linc00958/miR-185-5p/RSF-1通过AKT1/GSK3β/VEGFA通路在宫颈癌中调节顺铂耐药和血管生成

背景

化疗耐药是导致宫颈癌预后不良的主要障碍之一。Linc00958被报道为宫颈癌的致癌基因。然而，其在介导化疗耐药中的作用仍有待揭示。

目的

探讨linc00958对顺铂耐药宫颈癌细胞的调控机制，并进一步在异种移植小鼠中验证。

方法

利用在线生物信息学工具对linc00958/miR-185-5p/RSF-1进行预研究，预测RSF-1与AKT1/GSK3β/VEGFA在宫颈癌中的相关性。RT-qPCR检测linc00958/miR-185-5p/RSF-1在SiHa和SiHa/DDP中的RNA表达水平。细胞暴露于不同浓度的DDP后，用CCK8方法评估细胞存活率。双荧光素酶报告法用于测定荧光素酶活性。Western blot检测RSF-1蛋白和AKT1/GSK3β磷酸化的变化。采用免疫荧光法观察VEGFA体外分泌情况。应用试管形成评价血管生成的体外变化。将稳定转染pLKO-sh-NC或pLKO-sh-linc00958质粒的SiHa/DDP细胞注射到小鼠体内，建立异种移植模型。记录小鼠体重和肿瘤体积的变化。进一步进行H&E染色和免疫组化(IHC)法。

结果

linc00958在SiHa/DDP细胞中表达较高。高表达的linc00958与低总生存率相关。在SiHa/DDP细胞中，linc00958/miR-185-5p/RSF-1轴通过AKT1/GSK3β/VEGFA通路抑制细胞对顺铂的耐药性并抑制VEGFA和管的形成。下调linc00958抑制RSF-1和Ki67，抑制肿瘤生长;同时抑制VEGFA和CD34，降低小鼠血管生成。

结论

linc00958/miR-185-5p/RSF-1通过AKT1/GSK3β/VEGFA通路在宫颈癌中调节顺铂耐药和血管生成

宫颈癌是所有癌症中妇女死亡率最高的癌症之一。目前，切除手术、化疗和放疗在世界各地都可以使用。但总生存率和无病生存率较高，这可能与局部切除、化疗耐药、放射耐药、无驯化转移等不良结果有关[1，2］．顺铂是局部晚期CC患者的常规替代方案[3.]，在实践中，这种疗法也会与辐射疗法或其他药物结合使用[4，5］．CC患者容易产生顺铂耐药，这反过来又对治疗效果提出了挑战[6］．因此，揭示CC耐药的潜在机制具有重要意义。以往的研究解释了耐药的原因，包括药物通量的变化、DNA修复解毒、细胞凋亡、EMT、DNA甲基化、基因谱、信号通路等[7］．

在过去的十年中，研究确定了在鼻咽癌治疗中顺铂耐药情况下分子的潜在功能[8]、骨肉瘤[9]、肺癌[10]、乳癌[11]、卵巢癌[12]、子宫颈癌[13]，其中非编码rna已成为顺铂耐药新调控因子的一部分。lncRNA GAS5被鉴定为通过PTEN/AKT通路靶向miR-21，在SiHa/DDP体外实验中，敲低GAS5或上调miR-21可增加细胞对顺铂的耐药性[14］．lncRNA CASC2/PTEN与miR-21竞争性结合，通过AKT通路影响CC耐药细胞的顺铂耐药[15］．RNA相互作用环，定义为竞争性内源性RNA (ceRNAs)，其特征是RNA竞相与特定miRNA结合[16，17］．Linc00958较早在宫颈癌中被发现为致癌基因，可促进细胞增殖和侵袭[18]，其下调通过miR-5095/RRM2使细胞对辐射敏感[19］．在头颈部癌中，linc00958与MYC相互作用并介导细胞对顺铂和放疗的耐药，提示linc00958可能调节CC中的顺铂耐药[4］．

此外，在在线生物信息工具starBase和Targetscan上，预测linc00958/RSF-1被miR-185-5p靶向。虽然miR-185-5p在CC中的作用尚未被揭示，但miR-185-5p被广泛认为可以增加卵巢癌、肺癌和口腔癌细胞对顺铂的敏感性[20.，21，22］．此前，RSF-1被发现与CC细胞系Hela的紫杉醇敏感性有关[23］．此外，lncRNA NEAT1下调可通过与let-7-5p竞争性结合抑制RSF-1抑制鼻咽癌顺铂耐药[24］．另一方面，Gepia数据库显示，在CC肿瘤组织中，RSF-1的表达与VEGFA、AKT1和GSK3β的表达呈正相关。AKT/ GSK3β通路广泛参与癌症细胞存活和顺铂耐药[25，26，27，28］．血管内皮生长因子A(VEGFA)是肿瘤血管生成的关键因子²⁹．综上所述，我们假设在CC中，linc00958/miR-185-5p/RSF-1可能通过AKT1/ GSK3β/ VEGFA通路参与调节顺铂耐药和血管生成。因此，在本研究中，我们研究了linc00958/miR-185-5p/RSF-1对SiHa/DDP细胞顺铂耐药和试管形成的调控作用;在异种移植小鼠中，我们进一步验证了linc00958在肿瘤生长和血管生成中的作用。

道德的声明

本研究已报青岛大学实验动物福利伦理委员会批准(批准号:202208Balb/C12202306025)。这项研究没有使用人类样本。所有细胞和动物实验均严格按照青岛大学医学院附属第二医院青岛市中心医院的规定进行。

生物信息学分析

Gepia (http://gepia.cancer-pku.cn/)是指在宫颈癌中与正常对照物相比具有差异表达的lncrna。下载基因表后，我们在Microsoft Excel软件上进行分析，以筛选出排名靠前的差异lncrna1)．此外，还在Gepia数据库中对linc00958在不同类型癌症中的表达进行了研究。在Gepia上进行总生存分析，检验linc00958表达与总生存率的相关性，Cutoff-High为15%，Cutoff-Low为85%。分析linc00958在宫颈癌早期或淋巴结阳性组织中的表达情况(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)．RNAinter数据库(http://www.rnainter.org/search/)是用于预测miR-185-5p可能靶向顺铂和RSF-1。linc00958在starBase中被预测为智人体内miR-185-5p的海绵(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=lncRNA)， miR-185-5p靶点在starBase、PITA (https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)和RNAInter (http://www.rna-society.org/raid/)．此外，miR-185-5p被预测在RNAInter中靶向顺铂。

细胞培养

SiHa、SiHa/DDP和HUVECs细胞在Dulbecco 's改良Eagle 's培养基(DMEM)中培养，含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(pen/strep)。所有细胞系在含5% CO2、99%相对湿度、37°C的细胞培养箱中培养(赛默飞世尔，中国上海)。

转染

用pcDNA3.1载体(ThermoFisher, Shanghai, China)构建linc00958(pc-linc00958)和RSF-1(pc-RSF-1)的过表达质粒，空载体为pc-NC。miR-185-5p模拟物、miR-185-5p抑制剂及其对照模拟物NC和抑制剂NC由GenePharma(苏州，中国)提供。简单地说，6孔板用于SiHa和SiHa/DDP细胞(5 × 10⁵每个细胞都很好)。将2.5 μg质粒pc-linc00958、pc-RSF-1、pc-NC、miR-185-5p mimics和mimics NC与4 μl Lipo8000试剂混合，分别加入到每个孔中(Beyotime, Shanghai, China)，并按照生产商的建议进行转染。48 h后，采用RT-qPCR方法检测细胞转染效果。用慢病毒干扰载体pLKO构建linc00958(sh-linc00958 1#， 2#， 3#)、VEGFA(sh-VEGFA-1,2,3)和RSF-1(sh-RSF)的敲除质粒。1-EGFP-Puro (Biofeng，长沙，中国)，空向量为sh-NC。质粒由天津传世生物构建，上海生物技术(中国)测序。将慢病毒质粒与包装载体pLP1、pLP2、pLP VSV-G一起感染细胞，下调linc00958和RSF-1的表达。72 h后在倒置荧光显微镜下观察增强的绿色荧光蛋白(Nikon, Japan)。加入嘌呤霉素(1 μg/ml)筛选稳定转染细胞。每3天更换1次，浓度逐渐增加至12 μg/ml。

RT-qPCR

用Beyotime试剂提取SiHa和SiHa/DDP中的总RNA。我们用RT SuperMix进行qPCR (Beyotime)方法合成了cDNA。相对RNA水平在Roche light cycler 96上使用SYBR qPCR Master Kit，经GAPDH或U6归一化(Beyotime)测定。本研究中使用的引物序列列于表2)．采用比较Ct法计算rna的相对表达量。

细胞计数Kit-8(CCK8)检测细胞毒性

CCK8用于检测顺铂治疗后的细胞存活(Bioss, Beijing, China)。按照厂家说明，转染后的细胞接种于96孔板(每孔8000个细胞)，孵育12小时。然后用顺铂(0、7.5、15、30、60、120、240ug/ml)处理细胞24小时。随后，每孔加入10ul CCK8溶液。在细胞培养箱中培养2 h后，在450 nm波长的微孔板阅读器上检测OD值(赛默飞世尔，中国上海)。每组各重复3次。

荧光素酶检测

通过将miR-185-5p或突变体(mt)对应物靶向的野生型(wt) linc00958/RSF-1片段插入到pGL3双荧光素酶报告载体(Promega，上海，中国)构建荧光素酶报告质粒。质粒包括pGL3-linc00958-wt、pGL3-linc00958-mt、pGL3-RSF-1-wt和pGL3-RSF-1-mt。使用Lipo8000试剂盒(Beyotime)将指示的荧光素酶质粒与miR-185-5p mimics和mimics NC一起转染到SiHa/DDP细胞中。48小时后，使用Dual Lumi荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime)，在多功能酶标仪上检测荧光素酶活性。实验一式三次。

免疫印迹

利用RIPA裂解缓冲液制备细胞蛋白提取物。SDS-PAGE检测总蛋白(60 μg)，转移到0.45 μm PVDF膜上(Millipore, USA)。本研究中使用的抗体被列出，并指出稀释率(表3.)．膜用稀释的一抗在4℃下孵育过夜。用TBST冲洗膜3次(每次10 min)。然后用二抗在室温下孵育45分钟。再洗涤三次后，用ECL捕获机(Peiqing, Shanghai, China)上的ECL试剂盒(Beyotime)检测印迹带。利用培青公司提供的分析软件对波段灰度值进行分析。

免疫荧光法(VEGFA)

转染后将SiHa/DDP细胞收集于24孔板中，PBS洗涤。每孔加入200ul 4%多聚甲醛固定细胞30 min，用冷PBS冲洗细胞3次(每次5 min)。用驴血清(10%)阻断细胞30分钟。用1%驴血清(1:200)稀释VEGFA一抗(bs-4572R, Bioss, Beijing, China)，然后加入每孔。4℃孵育过夜后，加入二抗山羊抗兔IgG H&L/FITC (bs-0295G-FITC, 1:500, Bioss)，暗处孵育2 h, PBS洗涤4次(每次5min)， DAPI染色(Beyotime)。在100倍的倒置荧光显微镜下观察细胞。

管的形成

使用Matrigel (BD, USA)包被的µ-Slide血管生成(ibidi, Germany)分析HUVECs的管形成。HUVECs (10⁴)分别注入每孔，加入50ul SiHa/DDP细胞上清液。8 h，倒置显微镜下拍照。成熟管柱的数量来自三个不同的领域。图像在100倍显微镜下拍摄。

异种移植小鼠模型

收集稳定转染pLKO-sh-NC和pLKO-sh-linc00958(与体外组名sh-NC和sh-linc00958不同)的细胞，调整成5 × 10⁷细胞/ml，使用预热PBS。以1000rpm离心10 min，加入80ul无血清培养基，100ul细胞悬液皮下注射于12只4周龄雌性Balb/C小鼠左背部。24天后，肿瘤形成，测量小鼠体重，估算肿瘤体积(体积=长*宽²/2)接下来的28天。第52天，小鼠被杀死，肿瘤被称重。

他走时染色

用4%多聚甲醛固定小鼠肿瘤组织，石蜡脱水包埋。连续切片被切成每片4um。玻片先用二甲苯脱蜡，然后用乙醇(100%、95%、80%、70%)脱蜡。采用Harris苏木精-伊红染色切片，中性胶封片。切片在显微镜下观察。

免疫组织化学方法

脱蜡切片置于乙醇中(分别为100%、95%、85%、70%、50%)，各40 s。3% H₂O₂将载玻片孵育10 min。用柠檬酸钠缓冲液(Bioss)进行抗原提取。用山羊血清作为阻滞液(Bioss)。抗RSF-1, Ki67, CD34和VEGFA (1:200, Bioss, Table3.)，在37°C下孵育1 h，然后用PBS冲洗载玻片3次。应用山羊抗兔二级抗体(bs-40295G-HRP, 1:3000, Bioss)孵育切片20分钟。从Beyotime购买DAB试剂盒，用于染色切片。然后将载玻片放入苏木精中2分钟。用中性胶堵塞载玻片。切片在显微镜下观察。

统计分析

所有统计分析均使用Excel (Microsoft, USA)和Graphpad9.0 (Graphpad, USA)进行。学生t检验是在只有两组的情况下进行的。

当组间进行多次比较时，采用单向方差分析，然后采用Tukey校正。细胞存活分析采用双因素方差分析和Sidak多重比较检验。P < 0.05被认为是显著的。

下调linc00958可降低宫颈癌细胞顺铂耐药

根据Gepia数据库，与正常lncrna相比，linc00958是CC组织中上调最多的lncrna之一(图。1A&D)，在头颈部鳞状癌、肺癌、卵巢癌等其他癌症中也出现异常上调。1B).基于GEO谱，linc00958的表达与CC的淋巴结转移无关(图。1C)。此外，低linc00958与CC患者的高总生存率相关(图。1E)。

在本研究中，RT-qPCR结果显示linc00958在顺铂耐药SiHa/DDP细胞中的表达高于亲本SiHa细胞(Suppl1A).转染效率验证后，通过RT-qPCR方法(Suppl B-F)， CCK8结果显示，SiHa/DDP更不愿意以最大抑制浓度的一半(IC₅₀)为30ug/ml(图;1F).在SiHa细胞中敲除linc00958增强了细胞对顺铂的敏感性(图。1此外，在SiHa/DDP细胞中敲除linc00958可降低IC₅₀提示linc00958下调与顺铂耐药抑制相关(图;1H)。

linc00958通过miR-185-5p/RSF-1轴介导宫颈癌细胞对顺铂的耐药

RNAInter预测miR-185-5p可能与顺铂和RSF-1相关(图。2a - b)。应用StarBase和PITA数据库进一步预测miR-185-5p与linc00958/RSF-1之间的潜在结合位点(图5)。2c - d)。共转染后，SiHa/DDP细胞中的荧光素酶报告细胞检测证实，miR-185-5p靶向RSF-1, linc00958海绵miR-185-5p(图5)。2E-F)。RT-qPCR结果还显示，miR-185-5p在顺铂耐药细胞系中的表达较低(图。2此外，上调linc00958可抑制细胞内miR-185-5p(图。2H)。另一方面，SiHa/DDP细胞中RSF-1 mRNA的表达明显高于SiHa(图。2I). Gepia在线数据库显示linc00958与RSF-1在CC组织中呈正相关(图;2J);在SiHa/DDP细胞中，敲低linc00958可降低RSF-1，上调linc00958可提高RSF-1 mRNA和蛋白水平(图2)。2K-L)。上调miR-185-5p可降低RSF-1的mRNA和蛋白水平(图。2mn)。联合使用，linc00958可以上调RSF-1，并作为miR-185-5p的海绵。此外，miR-185-5p的上调或RSF-1的下调抑制了SiHa/DDP细胞对顺铂的耐药，这表明linc00958通过miR-185-5p/RSF-1轴介导宫颈癌细胞对顺铂的耐药(图5)。2O-P)。

linc00958/miR-185-5p/RSF-1轴调控AKT1/GSK3β通路在宫颈癌中的表达

通过Gepia的Spearman相关分析，RSF1与CC组织中AKT1和GSK3β相关(图。3.a - b)。RT-qPCR方法验证，在SiHa/DDP细胞中，上调linc00958可增强AKT1 mRNA表达，而下调linc00958对AKT1 mRNA表达无显著影响(图2)。3.C)，而linc00958调控不介导细胞中GSK3β的mRNA表达(图。3.D)。然而，western blot结果支持磷酸化的AKT1/AKT (ser473)和磷酸化的GSK3β在SiHa/DDP细胞中被上调linc00958促进，下调linc00958抑制(图。3.情况)。通过RT-qPCR和western blot (Supp1做减法)。miR-185-5p上调或敲低RSF-1失活的AKT1/GSK3β通路3.i p)。此外，western blot结果证实miR-185-5p inhibitor可上调RSF-1蛋白并激活AKT1/GSK3β通路，而敲低RSF-1可部分逆转这一现象(补充2g)。

Linc00958/miR-185-5p/RSF-1轴通过VEGFA途径调节管的形成

在CC组织中VEGFA的表达与RSF-1密切相关(图。4A).高VEGFA表达与CC患者的低总生存率相关(图。4B).在SiHa/DDP细胞中，下调RSF-1可以抑制VEGFA mRNA的表达(图。4C)。此外，免疫荧光结果显示，在SiHa/DDP细胞中，敲低linc00958和RSF-1或过表达miR-185-5p会抑制VEGFA的分泌(图。4D-F)。上清液中linc00958/RSF-1的缺失或miR-185-5p的增加抑制HUVECs管的形成，阻碍体外血管生成(图。4G-L)。上清液中miR-185-5p的缺失促进了VEGFA的分泌和管的形成，而敲低RSF-1可以逆转这些(补充2H-J)。此外，DDP显著抑制SiHa/DDP细胞中VEGFA的分泌并抑制管的形成，但下调miR-185-5p可逆转DDP的作用(补充3.a - c)。在SiHa/DDP细胞中转染sh-VEGFA(-1,2,3)后，证实sh-VEGFA-2组SiHa/DDP细胞具有最好的VEGFA (Suppl .)敲除效果3.d e)。上清液中VEGFA的降低导致管形成的显著抑制(补充3.做减法)。然而，在VEGFA被阻断的细胞中，无论是敲低linc00958还是上调miR-185-5p，都不能进一步抑制管的形成，这表明linc00958/miR-185-5p通过VEGFA途径调控管的形成(Suppl3.做减法)。

linc00958缺失抑制了异种移植模型肿瘤生长和血管生成

在体内，小鼠体内linc00958的缺失抑制了肿瘤的生长。5模拟)。H&E染色显示，linc00958下调与较轻的病理相关(图。5E)。免疫组化结果显示，在敲除linc00958的小鼠中，RSF-1和肿瘤生长生物标志物Ki67均被抑制，揭示下调linc00958的小鼠可抑制RSF-1和Ki67，抑制肿瘤生长(图。5做减法)。免疫组化结果也证实，下调linc00958可抑制肿瘤微血管密度标志物CD34和VEGFA，支持下调linc00958抑制异种移植模型血管生成(图。5设定h)。

耐药是导致癌症患者预后不良的主要问题之一[30.，31］．因此，揭示其中的分子机制具有重要意义。本研究主要探讨linc00958介导宫颈癌顺铂耐药的作用。linc00958在SiHa/DDP细胞中作为miR-185-5p的ceRNA上调rrf -1。此外，linc00958/RSF-1下调或miR-185-5p上调可通过AKT1/GSK3β/VEGFA途径缓解宫颈癌细胞顺铂耐药和管状形成。在顺铂耐药CC细胞移植小鼠模型中，稳定敲除linc00958可通过降低RSF-1抑制肿瘤生长和血管生成。

此前，linc00958下调被证实可降低头颈部鳞状细胞癌的体外化疗和放射耐药[4］．本研究在CC细胞和小鼠模型中证实linc00958可抑制顺铂耐药。在胃癌中，miR-185-5p被预测在胃癌患者中调节顺铂和氟尿嘧啶耐药[32］．然而，目前尚未有研究关注miR-185-5p在宫颈癌中的作用。在本研究中，我们在CC中验证了miR-185-5p的上调抑制了SiHa/DDP细胞对顺铂的耐药性。RSF-1，重塑与间隔因子1，参与DNA损伤修复和细胞凋亡，被报道可降低恶性黑色素瘤顺铂耐药[33]和鼻咽癌[24］．此外，我们之前的两项体外研究发现RSF-1下调增强了细胞对紫杉醇的敏感性[23]及增加辐射敏感性[34在本研究中，我们进一步发现在体外SiHa/DDP细胞中，RSF-1的缺失可以减弱顺铂耐药和管的形成;在异种移植小鼠中，通过敲低linc00958, RSF-1降低，并与肿瘤生长和血管生成抑制相关。

有趣的是，通过在线生物信息学，我们注意到RSF-1与CC组织中AKT1、GSK3β和VEGFA的表达相关。AKT1 ser473位点磷酸化与细胞增殖、凋亡和肿瘤生长密切相关[35，36，37］．AKT抑制剂capivasertib、uprosertib和ipatasertib可抑制癌细胞存活和耐药[38］．已有研究报道lncRNAs可调控癌症中的AKT通路[39］．在CC中，lncRNA RP1-93H18.6通过抑制AKT通路抑制肿瘤发生[40］．在本研究中，我们验证了linc00958可以作为一个ceRNA吸收miR-185-5p并上调RSF-1, linc00958/miR-185-5p/RSF-1轴可以调节AKT1(ser473)和GSK3β的磷酸化，从而介导细胞存活和体外顺铂耐药。

VEGF家族在血管形成过程中必不可少，其中VEGFA是参与肿瘤血管生成的关键因子[41］．放化疗后CC患者血清VEGFA水平高与早期复发率高相关[42］．在晚期CC患者中，经典的人源化VEGFA单克隆抗体贝伐单抗联合常规化疗(顺铂或紫杉醇)可将总生存期延长3.7个月[43］．寻找新的调控VEGFA分泌的分子机制对干预CC的进展具有重要意义[44］．此前，lncRNA HAND2-AS1的缺失可以通过抑制VEGFA分泌来抑制CC的进展[45］．核因子90(NF90)通过介导VEGFA促进CC血管生成[46］．在本研究中，我们发现linc00958/miR-185-5p/ rsf -1的缺失可以抑制顺铂耐药SiHa/DDP细胞中VEGFA的分泌和管的形成。在下调linc00958的CC小鼠中，肿瘤微血管密度生物标志物CD34和VEGFA明显受到抑制，表明下调linc00958可以抑制肿瘤血管生成。

综上所述，本研究报道了一个新的调节轴linc00958/miR-185-5p/RSF-1通过AKT1/GSK3β/VEGFA通路在CC顺铂耐药和管的形成中发挥作用，而下调linc00958也可以抑制肿瘤生长和血管生成。

在本研究过程中产生的分析数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

答:

子宫颈癌

龙头:

竞争性内源性rna

DMEM:

杜尔贝科改良的鹰牌中号

的边后卫:

胎牛血清

笔/喉炎的症状:

青霉素、链霉素

VEGF:

血管内皮生长因子

没有一个

csco -恒瑞肿瘤研究基金(批准号;y - hr2018 - 200)。csco -石瑶肿瘤研究基金(批准号;y - sy201901 - 0127)。青岛市医疗卫生研究计划项目(批准号:;2021 - wjzd095)

作者指出

1. 景甜和程磊对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 天津医科大学肿瘤研究所附属医院妇科肿瘤科，国家癌症临床研究中心，天津，中华人民共和国

   景甜，郝泉

2. 天津市癌症临床研究中心癌症防治重点实验室，天津300060

   景甜，郝泉

3. 山东大学齐鲁医学院(青岛)齐鲁医院妇科肿瘤科，青岛，266035

   Lei程

4. 山东第一医科大学山东省医学科学院，济南250021

   Enqi香港

5. 青岛大学医学院第二附属医院，青岛市中心医院妇科肿瘤科，青岛，266042

   顾文金，蒋媛媛，孙莉

6. 山东大学齐鲁医学院，齐鲁医院妇产科，济南，250012

   北华香港

贡献

设计研究实验并获得资助，孔恩奇、顾文金、孙俪撰写修订和文章，蒋媛媛、郝权、程磊进行实验并收集数据，孔贝华、景甜准备调查，对应孙俪。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到李的太阳．

伦理批准并同意参与

本研究已报青岛大学实验动物福利伦理委员会批准(批准号:202208Balb/C12202306025)。这项研究没有使用人类样本。所有细胞和动物实验均严格按照青岛大学医学院附属第二医院青岛市中心医院的规定进行。根据《赫尔辛基宣言》。

发表同意书

所有作者都同意发表。

相互竞争的利益

所有作者都宣称没有利益冲突。

出版商的注意

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