Adhatoda VasicagydF4y2Ba在临床前小鼠模型中减轻炎症和缺氧反应:在类似covid -19的情况下重新利用的可能性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

COVID-19肺炎与严重急性缺氧、脓毒症样状态、血栓形成和慢性后遗症(包括持续缺氧和纤维化)有关。分子缺氧反应途径与这些病理和我们最近对整个水提取物的抗缺氧和抗炎作用的观察有关gydF4y2Ba槐属植物gydF4y2Ba(AV)促使我们探索其对相关临床前小鼠模型的影响。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

在本研究中，我们测试了AV整个水浸提物在博莱霉素诱导的肺纤维化、盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的败血症和siRNA诱导的缺氧血栓表型的小鼠模型中的作用。在转录组水平上研究了AV对naïve小鼠肺的影响。我们还确定了提取物是否对SARS-CoV2复制有任何影响。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

口服AV提取物可减轻气道炎症增加、转化生长因子-β1 (TGF-β1)、IL-6、HIF-1α水平，提高肺纤维化和脓毒症模型小鼠的总生存率，并挽救siRNA诱导的炎症和相关的凝血表型。我们观察到肺转录组中缺氧、炎症、TGF-β1和血管生成基因下调，适应性免疫相关基因上调。AV治疗也降低了感染SARS-CoV2的Vero细胞的病毒载量。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果为这种阿育吠陀草药在改善缺氧-过度炎症特征方面提供了科学依据，并强调了AV在类似covid -19的情况下的重新利用潜力。gydF4y2Ba

肺泡缺氧反应水平升高是许多呼吸系统疾病如慢性阻塞性肺病和肺纤维化不可避免的后果[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．细胞对缺氧反应的关键角色是缺氧诱导因子(HIF)-1α及其调节蛋白，脯氨酸羟化酶结构域(PHD)-2酶[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．HIF-1α的诱导被认为是促炎的。它导致与气道重塑和炎症相关的必需基因的转录激活，如血管内皮生长因子、转化生长因子-β1 (TGF-β1)、诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素-17 (IL-17)和IL-6 [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．因此，这不仅仅是疾病的结果，组织/细胞缺氧升高积极参与夸大炎症反应，导致进行性肺损伤/损伤。gydF4y2Ba

HIF-1α在感染中也起着关键作用，特别是在促进病毒和细菌复制方面[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．在目前由严重急性呼吸道冠状病毒2 (SARS-CoV2)引起的COVID-19大流行中，缺氧反应在诱导严重肺部炎症和其他结果中的作用一直是最突出的观察结果之一[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在临床上，宿主与SARS-CoV2的相互作用大致分为三个阶段:第一阶段是无症状状态;二是以上呼吸道为特征，进行气道反应的非严重症状状态;第三，出现缺氧、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及进展为败血症的严重呼吸症状状态[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在潜伏期和非严重状态下，需要特定的体液和细胞介导的适应性免疫反应来根除病毒并防止疾病发展到严重状态。因此，在这一阶段增强免疫反应的策略无疑是重要的。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．然而，免疫反应缺陷导致免疫细胞在肺部进一步积聚，导致促炎细胞因子如IL-6、TNF-α的积极产生，导致免疫细胞和细胞因子的涌入，破坏气道/肺结构。免疫系统为应对病毒感染和/或继发感染而延长释放细胞因子，导致严重炎症、内皮功能障碍、败血症和多器官损伤[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，最近的研究还报告了重症COVID-19病例的凝血功能异常[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．缺氧-凝血的关系是众所周知的，我们和其他人也通过HIF-1α和vWF轴显示了细胞缺氧反应在血栓形成和出血易感性中的关键作用[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．因此，具有免疫增强和抗缺氧作用的药物有望成为更好的治疗选择，以防止SARS-CoV2感染和严重程度。gydF4y2Ba

我们最近展示了gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba(AV);一种阿育吠陀医学药物，具有强大的抗缺氧特性，可在耐治哮喘小鼠中减少由增强的缺氧反应引起的严重气道炎症[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．AV的抗hif -1α作用也在体外恢复细胞缺氧介导的线粒体形态功能损失[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．作为随访，我们评估了AV在其他严重肺部病理中的有效性，其中缺氧信号与COVID-19的临床过程相关，即肺损伤、纤维化和血栓形成。由于病毒的增殖可能被这些途径的分子调制所改变，我们进一步测试了AV在限制SARS-CoV2增殖方面的潜力。gydF4y2Ba

植物提取物的制备及LC-MS指纹图谱gydF4y2Ba

Adhatoda VasicagydF4y2Ba(AV)采自印度德里- ncr地区，采于花期(11 - 3月)。以植物(叶、枝、花)的水提液为原料，采用经典的罗什锦水提液提取方法gydF4y2BaCaraka SamhitagydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．如早期研究所述，配方的过程包括煎剂的制备、冷凝和干燥[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在印度勒克瑙SAIF, CSIR-CDRI，勒克瑙，用LC-MS对制备的AV提取物进行化学指纹图谱分析。gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

本研究的设计和实施遵循动物实验控制与监督委员会(CPCSEA)的指导方针，并得到印度新德里csir基因组学与综合生物学研究所(IGIB)机构动物伦理委员会的批准。在无病原体条件下培养BALB/c和C57BL/6雄性小鼠(8 ~ 10周龄)。实验开始前一周，在印度新德里CSIR-IGIB实验室适应动物房环境，并按照CPCSEA指南进行饲养。所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行，尽量减少动物的痛苦。gydF4y2Ba

小鼠分组及治疗gydF4y2Ba

根据实验结果，将小鼠主要分为对照和处理两组。在盲肠结扎穿刺(CLP)生存研究实验中，BALB/c小鼠分为假手术组(对照组，蒸馏水和10%乙醇，口服，口服)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和CLP(小鼠接受CLP手术，gydF4y2BangydF4y2Ba= 9)。CLP小鼠在CLP + Cyclo A(环孢素A处理的CLP小鼠，gydF4y2BangydF4y2Ba= 9)和CLP + AV-D2 (gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba提取物处理的CLP小鼠gydF4y2BangydF4y2Ba9)组。在CLP前两天(48小时)开始治疗AV (130 mg/kg溶解在蒸馏水中，口服，每天两次)或环孢素a(环孢素a, 15 mg/kg溶解在10%乙醇中，口服，每天一次)，并持续到手术后小鼠存活(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．为了评估CLP实验中的肺组织和细胞因子水平，小鼠在手术后20小时被Sham (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)，单独使用CLP (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)， CLP + Cyclo A (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)， CLP + AV-D2 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)组。同样，在博莱霉素纤维化模型中(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5只/组)，C57BL/6小鼠分为Vehicle(即Sham)、Bleo(博莱霉素处理)和Bleo + AV- d2 (AV 130 mg/kg处理的Bleo小鼠，口服，每日2次)。其中，AV治疗从第18天到第21天进行，如图所示(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).在方案的第0天，异氟醚麻醉C57BL/6小鼠气管内给予博莱霉素(3.5 U/kg小鼠)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，如上文所述，诱导小鼠发生纤维化变化[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．为了进行转录组学研究，BALB/c小鼠被分为蒸馏水，口服，每天两次，gydF4y2BangydF4y2Ba4)和gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba(AV)提取组。AV组按剂量进一步细分:AV- d2 (gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba提取物130 mg/kg，溶于蒸馏水，口服，每日2次，gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和AV-D4 (gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba提取物260 mg/kg，溶于蒸馏水，口服，每日2次，gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)如前所述[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．用蒸馏水或AV (130 mg/kg或260 mg/kg)灌胃小鼠，连续4天，如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa.在PHD2 sirna诱导的缺氧模型中(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5只/组)，将BALB/c小鼠分为打乱siRNA (Scrm siRNA)、脯氨酸羟化酶域-2 siRNA (PHD2 siRNA)和AV-D4处理PHD2 siRNA组(PHD2 siRNA + AV-D4)。AV-D4剂量(260 mg/kg，溶解在蒸馏水中，口服，每天两次)，连续4天，90µg siRNA (Sigma)鼻内给药，溶于超纯DNase和RNAse游离水，体内jetPEI作为转染试剂(Polyplus转染，法国)，于方案的第1、3和5天对异氟醚麻醉小鼠进行转染。gydF4y2Ba

凝血和出血时间测定，采血和血小板测定gydF4y2Ba

如前所述测量尾部出血[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．简单地说，用锋利的手术刀切除麻醉小鼠的尾巴，然后通过监测动物尾巴出血的持续时间来确定出血时间，直到出血停止，保持俯卧姿势并浸泡在PBS中。毛细管法测定凝血时间。用70%的酒精清洗小鼠的尾巴，并用1毫升的注射器针扎穿。在擦拭第一滴血后，从穿刺点向两根毛细血管中注入自由流动的血液。开始计时，切断毛细血管，观察在两个断裂的末端之间是否形成了细纤维蛋白支架。观察纤维蛋白静置后，用两根毛细管的平均值测定凝血时间。对于血小板测量，通过心脏穿刺获得并在EDTA涂层的MiniCollect管中收集的血液(Greiner Bio-One Gmbh, kremsmünster，奥地利)，如所述[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．全血用于测量总血小板计数和活性血小板计数，并使用FACSCalibur (BD生物科学，美国)通过流式细胞仪进行。简单地说，在PBS中稀释的全血(1:4)与APC偶联的抗cd62p (eBioscience Inc, San Diego, CA, USA)和FITC偶联的抗cd41 (eBioscience Inc, San Diego, CA, USA)孵育15分钟。同时使用匹配的荧光素偶联同型对照抗体进行染色比较。使用CellQuest Pro软件(BD生物科学，美国)对活性进行比较。gydF4y2Ba

支气管肺泡灌洗液收集及组织病理学gydF4y2Ba

通过向气管切开的气道内灌注1ml PBS收集支气管肺泡灌洗液，并对回收的支气管肺泡灌洗液进行处理以获得白细胞总计数，如前所述[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．对于肺组织学，肺被切除并固定在10%缓冲福尔马林中。将固定的、石蜡包埋的组织切成5um切片，用苏木精和伊红(H&E)染色评估炎症反应，或用马松毛状体(MT)染色评估胶原蛋白含量。gydF4y2Ba

盲肠结扎穿刺(CLP)gydF4y2Ba

通过腹腔注射1:1氯胺酮(75 mg/kg)和xylazine (15 mg/kg)的溶液麻醉小鼠。腹部刮胡子，腹膜区用碘碘溶液消毒，然后用70%酒精擦拭。在无菌条件下，切开1厘米的中线切口，将盲肠与相邻的肠仔细暴露。盲肠用3.0 Mersilk (PROLENE, 8680G;Ethicon)在底部缝合，并在盲肠的同一侧用19号针刺穿一次。挤出少量粪便，确保穿刺部位通畅。盲肠回到腹膜腔，用3.0条人鱼丝缝合线缝合伤口。对照组小鼠(即假手术)，不结扎或穿刺，将盲肠暴露，然后返回腹膜。用25G针皮下注射1 ml预热的0.9%生理盐水使小鼠苏醒。手术后，动物立即被放置在一个笼子里，暴露在150w的加热灯下，直到它们从麻醉中恢复。 The recovery time is from 30 min to 1 h. Mice were monitored every 12 h for survival or euthanised after 20 h (ngydF4y2Ba= 3-4)测量细胞因子，同时用正常的饮食和水喂养它们。两个独立的实验记录了CLP手术后小鼠的死亡率。gydF4y2Ba

TGF-b, IL-6,IFN-γ， HIF-1α， PHD2, vWF测定gydF4y2Ba

根据制造商的方案，采用夹心法ELISA检测小鼠肺组织匀浆或血浆中TGF-b、IL-6、IFN-γ (BD，美国)、HIF-1α (R&D，美国)、PHD2 ((USCN，中国)和vWF (USCN，中国)的水平。gydF4y2Ba

RNA分离和全转录组分析gydF4y2Ba

按照制造商的方案，使用RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, CA, USA)从用AV (AVD2和AV- d4)或蒸馏水(载体)处理的小鼠肺组织中分离总RNA。对于全基因组表达分析，根据制造商的说明使用Affymetrix GeneChip MTA 1.0阵列。对于每个样本，按照协议中描述的一系列连续步骤，对250 ng RNA进行量化和杂交到微阵列芯片上。杂交后，使用Affymetrix GCS 3000扫描仪(Affymetrix, CA, USA)扫描微阵列芯片，并使用Affymetrix®GeneChip™命令控制台软件进一步评估信号值。使用Affymetrix GeneChip®Command Console®Software (AGCC)中的Affymetrix数据提取协议自动提取原始数据。CEL文件导入、mRNA水平、所有分析和结果导出均使用Affymetrix®Expression Console™软件进行。对载体与AV处理后的样品进行了对比研究。以显著性p值小于或等于0.05为标准，认为是差异表达的基因。gydF4y2Ba

功能丰富和连通性图分析gydF4y2Ba

对于功能分析，我们使用了浓缩铀(gydF4y2Baamp.pharm.mssm.edugydF4y2Ba)工具。在途径和基因本体论分析中，我们检测了cell cell、Biological Processes、BioPlanet、Wiki、KEGG人类途径中的基因富集情况，如果Enrich r工具中p值小于0.05，则考虑基因集富集情况。在连通性图(connectivity map, CMap)分析中，根据折叠变化对差异表达基因进行排序，并使用与CMap数据签名兼容的前150个上调和下调基因列表，利用线索查询连通性。IO试金石数据库。在CMap分析中，阳性得分表明AV的表达模式与对照化合物的基因表达特征相似，而阴性得分则相反。gydF4y2Ba

分子对接gydF4y2Ba

新型SARS-CoV-2病毒的全基因组序列来自美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库(NC_045512.2)。3CLpro、PLpro、RdRp、s蛋白、ACE2、JAK2等所有靶蛋白可用的三维晶体结构均取自蛋白质数据库[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．其他结构(NSP4、NSP7、NSP8、NSP9、NSP13、NSP14、NSP15、NSP16和TMPRSS2)采用瑞士模型[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]和I-TASEER网络服务器[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．通过COACH元服务器鉴定蛋白质的活性区域，并将结果与CASTp web服务器的结果进行比较[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．研究了复方对SARS-COV2靶蛋白的影响gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba以及已知的抗病毒、抗疟疾和JAK抑制剂化合物，通过使用薛定谔套件进行分子对接研究(Maestro) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]及AutoDock vina套装[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在薛定谔套件中，所有的目标蛋白都是使用蛋白质制备向导制备的，包括优化，然后最小化蛋白质的重原子。利用LigPrep制备了所有配体的能量最小化的三维结构。在Extra Precision mode (XP)模式下，利用OPLS3力场和Glide包进行了配体在蛋白腔内的最佳配合位。根据蛋白质结合腔的大小，选择网格框坐标x、y、z，网格分辨率为1 Å，使用AutoDock vina软件包进行计算。gydF4y2Ba

细胞模型、药物治疗和qPCR检测SARS-CoV-2gydF4y2Ba

Vero细胞保存在含有10%胎牛血清(Gibco)的Dulbeco Minimum Essential Medium (Gibco)中，37°C, 5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．在CSIR-CCMB的BSL3实验室中，在感染SARS-CoV2 (Indian/a3i clade/2020分离物)24小时前将细胞接种到96孔组织培养板中。测试了(AV)水提取物对SARS-CoV2病毒的作用[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]通过在DMEM介质中取不同浓度的AV: 100,50,12.5, 6.25(µg/mL)。简单地说，用AV启动细胞2小时。将病毒接种物(0.1 MOI)与不同浓度的AV一起加入细胞中，等待感染3小时。感染后，将病毒接种物替换为含有10%胎牛血清的新鲜培养基，并保持在37°C, 5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba72 h后，收集细胞上清液，在6000 g的浓度下旋转10分钟以去除碎屑，上清液转移到新鲜的收集管中。使用MagMAX™病毒/病原体提取试剂盒(Applied Biosystems, Thermofisher)从200 μL样品上清液中提取RNA。病毒RNA的提取按照制造商的说明进行。将来自试验组的病毒上清液与含有以下成分的裂解缓冲液一起添加到深井板(KingFisher™Thermo Scientific)中:magmax™病毒/病原体结合液;MVP-II装订珠;MagMAX™病毒/病原体蛋白酶k 260 μL;10μL;5 μL分别为200μL样品。RNA提取使用KingFisher Flex(版本1.01,Thermo Scientific)，按照制造商的说明进行。洗脱的RNA立即储存在-80°C，直到进一步使用。 The detection of SARS-CoV2 was done using COVID-19 RT-PCR Detection Kit (Fosun 2019-nCoV qPCR, Shanghai Fosun Long March Medical Science Co. Ltd.) according to the manufacturer’s instructions. The kit detects Envelope gene (E; ROX labelled), Nucleocapsid gene (N- JOE labelled) and open reading frame1ab (ORF1ab, FAM labelled) specific to SARS-CoV2 for detection and amplification of the cDNA. SARS-CoV-2 cDNA (Ct ~ 28) was used as a positive control. The log viral particles and a semi–log graph was plotted through the linear regression equation obtained using the RNA extracted from the known viral particles by RT-qPCR, using N- and ORF1ab genes specific to SARS CoV2 virus and percent viral reduction was calculated, as described previously [28gydF4y2Ba］．而N基因的Ct值被认为是计算病毒减少% [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

统计学意义通过单因素方差分析和GraphPad Prism软件分析确定。在小鼠实验中，所有数据代表均数±SEM;各组N = 3-10，显著性用*表示gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。gydF4y2BapgydF4y2Ba-value > 0.05被认为不显著(NS)。使用GraphPad Prism软件通过Log-rank (mantle - cox)检验确定生存研究的意义。gydF4y2Ba

AV治疗抑制博莱霉素诱导的肺纤维化特征，并增加小鼠HIF-1α水平gydF4y2Ba

为了测试AV治疗对肺纤维化的影响，用博莱霉素治疗的小鼠口服AV (130 mg/kg, AV- d2)，如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa.我们观察到，在博莱霉素(Bleo)处理的小鼠肺部，TGF-β1和HIF-1α水平明显高于对照组- sham小鼠，而AV-D2处理后TGF-β1和HIF-1α水平下降(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c)。Masson三色染色显示，与Sham小鼠相比，Bleo小鼠肺中的胶原沉积显著增加(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad). AV-D2治疗可减少Bleo小鼠中胶原沉积的增加(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

AV可改善脓毒症小鼠模型的肺部炎症和损伤特征gydF4y2Ba

接受盲肠结扎穿刺(CLP)手术的小鼠在手术20小时后HIF-1α水平没有明显升高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).尽管如此，其下游靶标IL-6明显升高(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag)， IFN-γ降低(图;gydF4y2Ba1gydF4y2BaH)在手术后20小时的肺匀浆中。AV预处理恢复了小鼠肺中两种细胞因子的水平，而cycloa(阳性对照)预处理仅降低了小鼠的IL-6水平(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag, h)。此外，组织学分析显示，苏木精和伊红(H&E)染色的CLP小鼠肺切片有增加的炎症和血液渗出(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5a)。AV-D2和Cyclo A预处理CLP小鼠的肺组织学切片显示炎症和血渗出减少(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaI).与假手术组相比，CLP手术也导致小鼠存活率显著降低(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj).与未治疗CLP小鼠相比，CLP小鼠经cycloa或AV-D2治疗后存活率显著提高(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj). CLP + Cyclo A组和CLP + AV-D2组小鼠24 h后存活率分别为66.6和44.4%(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba尽管两组患者在CLP手术142 h时的生存率均为33.33%(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bak)。gydF4y2Ba

AV治疗抑制PHD2 siRNA诱导小鼠缺氧反应的止血效果gydF4y2Ba

接下来，为了测试AV的抗HIF-1α作用是否也能阻止凝血表型[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，我们用AV-D2 (130 mg/kg)和AV-D4 (260 mg/kg)浓度处理naïve BALB/c小鼠(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).口服AV-D2和AV-D4给naïve小鼠没有引起体重和肺、肝组织结构的任何显著变化(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab、c和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5b)，表明其在测试剂量下无毒。在止血参数中，AV-D4剂量对naïve健康BALB/c小鼠的治疗导致总血小板计数和激活血小板计数的降低，尽管没有统计学意义。但不影响小鼠尾出血时间(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, e).为了证实AV-D4对血液参数的上述影响，我们通过特定的PHD2 siRNA处理诱导小鼠细胞缺氧反应(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaF)，如前所述[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．PHD2 siRNA治疗(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1a)导致凝血和尾部出血时间显著减少(图S1a)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag).它还引起小鼠血液中总血小板计数和活化血小板计数的全面增加(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bah). PHD2 siRNA诱导的这些变化与血液HIF-1α和vWF水平升高有关，表明血小板聚集的发展(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bai, j)。有趣的是，AV-D4对PHD2 siRNA小鼠的治疗在小鼠的凝血时间、血小板计数(总和活性)和vWF水平方面导致了血液凝固表型的显著逆转(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba胃肠道)。AV的这些作用与逆转增加的血液HIF-1α水平有关(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baj).然而，AV处理不影响小鼠的出血时间，PHD2 siRNA处理后小鼠的出血时间缩短(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag)。gydF4y2Ba

免疫应答和缺氧通路基因的调节:由AV处理小鼠的肺转录组揭示gydF4y2Ba

肺转录组分析显示，AV-D4处理后上调了1258个基因，AV-D2处理后上调了375个基因。与Vehicle(蒸馏水)处理小鼠相比，AV-D4中的1133个基因和AV-D2中的262个基因下调(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa、b和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．我们观察到AV-D4上调基因中IL-2信号转导、T细胞信号转导、T细胞介导的免疫、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、造血细胞谱系等途径的富集。同样，中性粒细胞激活和脱颗粒、中性粒细胞介导免疫、免疫反应调节和细胞防御反应等生物过程也富集在AV-D4上调基因中(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).在AV-D2上调基因中，线粒体、T细胞信号转导、细胞毒性T细胞介导的免疫应答相关通路富集(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).同时，在AV-D4和AV-D2下调基因中，胶原生物合成、细胞外基质组织、TGF β调控、缺氧和相关炎症mapk信号通路均显著富集(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).总的来说，这表明AV治疗有利于在免疫和适应性免疫反应中重要基因的表达，以及对缺氧相关血管生成、纤维化和炎症级联相关基因的抑制。AV的这些发现可能与COVID-19的治疗有关，在SARS-CoV2感染患者样本中，抑制适应性免疫反应和诱导缺氧炎症反应[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．此外，与载体处理的小鼠相比，AV处理的小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL)中的免疫细胞水平增加(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1b)进一步支持了我们的观察。此外，为了识别AV基因表达模式与其他fda批准的药物和生物活性物质的异同，我们使用连接图(Connectivity Map, CMap)数据库绘制了AV的转录组特征。我们观察到糖皮质激素、HDAC抑制剂和非甾体抗炎药(靶向环加氧酶)与AV有相似的基因表达模式(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1c)。这些药物或化合物已被证明具有治疗COVID-19的潜力[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．进一步研究了这种直接影响的可能性。gydF4y2Ba

在硅片和体外gydF4y2Ba分析gydF4y2Ba证明了AV对SARS-CoV2的治疗潜力gydF4y2Ba

化学成分gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1和S2)与SARS-CoV2和宿主蛋白进行分子对接分析。表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1为各组成部分对接结果gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba使用SARS-CoV-2病毒的关键靶蛋白。黄酮类化合物的衍生物从提取物gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba被发现是对抗sarscov -2靶标的潜在候选(Luteolin_6C_glucoside_8C_arabinoside对3CLpro有−11.58和−7.45作用，luteolin_6_8 -di- c -arabinoside对RdRp有-9.77作用，对JAK2有−13.82作用，Luteolin_6_8_di_C_glucoside对s蛋白有-9.42作用，对JAK1有−12.08作用，对ACE2有−9.82作用，对NSP14有-15.25作用，对TMPRSS2有−11.12作用，木香素-6- c -阿拉伯糖苷对NSP16具有−10.57 kcal/mol，芹菜素_8_c_arabinoside对JAK3蛋白具有−11.28 kcal/mol)，比喹氮啉类生物碱类似物如胆碱和甜菜碱(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。附加文件中显示了与AV化合物结合作用更大的目标蛋白的关键残基gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2。化合物luteolin -6- c -葡萄糖苷-8- c -阿拉伯糖苷与3CLpro残基(His 41)发生阳离子-π相互作用，具有较高的亲和力-11.59 kcal/mol(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).如图所示，木香素-6,8-di- c -葡萄糖苷与NSP14蛋白残基(Phe 426和Phe 506)之间的π-π堆叠相互作用增强了与-15.25 kcal/mol的结合亲和力。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab，其他交互图在辅助材料附加文件中表示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2、S3、S4。此外，AV的类黄酮也被证明对参与缺氧和炎症的蛋白质具有更高的结合亲和力[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．我们还比较了AV的对接分析(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)使用已知的抗病毒药物、JAK抑制剂和羟氯喹(HCQ)对抗SARS-CoV2和宿主靶蛋白(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。我们观察到，与HCQ、抗病毒(即洛匹那韦、利托那韦和Daclatasvir)和JAK抑制剂(即Ruxolitinib、Baricitinib、Momelotinib和Oclacitinib)化合物相比，AV的成分对SARS-CoV2和对病毒进入和复制重要的宿主靶蛋白具有更高的结合亲和力(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．虽然各种JAK抑制剂对JAK2蛋白的结合亲和力在数值上超过-9.0 kcal/mol(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，结果表明，大部分黄酮衍生物的结合能数值上均大于-11.0 kcal/molgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．一种抗疟疾化合物HCQ (s蛋白为−4.61 kcal/mol)，可阻断ACE2与刺突蛋白的结合，从而抑制SARS-CoV-2病毒的入侵[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．3种抗病毒化合物(洛匹那韦、利托那韦和Daclatasvir)与所有SARS-CoV-2病毒靶蛋白的结合亲和力均低于AV的类黄酮衍生物。在AutoDock葡萄中，化合物木犀草素-6,8-di- c -葡萄糖苷具有更高的结合能- 9.0千卡/摩尔(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)比其他JAK抑制剂，如Ruxolitinib有−8.2,Baricitinib有−7.5,Memelotinib有−8.1,Oclacitinib有−7.4 kcal/mol(补充文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)为JAK2蛋白。从AutoDock vina中得到的趋势与以往文献非常吻合[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．总的来说，两种对接方法得到的结果是相似的。这些结果表明，与抗病毒、抗疟疾和JAK抑制剂等其他药物相比，AV提取物的类黄酮衍生物对SARS-CoV-2病毒的所有靶蛋白具有更高的结合亲和力。为了确认gydF4y2Bain-silicogydF4y2Ba在体外SARS-CoV2感染模型中，我们检测了AV的抗SARS-CoV2潜力。我们观察到，与未处理组相比，AV处理(100µg/ml)后感染SARS-CoV2的Vero细胞的病毒减少了63%。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).这些结果进一步证实了AV在COVID-19管理中的潜力。gydF4y2Ba

Adhatoda VasicagydF4y2Ba或Vasa已广泛用于阿育吠陀治疗各种炎症和呼吸疾病[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．即使在现代临床实践中，它也被推荐具有强烈的支气管扩张和镇咳作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．AV的有效成分及其衍生物，如溴辛和氨溴索，可有效治疗各种呼吸道疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病和结核病[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．我们最近的研究表明，AV通过其负调节因子PHD2抑制HIF-1α(缺氧的关键转录因子)来缓解类固醇-无反应性哮喘患者的严重气道炎症。因此，AV可调节缺氧反应，从而形成其多种治疗效果的基础，包括改善线粒体功能障碍[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们检查了AV在其他缺氧炎症流行情况下的抗缺氧作用，如肺损伤、纤维化和血栓形成。这些与当前的COVID-19全球大流行有关，特别是SARS CoV2感染的进展和后遗症(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们的研究表明，AV可以逆转博莱霉素小鼠肺纤维化(PF)模型的病理特征(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在PF肺的许多细胞类型中观察到HIF-1α稳定，并导致胶原合成、纤维化、TGF-β1、VEGF水平和成纤维细胞增殖的增加[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．AV治疗降低了博莱霉素治疗小鼠肺中HIF-1α蛋白表达的增加，并减弱了TGF-β1和胶原蛋白含量的增加(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba模拟)。这些初步结果证实了AV在慢性肺部疾病如纤维化中的缺氧调节作用。AV治疗对炎症性肺损伤有很强的作用，CLP诱导的小鼠肺损伤和死亡率降低(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai (k)。有趣的是，我们观察到小鼠在CLP后IFN-γ水平下降，在AV处理后恢复(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah).我们对CLP小鼠IFN-γ水平的观察与以往的研究不一致[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，这可能是由于CLP后测量时间的差异。我们推测AV的作用机制可能不是直接抗炎，而是恢复适当的炎症反应和阻断不适当的炎症。这将类似于支持辅助IFN-γ免疫治疗概念的临床发现，以改善宿主对感染的免疫反应[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．AV治疗还减少了HIF-1α诱导的促血栓状态，这可能与肺损伤和炎症有关(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf j)。gydF4y2Ba

在我们的研究过程中，我们意识到AV对肺部和全身炎症表型特征的影响也可能对目前的大流行形势有益。在SARS-CoV2感染中，缺氧反应升高似乎是过度炎症的结果，这有助于疾病的严重程度[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．我们将AV的治疗相关性与上述观察到的针对与COVID-19关键阶段相关的严重病理表型的影响联系起来，其特征是严重的肺部炎症、低氧血症、血管生成、败血症和凝血谱改变[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．因此，AV的抗缺氧特性将有利于减弱COVID-19的关键炎症期。我们对AV处理小鼠的转录组结果也显示了与缺氧-炎症通路相关的基因下调(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．鉴于AV的多种作用可能改变细胞对感染的反应(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，我们进一步确定了AV是否可能对SARS-CoV2的增殖有直接或间接的影响。我们筛选了AV针对SARS-CoV2和宿主靶蛋白的化学成分，并发现了两者之间可能的相互作用(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1及S2) [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．体外病毒抑制支持这些可能是相关的(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).需要更多的研究来确定是否有针对SARS-CoV2的有意义的抗病毒活性(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

治疗gydF4y2BaAdhatoda VasicagydF4y2Ba提取物改变细胞缺氧反应，调节炎症-血栓形成轴，以减轻肺损伤、血栓形成和纤维化。此外,gydF4y2Bain-silicogydF4y2Ba体外分析表明，它可能能够预防SARS-CoV2感染及其进展。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。本研究的转录组数据已提交到基因表达Omnibus (GEO)，登录号为GSE156759。gydF4y2Ba

HIF-1α:gydF4y2Ba

缺氧诱导因子-1 αgydF4y2Ba

PHD2:gydF4y2Ba

脯氨酸羟化酶结构域2gydF4y2Ba

COVID-19:gydF4y2Ba

冠状病毒疾病- 2019gydF4y2Ba

AV:gydF4y2Ba

Adhatoda VasicagydF4y2Ba

转化生长因子-β1:gydF4y2Ba

转化生长因子-β1gydF4y2Ba

il - 6:gydF4y2Ba

白细胞介素- 6gydF4y2Ba

IL-17:gydF4y2Ba

Interleukin-17gydF4y2Ba

干扰素-γ:gydF4y2Ba

干扰素γgydF4y2Ba

中电控股:gydF4y2Ba

盲肠结扎穿刺gydF4y2Ba

PHD2:gydF4y2Ba

脯氨酸羟化酶结构域2gydF4y2Ba

SARS-CoV2:gydF4y2Ba

重症急性呼吸道冠状病毒2gydF4y2Ba

PBMC:gydF4y2Ba

外周血单个核细胞gydF4y2Ba

BALF:gydF4y2Ba

支气管肺泡灌洗液gydF4y2Ba

ARDS:gydF4y2Ba

急性呼吸窘迫综合征gydF4y2Ba

vWF:gydF4y2Ba

冯·维勒布兰德因子gydF4y2Ba

Bleo:gydF4y2Ba

博莱霉素治疗小鼠gydF4y2Ba

):gydF4y2Ba

苏木精和伊红gydF4y2Ba

MT:gydF4y2Ba

马森的毛状体gydF4y2Ba

提出:gydF4y2Ba

连接图gydF4y2Ba

规划:gydF4y2Ba

非结构蛋白gydF4y2Ba

3 clpro:gydF4y2Ba

3 c蛋白酶gydF4y2Ba

PLpro:gydF4y2Ba

Papain-like蛋白酶gydF4y2Ba

RdRP:gydF4y2Ba

依赖RNA的RNA聚合酶gydF4y2Ba

S-pro:gydF4y2Ba

峰值蛋白质gydF4y2Ba

ACE2:gydF4y2Ba

血管紧张素转换酶2gydF4y2Ba

TMPRSS2:gydF4y2Ba

跨膜丝氨酸蛋白酶2gydF4y2Ba

木菠萝:gydF4y2Ba

Janus激酶gydF4y2Ba

我们承认动物房和成像部门可以使用设施。我们感谢Ramniwas Prasher博士就AV提取物的制备及其在阿育吠陀临床中的应用提出的宝贵建议。感谢Arjun Ray在分子对接分析方面的讨论和建议。AG, LP和KK承认AcSIR(科学与创新研究学院)博士学位。注册和CSIR(科学和工业研究理事会)的奖学金。gydF4y2Ba

这项工作得到了CSIR- trisutra (MLP-901)拨款的支持，CSIR和印度政府AYUSH部的卓越拨款中心。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 基因组学和分子医学，科学和工业研究理事会-基因组学和综合生物学研究所(CSIR-IGIB)，德里，110007，印度gydF4y2Ba

   Atish Gheware, Dhwani Dholakia, Ritu Rani, Mitali Mukerji和Bhavana PrashergydF4y2Ba

2. CSIR印度阿育基因组学研究中心(印度阿育基因组学转化研究和创新科学)，德里，110007，印度gydF4y2Ba

   Atish Gheware, Ritu Rani, Mitali Mukerji和Bhavana PrashergydF4y2Ba

3. 印度阿育吠陀学、原语和基因组学应用发展卓越中心，CSIR阿育基因组学trisutra(通过阿育基因组学的转化研究和创新科学)，CSIR- IGIB，印度德里，110007gydF4y2Ba

   Atish Gheware, Dhwani Dholakia, Ritu Rani, Mitali Mukerji和Bhavana PrashergydF4y2Ba

4. 肺疾病转化研究中心，CSIR- IGIB，印度德里，110007gydF4y2Ba

   Lipsa Panda, Bijay Ranjan Pattnaik, Vaibhav Jain和Anurag AgrawalgydF4y2Ba

5. CSIR高计算中心-中央皮革研究所(CLRI)，金奈，600020，印度gydF4y2Ba

   Sadasivam Kannan和Venkatesan SubramaniangydF4y2Ba

6. 印度泰伦加纳邦海得拉巴乌帕尔路，csir细胞和分子生物学中心，医疗生物技术综合中心附件二，邮编500007gydF4y2Ba

   Yash Parekh, M. Ghalib Enayathullah和Kiran Kumar BokaragydF4y2Ba

7. 印度科学与创新研究院，Ghaziabad, 201002gydF4y2Ba

   Atish Gheware, Dhwani Dholakia, Lipsa Panda, Ritu Rani, Vaibhav Jain, Kiran Kumar Bokara, Venkatesan Subramanian, Mitali Mukerji, Anurag Agrawal和Bhavana PrashergydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

AG设计并执行了实验，分析了实验结果并撰写了论文。DD进行CMap分析并解释结果。SK进行分子对接分析。LP、BRP和VJ对动物模型实验有贡献。YP、MGE对SARS-COV2体外培养进行筛选，RR参与分析和撰写稿件，KKB设计、执行、解读体外SARS-COV2培养结果并撰写论文。VS设计、执行、解释分子对接分析并撰写论文。BP对研究进行了概念化，提供了AV、质量控制信息，设计了实验，分析和讨论了结果，并撰写了论文。AA和MM设计实验，对实验结果进行分析和讨论，并撰写论文。所有作者阅读并批准了最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaAnurag AgrawalgydF4y2Ba或gydF4y2BaBhavana普拉舍gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

小鼠实验的设计和实施遵循动物实验控制和监督委员会(CPCSEA)的指导方针，并得到印度新德里csir基因组学与综合生物学研究所(IGIB)机构动物伦理委员会的批准。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba