母猪青春期的测定:诊断方法的对比

背景

母猪的青春期提前是保证农场经济效益的必要条件，因为这预示着母猪的繁殖能力和寿命。因此，需要进行有效的诊断。我们的目的是比较不同的程序(外部特征、血液孕酮分析和超声诊断)来检测70只母猪(Topigs TN70;240天)的农场条件。尸检是标准参考。使用多元逻辑回归分析来确定哪个自变量(预测因子)组合最能预测金边债券的状态。

结果

青春期(46/70母猪;65.71%)的特征是存在大于6mm的卵泡，白色体质，红色体质，而且黄体(尸检)。青春期母猪阴道长度、体况、背脂、胴体重和孕酮血药浓度均显著高于青春期前母猪(P< 0.05)。两种超声设备(DELTA和W3)由同一名高级技师(V1)进行比较。两名经验水平不同的技术人员(V1和V2，一名初级技术人员)使用W3得到的结果也进行了比较。超声检查提供了比其他诊断技术更好的结果，尽管超声检查的效果随着技术的进步和技术人员专业知识的增加而改变。最准确的结果是V1/DELTA (Nagelkerke´s R²= 0.846;灵敏度= 0.956;特异性= 0.958;阳性预测值= 0.978;负预测值= 0.920;ROC曲线下面积= 0.957)。结果:与阴道长度(V1;Nagelkerke´s R²= 0.834;灵敏度= 0.933;特异性= 0.958;阳性预测值= 0.977;负预测值= 0.885;ROC曲线下面积= 0.972)或孕酮浓度(V2;Nagelkerke´s R²= 0.780;灵敏度= 0.955;特异性= 0.826;阳性预测值= 0.915;负预测值= 0.905;ROC曲线下面积= 0.970)。

结论

超声检查结果优于其他诊断技术。超声检查的效果随着技术的进步和技术人员专业知识的提高而改变。与阴道长度(V1)或孕激素浓度(V2)一起使用时，使用W3设备的结果可以得到改善。准确性参数是选择青春期诊断的指导，但农场也必须评估对母猪的影响、管理的容易程度和成本。

由于母猪占产仔群的20-25%，母猪的生产效率在猪肉生产企业中非常重要。在大多数农场，每年有30%-50%的母猪群被更换。因此，有效的繁殖控制对整体生产影响很大[1，2］．为保证商业养猪场的经济效益，母猪青春期提前开始是必要的[3.］．事实上，几乎10%的母猪在第一次人工授精(AI)前就被屠宰了，这主要是由于繁殖问题[4］．母猪在150至220日龄时进入青春期[5];因此，第一次发情的准确检测是优化AI在第二次或第三次发情的正确时间的关键[6］．青春期的开始是衡量母猪繁殖性能和寿命的可靠指标[7］．第一次发情涉及到遗传潜能的效率和影响母猪性成熟和生殖管理的生理机制[8］．

据报道，7-8个月后发育期延迟导致繁殖失败是丢弃母猪的主要原因[9，10］．初次人工智能年龄的增加(220-300天)与因生育失败导致扑杀风险增加2.1%相关[8，10］．多达30-40%的8个月以上的母猪没有表现出任何发情的迹象，因此被剔除[10］．无声发情(无发情迹象的排卵)仅发生在4-5%的母猪[11];这种无声的发情可能是由于下丘脑-垂体轴发育不全，没有低血雌激素浓度的正反馈反应[12］．然而，在母猪中无法检测到发情的证据强调了有效繁殖管理计划的重要性[8］．死后生殖器官检查显示，60%本应处于发情期的母猪卵巢有周期性活动[8，11，13，14］．因此，对母猪的无发情诊断可能是由于发情检测不充分，而不是实际缺乏生理性发情[5，11，14］．

目前，在农场，青春期的确定是通过对公猪进行暴露和检测发情的迹象(外阴肿胀和发红，公猪感兴趣，以及对背压反应的站立反射)[15］．用于检测母猪性成熟的其他方法包括血孕酮分析[16，17]、腹腔镜[18]及尸体解剖[19］．这些技术很昂贵，而且会增加农活和/或对动物造成伤害;因此，它们在农场中不被常规使用。

某些外在特征对于判断青春期是有用的。对母猪生殖道从出生到青春期的研究表明，达到青春期时，输卵管和子宫的重量和长度发生了重要变化[20.］．近年来，阴道-宫颈的长度与子宫角的长度和容量有关[21，22］．母猪进入青春期需要一定程度的身体状况[23];此外，脂肪量与雌性哺乳动物的青春期有关[24］．生长模式在农场中很容易测量，可以预测母猪青春期的开始[25];因此，阴道-宫颈的长度、身体状况和背脂对判断青春期有重要价值。在母猪中，超声检查已被证明在检测怀孕、估计排卵时间和确定卵巢病理方面有用[26］．此外，超声检查可显示母猪子宫和卵巢，被认为对青春期诊断高度敏感[27，28，29，30.］．

本研究的目的是比较不同的程序(外部特征、血液孕酮分析和超声诊断)在农场条件下检测母猪青春期的能力。同时，对同一技术人员使用的两种超声设备进行了比较。此外，还比较了两名不同经验水平的技术人员在使用相同设备时的结果。尸检是标准参考。

动物

这项研究是根据欧洲猪只保护指令进行的[31]以及西班牙在实验和其他科学目的(包括教学)中保护动物的立法[32］．专业兽医负责照顾和处理这些动物。西班牙萨拉戈萨大学动物实验伦理委员会批准了这项研究(文献编号:PI01/22)。

这项研究是在位于塔拉戈纳(西班牙东南部的La Horta de Sant Joan)附近的一个种猪养殖场根据西班牙标准进行的。在40个围栏(10个围栏/围栏，围栏尺寸:2 × 5 m)共400头母猪中，随机选择70头母猪(Topigs TN70, Topigs Norsvin，马德里，西班牙)用于研究;这些母猪出生240天。母猪以前没有接触过公猪，也没有通过行为特征检查过发情。没有进行刺激发情的治疗。在研究设计中解释了这些决定的几个原因。我们打算将几种青春期诊断方法作为盲测进行对比。此外，我们之前的经验表明，在240日龄时，母猪可以被青春期或不被青春期，而对其青春期状态的检测是这种方法对比的基础。试验采用自由饲粮的方式，饲喂代谢能为3200 kcal/kg、粗蛋白质为15.9%、可消化赖氨酸为1.19%的商品性育肥羊日粮。此外，水是免费提供的。

青春期的诊断

根据参考标准，对几种诊断方法的结果进行盲目评价，以确保其与验证母猪状态的独立性。本盲法研究的每一种诊断方法都由不同的研究人员进行。同时进行体外特征测定和抽血测定血清孕酮(P4)。当天晚些时候，进行超声检查。扫描后第一天(16小时)屠宰。

外部特征

农场青春期的诊断是基于几个外部特征，在农场条件下很容易测量。阴道长度(厘米)使用校准导管测量(KUBUS，马德里，西班牙)。身体状况通过视觉评分进行评估，评分范围从1到5:1用于极瘦母猪，5用于极胖母猪[33］．背膘测量(mm)采用P2方法[9］．

未测量个体活重，但用以下公式由胴体重估算:活重=热胴体重/典型屠宰率，其中典型屠宰率设置为70% [34］．

孕酮浓度

血液样本采集(10ml)分别采用无添加剂无菌管颈静脉穿刺(Vacutainer Brand, Devon, UK)。

在外部实验室采用PNT-HOR-30409、ELFA (Laboratorios CONVET S.L.， Lleida, Spain) P4分析方法评估血清孕酮浓度(P4)。

超声

在猪圈内进行经皮超声检查;这两种超声设备都是便携式的。在研究的第一阶段，每头母猪都由一名资深专家技术人员(V1)使用高分辨率超声波Mylab Delta®(Esaote, Barcelona, Spain)进行研究，调整为8.6 MHz微凸传感器(以下简称Delta)。在第二阶段，由V1(高级)和V2(初级)两名不同专业水平的技术人员使用相同的设备先后独立地对所有母猪进行扫描。在第二阶段中，两名技术人员使用的超声设备是商用超声波W3®(KUBUS, Madrid, Spain)，调整为3.5 MHz无线扇形换能器(以下简称W3)。每头母猪总共进行了三次扫描。

根据Kauffold等人描述的修改程序进行超声青春期诊断。[30.]，基于子宫大小和位置的评估以及卵巢的可视化和分析。换能器水平放置在右或左腹外侧腹壁上，正好位于最后一对乳头的背侧。

性成熟被表示为“青春期前”(PRE)和“青春期前”(PUB)，根据以下标准，必须同时满足:

1. (1）

   子宫:在膀胱扫描时，子宫最宽部分所占总体积空间≤屏幕上超声部分的1/3时，将母猪归为PRE。膀胱的识别对于正确的评估是必要的。相反，当子宫在其最宽的部分(膀胱可能出现在图像中，也可能不出现在图像中)所占的总体积空间≥屏幕上超声总截面的2/3时，将母猪归类为PUB。

2. （2）

   子宫角:剖面图扫描子宫角。当被测数字带≥1cm时²，金边债券归为PUB;否则，它们被认为是PRE。

3. （3）

   卵巢: PRE型母猪卵巢直径≤2.5-3 cm，结缔组织明显，可见高回声线支撑< 4 mm的卵泡。在卵泡期(PUB)，卵泡大小从4到8.5毫米不等，这取决于超声检查相对于排卵的时间。发情期卵泡大小变化为5-5.5 mm，发情期卵泡大小超过5.5 mm。发情时出现红体，发情时出现黄体(5-10毫米)。

每个超声程序/技术员所需的时间也被记录。

尸体剖检

尸检为其他诊断方法的准确性提供了参考标准。镀金状态(PRE/PUB)是在对生殖道进行死后研究的基础上评估的，特别强调卵巢结构[11］．PUB状态的特征是存在大于6mm的卵泡，白体(PUB在发情前期)，语料库石(变调中的PUB)和黄体(PUB在diestrus)。这些结构的缺失(白色体，红色体而且黄体)指向PRE状态。

并解剖生殖道，分别分析各部位的形态:记录卵巢、输卵管、子宫角和体的尺寸(cm)和重量(g)。在屠宰场采集的死后尸体中没有宫颈和阴道，这使我们无法获得这些数据．同时记录胴体重量。

统计分析

使用IBM SPSS版本26软件(SPSS, Chicago, IL, USA)进行统计分析。的均值和标准差(SD)总结了定量变量(形态测量数据、体重、背脂、身体状况、P4和超声手术次数)和计数语料库石黄体和白色念珠菌。

卵泡大小从第一类(≤1mm)开始按半开放式间隔分组。左半开区间(a, b)是所有大于“a”且小于或等于“b”的实数的集合。通过这种方法，毛囊大小分为八个类别。对于每个个体，每个类别的百分比计算总卵泡数。对每个类别的均值和SD也进行了估计。

采用单因素方差分析(One-way ANOVA，方差分析)比较PRE组和PUB组的胴体重和背脂。形态变异组间比较采用ANCOVA(协方差分析)，其中胴体重作为协变量。非参数检验(Mann-Whitney U检验)比较各组间卵泡大小间隔、身体状况和P4的分布。采用Friedman检验(非参数)比较各超声步骤所需时间。

通过运行Cohen´s κ来确定同一个人在两种情况下的超声检测结果是否一致:(1)同一技术人员(V1)使用两种类型的设备(Delta和W3);(2)两名技术人员(V1和V2)使用相同的设备(W3)。一般情况下，κ值越大，一致性越强(< 0.20:差;0.21 - -0.40:弱;0.41 - -0.60:温和;0.61 - -0.80:好;0.81 - -1.00;非常好)[35］．

使用多元逻辑回归分析来确定哪个自变量(预测因子)组合最能预测金边债券的状态(因变量:PRE或PUB)。一个逐步的程序(方法:向前)应用;自变量在过程的任何一步进入或移出模型，基于Wald检验，它确定了每个自变量的统计显著性:进入和被移除的显著性水平为P≤0.05，P≥0.10，分别[36］．将超声检查结果作为自变量时，参考水平为PRE(编码为0)，与参考水平进行比较(PUB，编码为1)。模型拟合采用卡方检验(模型系数综合检验)进行评估，该检验提供了模型的整体统计显著性。Nagelkerke R²估计因变量中有多少变化可以用模型解释。使用0.5的分界点，只有当其预测概率≥0.5时，才将鎏金状态分类为PUB。通过估计敏感性(真阳性率)、特异性(真阴性率)、阳性和阴性预测值(诊断试验中阳性和阴性结果分别为真阳性和真阴性结果的比例)评估模型区分PRE或PUB个体的能力[37］．受试者工作特征(ROC)曲线下的面积估计了歧视的总体度量[38］．

P值< 0.05为有统计学意义。

通过死后检验(参考标准)，对46/70(65.71%)被研究母猪的青春期进行了评估。卵泡大小间隔的分布如图所示。1．

显著差异(P大于6mm的卵泡百分比在PRE组和PUB组中均< 0.05)。的数量语料库石，黄体而且白体表中所示为英国国债1．

屠体明显较重(PPUB组(105.12±14.666 kg)高于PRE组(91.17±15.189 kg) < 0.001。表格2显示死后检查的生殖器尺寸和重量。在每一种情况下都发现了显著差异，PUB组的维度和权重更高(P< 0.001)。

在农场测量的参数(阴道长度、身体状况、背脂和估计活体重)和P4的结果见表3.．该表还显示了孕激素浓度的数据。青春期母猪总表现出较高的数值(P< 0.05)。

数据2，3.，4而且5显示V1/Delta的超声图像。值得注意的是，仅用一个图像来解释回声描记术是非常困难的。通常选择一个框架，其中表示所研究的结构。

在无花果。5，在图像中心可以清楚地看到一个卵巢。在它周围，有一个静脉丛在静止图像中可能会和卵泡混淆;动态图像可以清晰地捕捉到这些结构之间的差异。

数据6而且7显示V2/W3的超声图像。

超声检查结果见表4．V2技术人员使用W3设备无法检查一个镀金。

使用两种设备(Delta和W3)时V1的Cohen´s κ为0.848 (P< 0.001)，表明一致性非常好。使用W3设备，V1和V2具有良好的一致性(0.668)(Cohen´s κ = 0.668;P< 0.001)。

V1/W3组所需时间(12.57±11.143 min)明显短于V1/Delta组(17.74±10.754 min;P= 0.002)和V2/W3(20.20±15.694 min;P= 0.004)。V1/ Delta与V2/W3之间无显著差异(P= 0.833)。

先后调整后的Logistic回归模型见表5．均有统计学意义(P< 0.001)，表明模型拟合良好。在模型I中，阴道长度、身体状况、背脂和活体重(估计)作为自变量。模型II加入P4作为自变量。模型三、模型四、模型五增加了超声检查结果(一个技术员/一个设备)作为自变量。最后，模型VI和模型VII分别只包含了V1/W3和V2/W3的结果。表格5显示在每个模型中选择哪个自变量作为更好的预测因子。可以看出，在模型II和模型V中两个自变量具有P数值> 0.05均保持最佳模型拟合(分别为背膘和P4);在这两个模型中，这些变量的加入提高了拟合性，并解释了预测变异的百分比。

最初，模型I将农场(外部特征诊断)中易于测量的形态特征作为自变量:阴道长度和背脂被选为最佳的青春期预测因子。然而，当考虑V1/W3和V2/W3的结果时，最佳拟合模型还分别包括阴道长度和P4(模型IV和V)。仅考虑V1/W3和V2/W3结果的模型也显著(模型VI和VII)。

表格6为7个logistic回归模型的精度参数(Nagelkerke 's R²、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、ROC曲线下面积)。

模型I和模型VII分别基于外部特征和V2/W3，精度值最低。当考虑孕激素浓度和背脂时，基于外部特征的诊断改善了(模型II)。同时，当考虑P4时，V2/W3对青春期诊断也改善了(模型V)。当考虑阴道长度时，V1/W3的结果更准确(模型IV)。最后，只有V1/Delta(模型III)获得了最好的准确性;尽管模型III的ROC曲线下面积低于模型IV和模型V，但它们的95% IC广泛重叠。

青春期的开始是一个复杂的生理过程，内分泌和生理因素与性成熟有关。青春期开始的年龄在一定程度上受个体遗传控制(中等遗传，r = 0.38)，并可表现出个体差异[39，40］．

由于青春期诊断失败，约30-60%的母猪被扑杀，对现代商业农场造成严重的经济影响[41，42］．通过改进发情检测技术和提高发情检测的有效性，可以降低被扑杀母猪的比例。

在本研究中，尸检被用作代表实际情况的参考标准，或在现有措施允许的情况下尽可能接近实际情况。PRE母猪的卵巢特征为蜂窝状(1-3毫米卵泡)、葡萄状(高达6毫米)或中间型[13，43］．在PRE期母猪中，毛囊似乎呈波浪状被招募，但在发生闭锁前只长到6毫米[12］．因此，在6 mm以内，两组卵泡大小分布相似;大于6毫米的毛囊仅存在于PUB母猪中。的数量黄体而且白体与正常的第一周期发情相一致[13］．

PRE和PUB母猪在生殖道不同部位的发育上存在明显差异，如前所述的子宫长度[44，45]和子宫切片[25，46］．此外，卵泡发育的增加伴随着所有子宫切片的增大[25，46］．

内部因素(品种、体重、背脂)和管理因素(营养、与野猪的接触、环境)都控制着母猪的青春期，由内分泌-生殖轴介导[28］．生长率高的母猪比生长率低的母猪早熟[47，48］．体重和背脂对母猪繁殖有影响。促性腺激素的释放和卵泡的成熟取决于体重和脂肪[49]、生长速度及年龄[50，51］．这些因素的具体影响很难确定，但生长缓慢的母猪更轻，在选择时背膘更薄，青春期更晚，更有可能被淘汰。52］．

背胖与青春期开始有关[53］．高背膘膘(17.8 mm)、自由饲喂的母猪在198日龄达到青春期，而低背膘膘膘(14.7 mm)、限饲80%的母猪在203日龄达到青春期[54］．青春期年龄的遗传力(h²= 0.3)的比例略高于其他生殖性状[54];因此，在背膘基础上选择替代母猪，有利于提高母猪群的繁殖性能。Tummaruk等人。[48]的结果表明，母猪初次发情的平均日龄为195日龄，体重为106 kg，背膘为11 mm，但体重和背膘存在显著差异。

在农场条件下，客观评价身体状况并不容易。身体状况的评估是基于视觉检查的脂肪，分数从1到5。由于这项评估是基于个人的得分技巧，因此被认为是一种不精确和主观的方法[9］．此外，活体重不是直接测量的，而是根据胴体重量估计的，如材料和方法中所述。从预测方程(模型I)中排除这些变量可以用它们的低准确性来解释。

另一方面，年龄、体重、身体组成和青春期开始之间的关系是有争议的。饮食治疗似乎不影响青春期年龄[55］．如Rauw等人所述[56]，瘦肉比例较高的母猪青春期开始时间较晚，据报道，生长速度与青春期发情迹象之间存在负遗传相关性[54，57］．与身体组织的最低阈值量或特定的身体储备率相比，饮食条件和成熟板的暴露更与母猪的青春期开始有关[58］．这些事实可以解释模型I的精度较低，至少在所描述的农场条件下是如此。

埃利亚松(59]强调了孕酮分析的重要性青春期的诊断．孕激素的浓度只在青春期后，第一个形成后才会增加黄体［27，28］．因此，显示孕激素浓度> 2ngmL-1的母猪将被视为青春期母猪，但低于此值的母猪将被归类为青春期前母猪[29，60］．我们发现，青春期母猪与青春期前母猪的P4差异较大，青春期母猪的P4值较高;P4是一个很好的青春期标志。如前所述(见“统计分析)， P4仅被提出作为模型II- v的自变量。logistic回归模型的逐步拟合程序根据自变量的统计显著性，考虑模型中其他自变量的影响，选择自变量保留在模型中。因此，P4只在模型II和V中被保留，因为包括这个变量可以提高模型的拟合性。因此，将P4添加到先前包含较弱自变量(分别为backfat和V2/W3)的模型中，可以获得更好的精度参数。然而，当分别在模型III和模型IV中保留V1/Delta和V1/W3时，检测青春期的能力如此之高，以至于在这些模型中加入P4没有任何好处。

超声检查被推荐为一种可靠和省力的方法，用于研究和农场，当检查子宫和卵巢时，超声检查的准确度为95-100%(通过超声检查正确分为PRE或PUB的比例)[29，61］．超声检查可以检测卵巢及其结构;即使是很小的毛囊也可能是由于其无回声的外观[62］．在从PRE到PUB状态的转变中，子宫强劲生长，子宫角直径增加[61］．因此，虽然青春期前子宫是一个小的结构，需要更多的时间来显示，但青春期子宫可以很快看到[29];如上所述，即使是对母猪青春期状态的主观判断，对青春期诊断也是可靠的。

目前的工作比较了不同的程序，基于它们在农场条件下检测母猪青春期的能力，通过精度参数(Nagelkerke 's R²、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、ROC曲线下面积)。这些参数可以作为选择诊断程序的指导，这是本工作的一个重要成果。如图所示，V1/Delta(模型III)获得了最准确的结果，其次是V1/W3与阴道长度(模型IV)结合使用，V2 /W3与孕激素浓度(模型V)。然而，在农场实践中，在选择青春期诊断程序时必须考虑其他因素。

我们考虑了两种不同特性的超声设备。为每个胎龄的妊娠诊断而设计，它们不需要特定的安装，并适应任何情况。超声波设备W3®是一种商用设备，对该行业的所有公司来说都是可负担的成本，由于它完全便携且易于使用，因此在全球广泛分布。高分辨率超声波Mylab Delta®是专业设备，坚固耐用，需要合格的技术人员，成本较高。青春期诊断所需的时间取决于设备和技术人员的经验，W3和经验丰富的技术人员的平均值较低。

由于在设备购买和/或基本技术人员培训方面的必要投资，在一些农场实施超声诊断可能是一个挑战。即使在最好的生态图像中，对于未经训练的眼睛来说，仍然存在一些模糊性;这是对这些技术在农场中使用的最常见的批评之一。因此，基于背脂和孕激素浓度(模型II)的青春期诊断，从其准确性值来看是足够的，避免了新的投资。

超声检查提供了比其他诊断技术更好的结果，尽管V2获得了最差的结果。这些结果凸显了对有经验的技术人员的需求。V1/Delta得到了最准确的结果:超声检查的有效性随着技术的改进和技术人员专业知识的增加而变化。当与阴道长度(V1)或孕激素浓度(V2)联合使用时，W3手术的结果可得到改善。

准确性参数可作为选择诊断程序的指导，但也可根据操作的方便性、操作成本和对患者的影响(侵入性、不适性、便捷性)对程序进行比较。在这个意义上，超声设备通常存在于农场，因为它用于妊娠诊断，在这些情况下，超声比孕激素浓度分析更便宜。此外，它比阴道长度测量引起的不适更少，由有经验的技术人员使用时需要更少的时间。然而，超声诊断需要在设备购置和/或基础技术人员培训方面进行投资。由此可见，基于背脂和孕激素浓度的青春期诊断是一种很好的选择，因为其准确性值较高。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

P4:

孕酮浓度

“V1:

专家技术人员

V2:

初级技术人员

三角洲:

超声波Mylab Delta

W3:

超声波W3

前:

青春期前的

酒吧:

青春期的

SD:

标准偏差

方差分析:

方差分析

ANCOVA:

协方差分析

SE:

标准错误

置信区间:

信任间隔

作者感谢D. Savva在英语方面的帮助，以及Teresa Monteagudo在数据方面的技术援助。作者获得了本节中提到的两位人士的许可。

作者宣称没有资金支持。

作者及隶属关系

1. THINKINPIG S.L, Avenida Gómez Laguna, 41 10ºA, 50009，萨拉戈萨，西班牙

   安东尼奥·维拉和劳拉·拉菲兹

2. 西班牙萨拉戈萨市，萨拉戈萨市cita大学，阿拉贡- ia2农业营养研究所，兽医学院，动物病理学，生殖和产科区

   Antonio Vela, Andrés Suárez-Usbeck, Olga Mitjana和María Victoria Falceto

3. 西班牙萨拉戈萨大学兽医学院解剖学、胚胎学和动物遗传学系

   María特蕾莎·特耶多尔

4. KUBUS Calle Varsovia, 20,28232 Las Rozas de Madrid，西班牙马德里

   Sofía Martín &玛丽娜López

贡献

用AS-U、SM和ML研究体外特征，用OM指导孕酮分析。超声诊断由AV(资深技师V1)和LL(初级技师V2)进行。采用MVF法进行尸检。MTT进行了统计分析。AS-U和MTT是撰写手稿的主要贡献者。所有作者都阅读了一份经过批准的最终手稿。

相应的作者

对应到María特蕾莎·特耶多尔．

伦理批准并同意参与

本研究是根据欧洲猪保护指令(DOUE-L-2009-80287 2009)和西班牙实验和其他科学目的(包括教学)动物保护立法(皇家法令53/2013,2013)进行的。专业兽医负责照顾和处理这些动物。西班牙萨拉戈萨大学动物实验伦理委员会批准了这项研究(文献编号:PI01/22)。获得动物主人的知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

SM(创始人)和ML(员工)是KUBUS公司的永久员工，该公司生产手稿中提到的校准导管和商用超声波W3®，但该公司对这项工作没有重大的财政贡献。其余作者宣称没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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