COVID-19患者循环维生素D水平状况及临床预后指标

背景

COVID-19发病机制中激活多种免疫机制。通常，冠状病毒感染的特点是宿主免疫反应失调，白细胞介素-6增加，细胞毒性CD8 T淋巴细胞过度激活。有趣的是，维生素D缺乏通常与免疫反应改变和感染有关。在本研究中，我们评估了COVID-19感染期间不同肺部受累患者的维生素D血浆水平。

方法

采用流式细胞术检测淋巴细胞表型。胸部CT受累通过图像分析程序获得。

结果

80%的患者维生素D缺乏，6.5%的患者维生素D不足，13.5%的患者维生素D正常。血浆维生素D水平极低的患者D-二聚体值升高，B淋巴细胞计数升高，CD8 + T淋巴细胞减少，CD4/CD8比值低，临床表现更差(通过LIPI和SOFA评分衡量)，胸部CT扫描受累。

结论

在COVID-19患者中，维生素D缺乏与炎症反应减弱和肺部受累程度较高有关。在COVID-19感染期间，维生素D评估可能是一种有用的治疗干预措施分析。

试验注册:“回顾注册”。

COVID-19感染迄今仍是一个公开的挑战。虽然病毒侵入我们呼吸系统后的临床特征是已知的，但调节这种进入的病理生物学和机制以及观察到的多种临床图像背后的原因仍然未知。不幸的是，约20%的感染患者发展为严重的呼吸道疾病，其特征是弥漫性肺浸润和肺泡II型肺细胞损伤，这些细胞经历凋亡和死亡[1］．受累的肺泡单位位于胸膜周围和胸膜下。此外，据报道，病毒驱动的过度炎症[2］．促炎细胞因子的早期过度生产已被描述并定义为细胞因子风暴[2，3.］．其中，血浆IL-6水平升高被纳入死亡预测因子[4］．最近的观察表明，维生素D (VitD)不仅是一种与钙代谢和骨骼健康有关的微量营养素，而且在多种免疫机制中作为多能激素发挥重要作用[5］．

已知催化其活化的酶和介导维生素本身作用的VitD受体(VDR)广泛分布在整个细胞体，特别是肺泡上皮和免疫系统中。尽管VitD在体内的作用还不完全清楚，但一些观察强调了VitD在肺部感染和肺部疾病发展中的作用[5，6］．VitD功能不足与下呼吸道病毒感染有关[7]以及慢性阻塞性肺病和哮喘的加重[5，6］．

正常情况下，摄入或内源性产生的VitD被肝脏羟基化为25-羟基VitD (25HOD)。这种代谢物被测量来评估VitD状态。其激素活性是在肾1a-羟化酶活化至1,25 oh2d后达到的。在没有任何补充的情况下，VitD状态严格依赖于内源性生产，而内源性生产可能受到VitD结合蛋白的遗传变异、季节、纬度、皮肤和生活方式的影响[8，9］．更有趣的是，关于VitD对人类适应性免疫反应的影响的研究表明，核VitD受体和VitD激活酶在免疫细胞内的表达[10］．活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞均显示VitD受体上调[10，11］．最近的研究强调VitD通过辅助性T淋巴细胞和直接作用于B淋巴细胞稳态。T淋巴细胞是VitD免疫调节作用的重要靶点。

值得注意的是，它们影响多种前炎症细胞因子的分泌[12］．Th1淋巴细胞(IL-2、inf - γ、tnf - α)和VitD血浆水平与血浆IL-6水平呈负相关[13］．VitD下调IL-6 mRNA水平[13］．另一方面，IL-6的合成与免疫细胞的分化和成熟以及细胞因子的产生有关[14］．在T淋巴细胞培养中，VitD似乎促进了耐受性表型的发展和调节T淋巴细胞(treg)相关基因的增加[15］．

维生素d缺乏症患者，补充维生素d可降低罹患不同病毒感染的风险[16］．此外，在COVID-19检测时，VitD水平较低的受试者与VitD水平充足的受试者相比，COVID-19呈阳性的风险更高[17］．

因此，我们的研究旨在评估在COVID-19大流行期间，在我院接受冠状病毒感染的患者中，VitD缺乏是否是导致更严重临床症状和更严重肺部受累的危险因素。

病人

入选52例经鼻咽和口咽拭子(一步RT-PCR试剂盒Qiagen，检测试剂盒，意大利米兰)(TaqMan快速病毒1步Master Mix，赛默飞世尔，意大利米兰)诊断为SARS-CoV-2病毒阳性的Covid-19感染和不同程度肺部受病的住院患者。这项研究是在圣安德烈亚医院进行的，该医院被拉齐奥大区指定为意大利罗马的COVID-19转诊医院之一。没有营养不良的迹象。合并症及患者特征见表1．

排除标准为近期心血管事故、癌症诊断、自身免疫性疾病。本研究纳入的所有患者均未接种过卡介苗。在意大利，只有暴露于高传染风险的卫生保健专业人员和对使用抗结核特异性药物有临床禁忌症的人员才必须接种抗结核疫苗。

在所有患者中，VitD血清水平在疾病的急性期给予剂量。VitD的剂量在入院时进行，在开始任何类型的治疗之前。同时，评估不同的炎症标志物(高敏C反应蛋白hs-CRP、降钙素原PCT)、细胞损伤(高敏肌钙蛋白I、肌酸激酶心肌带、乳酸脱氢酶)和凝血(凝血酶原时间、纤维蛋白原和d -二聚体)。

在整个患者队列中使用自动化AQUIOS CL®“load & go”流式细胞仪(Beckman Coulter，生命科学部，印第安纳波利斯，美国)进行流式细胞术，以确定外周淋巴细胞类型计数。

使用专用试剂盒(IL-6 Human SimpleStep Elisa kit, Thermo Fisher, Milan, Italy)测量白细胞介素-6 (IL-6 Human SimpleStep Elisa kit)。

CT采集

所有COVID-19感染患者均采用2台16排多层CT扫描仪进行胸部CT扫描。患者取仰卧位，头部超前，从肺顶至肺底进行连续螺旋扫描。CT采集时，管电压为120 kVp，管电流自动调制，节距0.99 ~ 1.45 mm。根据原始数据，在512 × 512矩阵和350 × 350 mm视场上重建CT图像为轴向图像(切片厚度为10 mm)，轴向重建层厚度为1.0 mm，窗宽为1000-2000 HU，窗位为700-500 HU。定量结果由两名资深放射科医生单独评估，并通过讨论来解决数据解释上的差异。

PII对肺部CT病变的定量研究

肺部计算机断层扫描(CT)的结果使用肺部炎症指数(PII)进行量化。采用改进的半定量评分系统(Lung Quantitative Software -Siemens)，根据肺部病变的分布和大小，定量评估所有患者的肺部受累情况。共20个肺节段(在左肺和右肺)被评估。病变大小评分以占肺段面积大于或小于50%为依据。受累≥50%为1分，< 50%为0分，总分最高为20分。该值越高，炎症负荷越严重。PII =病灶分布评分+病灶大小评分/总评分(40分)× 100%。

我们根据肺部受累情况将CT扫描评估患者随机分为TSS≤7和TSS > 7两组。

沙发上的分数

顺序器官衰竭评估(SOFA)评分是基于六个器官系统(呼吸系统、神经系统、心血管系统、肝脏、凝血系统、肾脏)功能障碍程度的死亡率预测评分。它取决于以下变量:PaO2/FiO2，血小板计数× 10 ^3/µL，格拉斯哥昏迷量表从0级到+ 4级，胆红素值(mg/dL) (μmol/L)，平均动脉压(mmHg)，肌酐，mg/dL (μmol/L) [18］．有关患者的流行病学、麻醉和临床资料列于表中1(表1)．

分析SOFA评分结果，我们将患者随机分为两组。第一组SOFA < 2，第二组SOFA > 2。

肺免疫预后指数评分

结合基线dNLR和LDH计算肺免疫预后指数(LIPI)评分。在几种人类恶性肿瘤中，它通常被认为是一种预后价值，与治疗方式无关。根据LIPI评分，我们将3组分为:良好(dNLR < 3 + LDH 3 + LDH <正常上限(ULN)，中等(dNLR > 3或LDH > ULN)，不良风险(dNLR > 3 + LDH > ULN) [19］．分析LIPI评分，我们确定了两个主要组:第一组LIPI值为0-1，第二组LIPI = 2。

统计分析

连续变量(定量)用均值和标准差(SD)来描述，而分类变量用频率或百分比来描述。两组间定量变量(炎症标志物、细胞损伤标志物和凝血)的比较采用学生t检验，独立样本采用Mann‐Whitney‐Wilcoxon文本。采用卡方检验或Fisher精确检验来检验分类数据(SOFA;LIPI和CT评分)。采用Spearman相关检验评估VitD与其他参数的相关性。

在适用的情况下，对原始数据进行描述性统计分析。结果以均数±标准差表示。双尾P值为0.05或< 0.05作为统计学意义的标准。NS =不显著。使用GraphPad软件(版本)(GraphPad software, San Diego, CA)对数据进行统计分析。

伦理批准

研究参与者获得书面知情同意书。这项研究得到了我们的机构伦理委员会(University La Sapienza of Rome, Italy) (Prot。# 52sa_2020, rif。CE 5773_2020)，依据是它符合赫尔辛基宣言，并且该方案遵循现有的良好临床实践指南。

52例肺部受累的COVID-19感染患者纳入研究(女性27例，男性25例，中位年龄68岁，4岁，范围29 - 94岁)(患者特征见表1)．血浆VitD水平极低(低于10 ng/ml)和血浆VitD水平超过10的患者的平均年龄分别为77.5 + 16和68、9 + 18岁。因此，根据VitD血浆水平，将患者分为两个亚组。前者“低于10 ng/mL”，命名为第1组(平均值5.65 + 2.43 ng/mL)，后者“超过10 ng/mL”，命名为第2组(21,54 + 8,81 ng/dL)。流式细胞术相关数据见表2．

虽然两组间淋巴细胞计数存在显著差异，但通过流式细胞术，两组VitD血浆中TCD8 +细胞毒淋巴细胞水平与CD4 + /CD8 +比值之间存在中度相关性(图2)。1a, b).特别地，与组2相比，组1观察到TCD8 +细胞计数在统计学上较低(图2)。2b)， CD4 + /CD8 +比值升高(图。2a).此外，比较VitD和中性粒细胞计数、中性粒细胞和淋巴细胞比(NLR)以及衍生中性粒细胞/白细胞-中性粒细胞比(dNLR)，发现了很强的相关性(图。1一部)。与组2相比，组1检测到NLR、中性粒细胞计数和dNLR有统计学意义的增加(表2)2和无花果。2c, d)。

评估IL-6血浆水平，细胞因子炎症场景的关键因素，发现患者之间值的高度变动性。然而，在组1中有显著差异，尽管组2(表2)．

在第1组患者中，与第2组相比，d -二聚体血浆水平有统计学意义上的升高(表2)2)，两者差异有统计学意义。

VitD和血小板计数之间的对应关系已被记录，尽管没有统计学意义。降钙素原水平也进行了调查，两组之间没有差异。

其他炎症标志物(hs-CRP)、细胞损伤标志物(如超敏肌钙蛋白、肌酸激酶心肌带、乳酸脱氢酶)、凝血标志物(纤维蛋白原和凝血酶原时间)在两组间差异无统计学意义。

我们发现，在VitD水平较高的患者中，SOFA评分、LIPI评分和TSS值较低。这些患者主要归为2组。显然，SOFA和LIPI评分越高，TSS值越高的患者VitD水平越低，属于第1组(图2)。3.a - c)。此外，在评估LIPI评分时，我们记录了62.5%为LIPI 2(预后不良)，33.4%为LIPI 1(预后中等)，4.1%为LIPI 0(预后良好)。

虽然患者人数不是特别多，以便进行明确的统计评估，但组1的死亡率高于组2。事实上，第一组有3名患者死亡，而第二组没有。

本研究首次比较了COVID-19疾病期间具有不同健康相关评分、炎症标志物、细胞损伤和凝血标志物的VitD血浆水平以及放射学结果。有趣的是，VitD血浆水平低的患者的生化和临床表现受到了严重的免疫影响。维生素D不足和缺乏在COVID-19患者中很常见。研究队列中约8%的人血浆VitD水平正常。与年龄无关，患有更严重COVID-19疾病的患者血浆Vit D水平较低。

VitD血浆水平是定义VitD状态最准确的标记。25(OH)D是VitD循环的主要形式，也是测量的一种。一般来说，在人群中VitD水平低于20 ng/mL (50 nmol/L)通常被认为是缺乏状态。此外，20至29 ng/mL (52-72 nmol/L)的水平应定义为不足，而高于30 (75 nmol/L)的水平应定义为充足[20.］．此外，这些水平与VitD对骨代谢的影响严格相关，而对研究人类健康的其他方面有用的VitD水平正在研究中[10，20.］．长期以来，10 ng/ml被认为是定义维生素d缺乏的水平[21，22］．虽然内分泌学会将血浆VitD水平定义为20 ng/ml，但以25(OH)D作为定义缺乏状态的阈值[23]没有足够的证据来阐明全球健康所需的最佳血浆维生素d浓度[23，24，25］．

从一般角度来看，VitD活性在调节氧化应激和生存机制中似乎也至关重要[26］．此外，大量研究表明VitD不仅是一种与钙稳态有关的简单微量营养素，而且是一种具有广泛免疫调节功能的多能激素[27］．呼吸肺泡上皮代表第一道防线，能够抵消和防止吸入病原体的进入。它是先天性免疫的主要参与者之一，包括肺泡巨噬细胞和树突状细胞。如果受到刺激，这些细胞会激活各种细胞内信号通路，用于特定的抗菌防御、炎症介质的释放和适应性免疫反应[28］．适应性免疫反应与T淋巴细胞分泌细胞因子和B淋巴细胞产生免疫球蛋白的能力密切相关[29］．VitD缺乏与IL-6水平升高有关[30.]，而在一些研究中，维生素d补充剂会下调IL-6的水平[31］．IL-6在COVID-19重症患者中升高，也被认为是一个相关的预后标志物。据报道，IL-6水平升高的患者死亡率较高。因此，IL-6和IL-6R作为治疗COVID-19的潜在治疗靶点受到越来越多的关注。在我们的COVID-19感染患者组中，我们记录了几乎所有患者的IL-6水平升高，超过正常范围。不幸的是，它们之间的差异很大。因此，在这组患者中，没有检测到VitD与IL-6值之间的相关性。此外，在VitD水平非常低的患者中，IL-6值与VitD水平较高的患者相比略有升高，但不显著。这一结果可能与样本量有关。

中性粒细胞计数升高预示持续炎症，淋巴细胞计数降低被认为是预后不良的指标。这两种测量的组合，以及衍生的NLR比值dNLR，被认为是炎症状态的预测。在急性Covid-19疾病中，更严重的状态通常与中性粒细胞计数增加和淋巴细胞减少有关。CD4辅助t细胞和CD8 t细胞毒性淋巴细胞都可能受到影响，CD4下降越严重，疾病越严重，预后越差。在我们的患者中，观察到CD4 + /CD8 +比值、CD8 +计数和VitD血浆水平之间存在中度相关性。此外，血浆VitD水平低的患者与血浆VitD水平较高的患者相比，CD4 + /CD8 +和CD8细胞计数均有统计学差异。血浆VitD水平低的患者CD4/CD8比值升高更明显。t淋巴细胞在协调几种免疫功能中是必不可少的，帮助巨噬细胞和B淋巴细胞对抗疾病的发展。疾病引起的淋巴细胞活性的丧失显著地削弱了免疫反应。虽然正在调查外周血淋巴细胞(PBMC)抑制的原因，但在PBMC中未检测到病毒基因表达，在这些细胞中未发现COVID-19病毒感染[32］．它们的减少可能是迁移/分隔到受损组织部位的结果[33］．事实上，通过支气管肺泡灌洗评估轻度症状COVID患者的T CD8 +细胞向肺的扩张已经被描述[33］．

根据TC评分的功能对患者进行分类，分析高分辨率计算机断层扫描获得的肺部结果，我们证明血浆Vit D水平较低与肺受累增加严格相关，其特征是肺内更弥漫性磨玻璃混浊。这种情况反映了与所述的冗余和功能失调的免疫反应有关的更严重的疾病。序贯器官衰竭评估(SOFA)评分也是如此。它使我们能够评估不同器官系统进入人体的表现，根据器官衰竭和死亡率之间的关系，返回死亡风险。在LIPI和SOFA评分中观察到的关系使我们可以假设极低水平的VitD与COVID-19患者的最差预后相关。

所有被研究的患者均未接种过卡介苗，65岁以上的患者接种过抗流感疫苗。尽管据报道，接种疫苗，特别是卡介苗，对不同的病毒感染没有特异性保护[34]应谨慎解读卡介苗或其他疫苗对预防COVID-19感染的保护作用[35］．此外，在有或没有现行卡介苗接种政策的国家之间，COVID-19传播率没有发现显著差异[36］．

尽管在健康或一般医疗临床队列中，血浆VitD与所有死亡原因之间存在负相关关系，特别是在最低分位数(0-9 ng/ml)中，但VitD缺乏对COVID-19进展或疾病严重程度的影响尚有待评估。我们的数据强调了VitD血浆水平与疾病的不同血清标志物之间的关系。目前还很难说VitD补充剂是否能在对抗疾病的严重程度和降低死亡率方面发挥作用，但对几乎所有患者来说，这可能是一种有用的、安全的建议。

支持本文中的图表和本研究的其他发现的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

VitD:

维生素D

CT:

计算机断层扫描

PII:

肺部炎症指数

沙发:

顺序器官衰竭评估

LIPI:

肺免疫预后指数

PBMC:

外周血淋巴细胞

NLR:

中性粒细胞与淋巴细胞比值

dNLR:

衍生中性粒细胞/白细胞-中性粒细胞比率

TSS:

严重程度总分

我们非常感谢圣安德里亚医院COVID-19小组的协助和礼貌地为住院患者提供临床数据。我们特别感谢已向伦理委员会提出申请的研究小组成员De Biase Luciano教授、Paolo Martelletti教授、Antonio Aceti教授和Monica Rocco教授。

没有收到。

作者及隶属关系

1. 意大利罗马，1035号，Via di grottarossa，罗马萨皮恩扎大学Sant 'Andrea医院呼吸科

   Alberto Ricci, Alessandra Pagliuca, Michela D’ascanio, Marta Innammorato和Salvatore Sciacchitano

2. 圣安德烈医院，罗马，意大利

   Alberto Ricci, Alessandra Pagliuca, Michela D 'Ascanio, Marta Innammorato, Claudia De Vitis, Rita Mancini, Simonetta Giovagnoli, Paolo Anibaldi, Adriano Marcolongo, Chiara De Dominicis, Andrea Laghi和Emanuele Muscogiuri

3. 生物医学研究实验室，Niccolò库萨诺大学基金会，Via Don Carlo Gnocchi 3,00166，意大利罗马

   萨尔瓦多Sciacchitano

4. 意大利罗马高等医学院肿瘤和分子医学系Sanità

   弗朗西斯科·Facchiano

5. 意大利格罗塞托米塞里科迪亚医院呼吸科

   布鲁诺Sposato

贡献

作者就他们的贡献作了如下声明。构思设计:AR、AP、MD、BS、SG开发方法:CDV, RM, VS, PA, AM，数据采集:MI, CDD, AL, EM. FF。结果分析和解读:AR, AP, MD, MI。稿件的撰写、审核和修改:AR, AP, MD, SS研究监督:AR, MD。所有作者阅读并批准最终稿件。

相应的作者

对应到玛尔塔Innammorato．

伦理批准并同意参与

该研究得到了我们的机构伦理委员会(Sapienza University of Rome, Italy) (Prot。# 52sa_2020, rif。CE 5773_2020)，依据是它符合赫尔辛基宣言，并且该方案遵循现有的良好临床实践指南。每位参与者都获得了参与该研究的书面知情同意书。对于认知能力下降的成年人，他们的合法监护人同意他们参加这项研究。我们医院的卫生主任给予了访问我们研究中使用的临床/个人患者数据的行政许可，他也是手稿的合著者。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有利益冲突。

出版商的注意

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