式VP622并有位代表PmERV7NT65391-646473)污染物与PmERVchr7几乎完全相同(99.4%特征),序列区域中只有4核化差此外,污染物(96.9-97.6%特征)与从CFS病人中衍生的MLV相似病毒序列(CFS类型1、2和3)相当相似

深入描述污染物特征时,我们进行了额外的RT-PCRs一维放大偏差env区域二元集p-env1f和p-env3f和p-env5r确定674benv区域[GenBank:AB597301]并发现污染物近似同PmERVchr7[GenBank:AC167978!unt 59992593194)

应当指出,KitI内含反DNA聚合酶单克隆反体实现热启动PCR并减少非专用放大老鼠基因组内生反转病毒数之多并发现混合物制造单克隆抗体产生高量抗反转录病毒粒子16..因此,我们怀疑塔克市KitI的脱氧核糖核酸聚合物受MLV污染其他人也指出了这种可能性[17,18号..因反转转录入器塔克市KitI中的脱氧核糖核酸聚合物(PlatinumTaq聚合物)可与制造商分离购买,我们试图使用与图中的协议相同的协议检测Platinum聚合物酶MLV基因组2A-B.结果,我们使用RT-PCRKTP和KitT检测PlatinumTaq脱氧核糖核酸聚合物二维KitP和数据不显示KitT)

数个研究组对CFS病人XMRV感染进行了调查,但结果前后不一。虽然所有研究组都仔细实验XMRV受PCR和/或RT-PCR感染,但仍难判定XMRV与CFS关联的积极结果不是实验室人工品Xenotropic(或多热带)MLV分布广度,样本在实验室进行生物或医学研究时可能有许多机会受这种无处不在病毒的污染17..在这次研究中,我们评价数个单步RT-PCR包塔克市脱氧核糖核酸聚合物污染MLV相关基因组并发现测试包和塔克市Invitrogen的脱氧核糖核酸聚合物受MLV相关基因组污染

本研究发现,测试包中污染核酸有可能产生假阳性PCR结果XMRV和其他MLV相关病毒研究特别是,结果提高Loetal描述的PCR产品的可能性[13s衍生自污染MLVRNA和/或脱氧核糖核酸应该指出的是,对比显示即使在水控中MLV污染的数据,他们的报告显示,多位MLV序列比健康控件更容易发现CFS病人,而水控件则根本不发现多位MLV序列。尽管如此,Lo等报告中提到PlatinumTaq Invitrogen向它们提供最佳结果塔克市数家供应商聚合酶测试病人样本13..Invitrogen上标IIRT和Platinumtaq13..Erlwein等人指出中评语中19号响应Lo etal报告[13保证控制样本与确认样本同时相补 失明随机化方式

质量控制以避免测试包中内生抗反转录病毒基因组受污染的要求可能因预期目的而异。然而,在XMRV研究中,许多研究人员为检测极小量XMRV而执行超敏感PCR或RT-PCR因此,研究者在调查XMRV感染时,应谨慎评价测试包是否存在MLV和XMRV基因组

感谢Peter Gee(京都大学病毒研究所)慷慨帮助编写手稿这项研究得到了血液服务总部、日本红十字协会和面向生物技术促进机构赠款支持。文本本节

作者和附属关系

1. 信号传递实验室京都大学病毒研究所53Shogoin-Kavacho,Sakyo-ku,京都606-8507,日本

   Eiji Sato和Takayuki宫泽

2. 红十字大阪血液中心2-4-43Morinomiya

   里卡AFURUTA

对应作者

对应到宫泽高树.

竞技兴趣

作者声明他们没有竞技兴趣

作者贡献

RAF、ES和TM设计实验RAF和ES实验TM写手稿所有作者阅读并批准最终手稿

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