希腊养猪场星形病毒、诺如病毒和萨波病毒的流行病学表明，星形病毒的流行率很高，这表明可能需要进行系统监测

Backround

星状病毒、诺瓦克病毒和萨波病毒在世界各地的猪群中广泛分布。然而，猪星状病毒(PAstV)、猪诺如病毒(PoNoV)和猪萨波病毒(PoSaV)与猪疾病的关系仍不确定。在本研究中，我们使用常规RT-PCR和SYBR-Green Real-time RT-PCR方法调查了希腊养猪场中PAstV、PoNoV和PoSaV的流行情况，以比较两种方法的敏感性。我们检查了来自希腊28个养猪场的1400个无症状猪的粪便样本。

结果

在所有28个猪场检测到PAstV，总患病率为267/280阳性(95.4%)。常规和SYBR-Green Real - time RT-PCR分别在280份检测样本中发现了36份和57份猪杯状病毒流行率。对阳性样本的测序和系统发育分析显示，检测到的PAstV序列集中在PAstV1、3和4谱系中，以PAstV3为主要单倍型(91.2%)。有趣的是，对杯状病毒阳性样本的测序显示存在非目标病毒，即sap病毒、Kobuvirus和Sapelovirus序列，以及一个与蝙蝠星状病毒高度相似的序列，而没有检测到诺瓦克病毒序列。

结论

帕斯特v在希腊养猪场的高流行率提出了进一步调查这种病毒的致病性的必要性，并将其纳入监测计划，以证明它是重要的。据我们所知，这是希腊猪场首次对这些病毒进行流行病学研究。

星状病毒、诺瓦克病毒和萨波病毒都是体积小、结构圆、单链、阳性意义的RNA病毒。它们被认为是肠道病原体，可引起多种动物腹泻，如人类、猪、狗、猫、水貂和许多鸟类[1，2，3.，4，5])。它们在世界各地都有分布，而诺如病毒(NoVs)和萨波病毒(SaVs)被认为是全世界人类病毒性肠胃炎的最常见原因[2］．

诺如病毒和萨波病毒是杯状病毒科的成员。它们都是非包膜单链阳性RNA病毒，大小为7.3 - 8.5 kb [6］．根据基因组结构，Caliciviridae可进一步分化为两个类群[7］．在第一种，包括诺如病毒，开放阅读框架1(ORF1)从ORF2而且ORF3在3 '端，而anORF4(包含在ORF2)编码毒力因子，VF1．在第二种，含有沙波病毒，有一个大ORF1一个标准ORF2(相当于ORF3诺瓦克病毒)，而ORF3已经被建议等价于ORF4［7]诺如病毒和沙波病毒根据主要的结构衣壳蛋白(VP1)序列。诺瓦克病毒至少分为七个基因群(GI- gvii)，其中三个基因群，即GI、GII和GIV病毒，已在人类身上检出[8］．萨病毒可分为19个基因群(GI- gviii)，其中4个基因群(GI、GII、GIV和GV)已在人类身上检出[9，10］．猪皂荚病毒(PoSaVs)属于基因组GIII(株A、B和C)和GVII [10］．猪诺如病毒属于GII基因组，更具体地说，属于三个不同的GII p型，即GII。赛,GII。P18和GII。P19 [11，12，13，14，15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24，25，26，27])。

在猪中，猪萨波病毒经实验感染已证明可引起肠道疾病[28，29］．在世界各地的许多猪场猪群研究中，在无症状和有腹泻症状的猪身上都发现了皂形病毒[20.，30.，31，32，33，34，35，36，37])。更具体地说，在2 ~ 8周龄仔猪中流行率最高，健康动物和腹泻动物的皂荚病毒阳性发现比例无显著差异。在阿克塞尔·莫罗伊等人的研究中[20.]，通过检查来自兽医诊断实验室的43份猪粪便样本，研究了比利时猪中诺瓦克病毒和萨波病毒的存在。在腹泻和无症状仔猪的粪便样本中，有5/43检测到PoSaVs，而猪NoVs仅在2头无临床症状的猪中检测到。在较年轻的猪(16-20周)中检测到PoNoV菌株。在Ilaria Di Bartolo等人[15在意大利，对201份无症状猪粪便标本和89份腹泻猪粪便标本进行了猪杯状病毒检测，在6.9%的无症状猪和18/89(20%)的有症状猪中检测到PoSaV，而在1只无症状猪中检测到PoNoV。PoSaV流行率最高的是在美国，在一项对621份不同年龄猪的粪便样本(11份腹泻，其余临床正常)的研究中，62%的猪被检测出PoSaV，最高的是保育猪，最低的是乳猪[26］．在同一项研究中，在20%的肥育猪中检测到PoNoV。台湾的PoSaV流行率最低，在无症状猪中检出病毒的比例为0.57% (5/863)[16］．因此，萨普特病毒在猪肠道疾病中的作用仍不清楚。许多流行病学研究已经证明了萨普特病毒在世界范围内的存在，但检出率差异很大，从3%到67%不等[19，26，32，35，37，38］．一般来说，在断奶后的猪中检测到沙波病毒的最高流行率[30.］．

猪诺如病毒(PoNoVs)主要在无症状的成年猪中检出[25，39])。在美国、拉丁美洲和几个欧洲国家的猪中，在有症状和无症状的动物中均检测到GII ponov [11，17，18，20.，21，40］．在猪粪便样本、零售及进口生肉样本中均检出GI和GII 11型病毒[16，41，42］．由于可能出现可直接传播给人类的新型病毒重组毒株，这一事实引起了公众对猪NoVs的人畜共患潜力以及猪在这种感染流行病学中的作用的关注[40，41，43，44］．到目前为止，猪型NoVs与人类感染的关系尚不清楚，需要进一步的研究才能阐明或控制这种病毒感染[39］．

星状病毒属于星状病毒科。它们很小，直径约28 - 30nm，无包膜，包含一个+ ssRNA基因组，长度约6.4-7.7 kb [44］．星状病毒科分为两个属，即巨形病毒(19种)和星状病毒(3种)[45］．乳状病毒属的成员感染各种哺乳动物，包括人类[46]，牛的[47]，猫科[48]， porcine [49]和mink [50］．Avastrovirus属的成员主要感染禽类，如鸡、火鸡和鸭[51，52，53］．

猪星状病毒(PAstVs)属于兽形病毒属。1980年，通过电子显微镜技术从腹泻猪的粪便样本中首次鉴定出PAstV [54］．迄今为止，已鉴定出五种pastv基因型[55］．PAstV的基因组编码三个开放阅读框(羊痘疮),即ORF1a ORF1b,而且ORF2［56］．ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),而ORF2编码病毒衣壳结构蛋白[45］．pastv主要在年轻人中导致胃肠道疾病，并已在猪的肠道和粪便中检测到。在年龄组检测方面，在不同研究中，PAstV的检出率最高的是野猪(82%)，其次是保育猪(67%)，育肥猪(59%)，母猪(36%)，母猪(37%)和哺乳仔猪(22%)[57］．然而，一些猪星状病毒已在有肠外症状的猪身上检出，如呼吸和神经体征[58］．此外，poastv已在无症状猪中检测到[59］．因此，PAstV在疾病中的作用尚不清楚。

本研究的主要目标是在整个希腊猪场检查星状病毒、诺如病毒和萨波病毒的流行病学(图。1)．为此目的，对来自28个希腊养猪场的1400头猪的粪便进行了分子分析，以确定这三种病毒的存在。此外，第二个范围是调查不同的五个年龄组，即乳猪，苗猪，生长猪，育肥猪和母猪。所有样本均来自无症状动物。样本被分成280个池子，每个池子有5个来自同一个猪场的样本。为了评估两种不同分子技术的敏感性，我们使用了两种不同的RT-PCR方法:常规RT-PCR和SYBR-Green real-time RT-PCR，以比较它们在检测这3种RNA病毒时的敏感性和特异性。最后，对阳性样本进行系统发育分析，测序，然后构建系统发育树。

Astrovirus

应用RT-PCR和实时RT-PCR两种方法，在280份(95.4%)样本中检测出267个阳性样本(图4)。2)．因此，就灵敏度而言，两种不同的方法具有相同的灵敏度。在农场层面，所有调查农场对星状病毒均呈阳性反应(28/ 28,100%)。病毒在不同猪龄群中的分布为:育猪和生长猪100%(56/56池)，哺乳仔猪96.4%(54/56池)，育肥猪94.6%(53/56池)，母猪98.2%(55/56池)。

诺如病毒和萨波病毒

常规RT-PCR方法对36/280(12.9%)猪的杯状病毒进行检测，SYBR-Green real - time RT-PCR方法对57/280(20.4%)猪的杯状病毒进行检测，表明SYBR-Green real - time RT-PCR具有较高的敏感性。常规RT-PCR结果显示，乳猪6/56(10.7%)，育猪5/56(8.9%)，生长猪7/56(12.5%)，育肥猪17/56(30.4%)，母猪1/56(1.8%)。SYBR-Green实时RT-PCR检测结果显示，乳猪9/56(16.1%)、育猪5/56(8.9%)、生长猪6/56(10.7%)、育肥猪36/56(64.3%)、母猪1/56(1.8%)检测出杯状病毒。

测序结果

Astrovirus

267个阳性样本中的95个被送去测序，其中包括一个具有代表性的子样本，以验证结果，并朝着系统发育分析的方向进行测序。其中91个序列与星状病毒株相似度超过90%。83/91(91.2%)的测序样本与巨兽病毒3型相似度超过90%。在2/91(2.2%)的测序样本中，与星状病毒4型的序列相似度大于97%。在两个样本中，基于blast工具的遗传相似性评估，确定了与星状病毒1型的序列相似性约为95%。95个序列定义了42个单倍型，存入GenBank数据库(Accession Numbers: OK066007-OK066048，附加文件1)，其系统发育关系与从GenBank检索到的单倍型的比较如图所示。3.．此外，这些单倍型的进化关系显示在图的中位连接网络中。4．该网络由一个中心单倍群占据，以星形排列，多个网状连接中心单倍型，可能构成星状病毒株的共同祖先。

诺如病毒和萨波病毒

在36个杯状病毒阳性样本(采用常规RT-PCR方法)中，10个样本在blast工具评估时与某些病毒(sap病毒，Kobuvirus和Sapelovirus)具有相似的序列，最终确定了8个单倍型(见图)。5)．这些序列存入GenBank数据库，并分配了登录号OK086794-OK086801。两个序列与猪萨波病毒GVII和GIII的相似性约为95%。在5个样本中，根据blast搜索检测到的序列与Kobuvirus相似度超过95%。在剩下的3个样本中，2个与Sapelovirus序列非常接近，而一个样本与蝙蝠Astrovirus序列相似度为92%。这些单倍型与从GenBank数据库获得的相应单倍型的系统发育关系如图所示。5，6而且7．未检测到猪诺瓦克病毒序列。

更具体地说，使用BLAST工具比较了测序检测到的两个萨波病毒序列，以便从其他研究中搜索相似的序列。1条皂荚病毒序列(X23AP10, GB acc.;编号OK086800)与猪痘病毒分离物PoSaV_VIRES_NM01_C3多蛋白基因(MK379007，图;5)．本研究检测到的第二个皂荚病毒序列(X13PRO2, GB acc。编号OK086801)与猪肠道萨波病毒株swine/GVII相似度为93%。1/SUI-101/2008/PA/BRA RNA依赖RNA聚合酶基因(KF241967)。

Astrovirus

在本研究中，我们调查了起源于希腊28个不同猪场的5个不同年龄组的1400头猪中星状病毒的存在。引物对PAstVDF-R被选为猪星状病毒的检测，因为它能够同时检测所有5种猪星状病毒类型。如前所述，这些引物针对内部的保守区域ORF1b星状病毒基因组，允许以这种方式检测所有pasv类型。在肖氏等人的研究中。60在两种不同的qRT-PCR检测中，使用了五种不同的TaqMan探针(一种用于探测五种星状病毒类型中的每一种)和引物，一种用于探测星状病毒1型和2型，一种用于探测星状病毒3型、4型和5型。在我们的研究中，采用了不同的方法。利用PAstVDF-PAstVDR引物进行常规和SYBR-Green real - time RT-PCR检测猪星状病毒，并对阳性样品进行测序，以验证结果，确定星状病毒类型、毒株以及毒株的系统发育特征。两种检测PAstV的RT-PCR方法灵敏度相近，SYBR GREEN RT-PCR灵敏度稍高。pasv阳性样品的熔化温度约为85°C(图。2)．

更具体地说，根据常规和SYBR-Green实时RT-PCR结果，我们看到星状病毒广泛分布在希腊养猪场(100%的养猪场对该病毒呈阳性反应)。猪星状病毒在所有五个年龄组中检测到，比例相似，即100%的育婴猪和生长猪，96.4%的乳猪，94.6%的育肥猪和98.2%的母猪。pasv患病率在县与国之间差异很大，在同一国家内的不同研究中差异很大，中国的检出率为2.82% [61]至斯洛伐克(健康猪)的94.4% [62］．就不同年龄组而言，PoAstVs在从乳猪到成年猪的所有年龄的检测频率从0到100%不等[37，55，58，61，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72］．

此外，根据测序结果，星形病毒3型是希腊养猪场的主要星形病毒类型(91.2%)。然而，星状病毒1型和4型的序列也被检测到(图。3.)．基于blast工具的遗传相似性评估和系统发育分析，我们发现从本研究样本中获得的序列与来自意大利(PAstV3)、匈牙利(PAstV2，野猪星状病毒1号)和日本(PAstV4)的PAstV序列具有密切的遗传相似性(图4)。3.)．这很奇怪，因为希腊的养殖动物很少从匈牙利或意大利进口，而且绝对不会从欧盟(如日本)以外的国家进口。因此，可以肯定地排除由这些国家的生猪运输直接传播的可能性。这两个国家的野猪都不会迁徙这么远的距离。但不能排除从其他主要供应国(如法国、德国、丹麦、荷兰)进口的猪没有从原产国携带这种微生物。也不排除动物饲料中大量含有的进口饲料成分(如大豆)在其收集点可能感染此类病毒。例如，大豆主要从美国进口，但也从巴西和中国进口大量大豆。此外，具有许多宿主的病毒预计会表现出低水平的遗传距离，因此可能并不代表真正不同的毒株。由于到目前为止这些微生物与任何疾病的发生没有关联，因此没有对这些微生物进行彻底的调查。遗传同质性和没有通过距离或地理结构进行遗传隔离也与以前对相同病毒的分析相一致，从Genbank数据库检索到的来自不同国家的序列表明存在遗传混合模式。 This pattern of dispersal over large distances and no barriers to gene flow, suggests that the majority of the Astrovirus strains share a common origin, as demonstrated by the haplotype network of Fig.4同样，有几个中心单倍型彼此相连。

在肖等人的[60研究中，pasv4是检测到的主要星状病毒类型(62.3%)，而PAstV3仅在1.2%的样本中检测到(在所有其他pasv类型中比例最低)。秦益峰等人的研究(2019)[73]，以PAstV2型为主(44.4%)，以PAstV3型最少(1.4%)。此外，Zhou et al.的研究(2016)[74]包括来自5个欧洲国家的猪，PAstV4是唯一检测到的PAstV类型。尽管如此，我们的发现与Rawal等人的发现是一致的。[75]，在位于美国的母猪场进行了三项横断面研究，在下游苗圃中有和没有pastv3相关的神经疾病。在这项研究中，根据不同年龄组，PAstV3的检出率非常高，从66%到90%不等(母猪和仔猪的检出率最高)。PAstV3偶尔在猪神经组织中被分子检测到[64，68，70，71，76，77，78然而，该病毒的神经致病作用仍有待澄清。有趣的是，在我们的一些样本中，观察到sapo病毒，Kobuvirus或Sapelovirus混合检测。还应强调的是，由于所有样本都是从无症状动物身上采集的，因此它们没有造成任何生产力下降，而与检测相关的主要风险是，它们可能成为其他动物的中间宿主，而这些病毒对这些动物更有害并引起疾病。特别是，检测这些病毒的临床意义仍然不确定，因为在我们检测的猪种群中没有注意到特定的临床症状。为了确定该病毒的重要性，可能需要进一步调查该病毒的致病性，例如通过挑战性实验室试验来调查对猪的任何有害影响。此后，由于pasv在希腊养猪场的主要存在，建议对该病原体进行系统监测。应该考虑到，PAstV是一种RNA病毒，因此具有很强的突变能力，并且可能出现新的、更致病的毒株，具有人畜共患的可能性。

一般杯状病毒引物p289-p290允许检测由杯状病毒引起的广泛感染。该引物对已用于检测多种动物体内的杯状病毒，如猪、狗、猫、鸡、火鸡以及人类[79，80，81，82，83］．然而，p289-p290缺乏特异性。这意味着所有常规RT-PCR阳性的RT-PCR样本都需要测序，以确认检测到的病毒。在本研究中，常规和SYBR Green RT-PCR分别约有13%和20%的检测池对杯状病毒呈阳性反应。这些结果表明SYBR-Green RT-PCR方法的敏感性有所提高，这与Mauroy等人(2012)的研究结果一致[79］．许多流行病学研究已经证明了萨波病毒在世界范围内的存在，但检出率差异很大，从0.57到62%不等[16，19，26，32，35，37，38］．我们的研究结果表明，在这些阈值范围内的检出率，特别是将萨波病毒在希腊养猪场的流行率大约置于以前报告的平均水平。一般来说，在保育猪中发现的沙波病毒流行率最高[32］．更具体地说，在路透社等人的研究(2010)[32]，对来自6个欧洲国家88个养猪场的1.050个猪粪便样本进行了PoSaV检测。7.6%的样本检测出PoSaV。另一方面，PoSaV检出率在中国最低，在146份1个月大的仔猪腹泻粪便样本中检出了3.42%的病毒[84］．

在我们的样本中未检测到诺如病毒序列。有趣的是，本研究的测序结果显示引物对p289-p290也扩增了杯状病毒科以外的病毒。特别的是，除sapelvirus外，我们还检出了种类广泛的病毒，包括Astrovirus、Kobuvirus和Sapelovirus，其中后两者都是非我们研究的目标微生物。柯布病毒(KoVs)是柯布病毒科、柯布病毒目和柯布病毒属的成员，柯布病毒属是科8属之一。它们是小型、无包膜、圆形、单链阳性RNA病毒，有一个大的开放阅读框，编码单个多蛋白[85］．在柯布病毒属中有三个不同的簇。爱奇病毒A (AiV-A)包括人AiV-1、犬KoV-1和鼠KoV-1。爱奇病毒B (AiV-B)包括牛KoV-1和羊KoV-1。爱奇病毒C型(AiV-C)包括猪kov1型(PKoV/AiV-C) [85］．猪柯布病毒(PKoV)被怀疑是引起仔猪腹泻的原因之一。PKoV已在病猪的粪便中发现，然而，与其他肠道病毒合并感染是常见的，并可能在观察到的临床症状中发挥作用[86］．科夫汽车对人类健康构成危害。它们已从贝类、蛤蜊、牡蛎和地下水中分离出来，并被确定为食源性疾病的原因[87］．没有人畜共患感染的报告;然而，跨物种传播、与多个PKoV毒株合并感染以及病毒重组事件都已被记录在案[85，88］．

猪萨波病毒(PSV)是一种非包膜阳性单链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科萨波病毒属。PSV与肠病毒属的成员关系最密切，以前称为猪肠病毒8 (PEV-8)，分类为猪肠病毒A (PEV-A) [89］．PSV通常导致胃肠道无症状感染[90，91，92，93］．致病性感染可导致多种临床综合征，包括腹泻、呼吸系统疾病、生殖障碍和脊髓灰质炎脑脊髓炎[94，95，96］．

通过blast工具的遗传相似性评估和系统发育分析，我们发现本研究中检测到的Sapovirus序列与巴西和中国的Sapovirus序列具有很大的相似性(图2)。5)．本研究检测到的Kobuvirus序列与比利时、日本、意大利和美国的猪Kobuvirus序列具有密切的遗传关系(图2)。6)，而我们获得的Sapelovirus序列与中国和德国的Sapelovirus A序列具有密切的遗传关系(图。7)．与pasv的情况一样，这些观察结果表明，这些病毒株的基因流动不存在障碍，支持一种遗传混合模式，对此类似的解释也适用于检测与来自这些国家的萨波尔病毒、科布病毒和萨波尔病毒株遗传密切相关的毒株。Kobuvirus和Sapelovirus同属小核糖核酸病毒科。这并不是第一个用p289-p290引物对检测到柯布病毒、萨波病毒和星状病毒的研究。在Gábor路透社等。[97]，在用引物p289-p290检测杯状病毒的猪粪便样本中检出柯布病毒。本研究揭示了在柯布病毒中也存在YGDD氨基酸(反向引物p289设计)的保守3D基序。根据电泳结果，根据扩增子大小可将萨普特病毒和诺如病毒与柯布病毒区分开来。带有p289-p290引物对的萨波病毒扩增子大小为331 bp，诺如病毒扩增子大小为319 bp，柯布病毒扩增子大小为1065 bp。Tibor Farkas等人2012年的研究[82]，小核糖核酸病毒是在鸡和火鸡身上偶然发现的，带有相同的引物对。在Gábor路透社等。[98]，用p289-p290检测猪星状病毒和科布病毒。星形病毒对应的RT-PCR产物大小为720bp。将p289与检测到的星状病毒进行比较，发现存在保守区RdRp萼状病毒YGDD基序氨基酸序列(引物p289的靶点)的突变在星状病毒中也很常见。上述研究结果与我们用引物对p289-p290检测Kobuvirus、Sapelovirus和Astrovirus的研究结果一致。我们的结果也证实了对常规RT-PCR扩增子进行测序的必要性。

就检测到杯状病毒的年龄组而言，我们发现育肥猪是受影响的主要年龄组(基于常规和SYBR Green RT-PCR结果)。

星状病毒、诺瓦克病毒和萨波病毒的分子诊断是非常具有挑战性的，因为这些RNA病毒有很大的遗传变异性。由于这一事实，使用针对病毒保守区域的通用引物是必要的。引物对PAstVDF-R和p289-p290满足这些条件。常规RT-PCR方法与SYBR Green RT-PCR方法的比较表明，SYBR Green RT-PCR方法的灵敏度较高。因此，SYBR Green RT-PCR在这些RNA病毒的常规分子检测中，能够快速、灵敏、特异地进行样品的首次筛选，特别是在病毒载量极低的样品中，可以作为可靠的工具。我们的研究表明，星状病毒在希腊所有年龄的猪中广泛存在，萨波尔病毒主要存在于育肥猪中，科布病毒和萨波尔病毒分别存在于哺乳仔猪和生长猪中。由于这些病毒大多在无症状猪中被检测到，因此需要进行进一步的研究，以调查这些病毒在其他病毒引起的疾病中的作用(在混合感染的情况下)或它们对猪生长性能的贡献。PAstV在希腊猪群中广泛存在，有必要研究其致病性及其监测潜力。应始终牢记，病毒的变异能力以及这些动物与人类的密切接触可能在未来引发人畜共患事件。从目前的研究还可以得出结论，所有检测的病毒在育肥猪中发病率较高。 Further analysis is in progress to see the precise prevalence of the viruses in each age group. To our knowledge, this is the first molecular epidemiological study regarding Astrovirus, Norovirus and Sapovirus in pigs in Greece.

样品收集

据估计，希腊的生猪数量约为130万头，其中约95%的生猪在300个规模超过100头母猪的分娩至育成(FTF)猪场集中养殖。

为了研究的目的，根据猪群的规模(一半比300头母猪小，一半比300头母猪大)，从整个希腊领土(8.0%的希腊农场)随机选择了24个猪群，以获得具有代表性的猪群数据。此外，还对4家母猪少于100头的养殖场进行了抽样调查。

2019年，从希腊各地的不同农场共收集了1400份粪便样本，包括色雷斯地区、马其顿、伊庇鲁斯、色萨利、斯特里亚希腊、伯罗奔尼撒和克里特岛(图2)。1)．从每个农场，我们收集了50份来自五个不同年龄组的猪的粪便样本:乳猪、断奶后(苗圃)、种植猪、育肥猪和母猪。从每个年龄组收集了10个样本(来自10只不同猪圈的不同猪)。使用棉签收集样本，采样后将其置于一次性无菌1.5 ml Eppendorf (EP)管中，并将其转移到实验室中，放入嵌入冰的等温盒中。每个样品重新悬浮在1ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后涡旋5分钟。12.000 g离心10分钟后，每个上清40 μl收集于5个池(总容量200 μl)中，置于新的无菌1.5 ml eppendorf管中，在−80°C保存，直到进一步处理。通过这种方式，从最初的1400个独立样本中创建了280个池。每个样本池包含来自相同年龄组的样本(每个农场每个年龄组2个样本池或每个农场10个样本池)。因此，每个年龄组总共创建了56个池。

RNA提取

按照RNA提取试剂盒“Cador pathogen kit”(Qiagen, Germany)的说明，从每个池样品中提取200 μl的病毒RNA。RNA纯化后，用分光光度计(Eppendorf)测量获得的RNA的数量和纯度。提取的RNA储存在−80°C直到使用(大约两周)。

逆转录PCR (RT-PCR)

Astrovirus

在常规RT-PCR检测猪星状病毒时，使用引物PAstVDF (5 ' -GAAKCRCTSYATGGGAARCTCCT-3 ')和PAstVDR (5 ' - ctttggtcckccccycc3a -3 ') [60］．这些引物针对内部的一个保守区域ORF1b生成183个碱基对(bp)的扩增子。它们能够检测到所有五种pasv类型。常规PCR采用QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒。简单地说，从每个样品中提取4 μl模板RNA，加入10 μl 5 × QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer、2 μl dNTP mix(每个dNTP最终浓度为400 μM)、3 μl引物(最终浓度为0.6 μl)、2 μl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme mix和26 μl RNase free water的混合物中。因此，反应总体积为50 μl。RT-PCR的条件如下:在50°C进行逆转录30 min。然后在95°C进行15 min的初始PCR激活步骤，然后在94°C变性30 s，在60°C退火30 s，在72°C扩展1 min，最后在72°C扩展10 min。

诺如病毒和萨波病毒

使用相同的试剂盒(QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒)和通用杯状病毒引物对p289-p290 (p290: 5 ' -GATTACTCCAAGTGGGACTCCAC-3 ' -p289: 5 ' -TGACAATGTAATCATCACCATA-3 '，在RT-PCR中检测猪粪便样本中的诺如病毒和萨波病毒，[83])，以香港的保育地区为目标RdRp生成一个331 bp的萨波病毒扩增子和318 bp的诺瓦克病毒扩增子。通过这种方式，同时检测到两种病毒。简单地说，从每个聚合的RNA纯化样本中提取4 μl模板RNA，加入含有10 μl 5 × QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer、2 μl dNTP mix(每个dNTP最终浓度为400 μM)、3 μl引物(最终浓度为0.6 μl)、2 μl QIAGEN OneStep RT-PCR酶mix和26 μl RNase游离水的混合物中。反应在以下条件下进行:50°C逆转录30 min, 95°C初始PCR激活步骤15 min，然后94°C 30 s循环40次，50°C 1 min, 72°C 1 min，最后72°C延伸步骤10 min。

两种PCR结果均用溴化乙锭染色，并在1.5%琼脂糖凝胶上进行紫外光电泳观察。

SYBR-Green Real time RT-PCR

Astrovirus

采用与常规RT-PCR相同的引物对(PAstVDF- PAstVDR)进行猪星状病毒的SYBR-Green实时RT-PCR检测。快速基因IC绿色一步混合试剂盒(Nippon Genetics)用于反应。在10 μl 2X FastGene®IC Green One Step mix、1 μl 20X FastGene®Scriptase、浓度为10 μΜ的引物各0.8 μl、RNase游离水6.4 μl的混合物中加入1 μl模板RNA。PCR条件为:45℃10 min, 95℃2 min, 95℃5 s, 60℃1 min，循环40次。在55°C至95°C的分辨率下进行熔体曲线分析，并每5秒测量一次信号采集。

诺如病毒和萨波病毒

引物p289-p290用于猪诺如病毒和萨波病毒的SYBR-Green实时RT-PCR检测。它们在这种方法中的使用如Mauroy等人所述。[79］．为了进行PCR，使用相同的PCR试剂盒(Fast Gene IC Green One - Step Mix, Nippon Genetics)。将1 μl模板RNA加入到10 μl 2X FastGene®IC Green One Step mix、1 μl 20X FastGene®Scriptase、每个引物0.8 μl(终浓度400 nM)和6.4 μl RNase游离水的混合物中。PCR条件为:45℃10 min, 95℃2 min, 95℃5 s, 51℃30 s，循环40次。熔体曲线分析在上述步骤之后进行。

测序

为了通过常规RT-PCR方法验证星状病毒和杯状病毒阳性样本，以及对这些样本进行系统发育分析，随机选择的子样本被送往Eurofins Scientific(卢森堡)进行纯化和测序。对每个PCR产物分两次进行双向Sanger测序，分别使用每个PCR的正向引物和反向引物。获得的序列在MEGA-X软件包中读取、编辑和比对[99］．核苷酸与NCBI基因数据库的相似性是使用MEGABLAST搜索工具评估的高度相似的序列，嵌入在NCBI网站(可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)．新描述的单倍型与相应单倍型的系统发育关系比较，BLAST工具评估的基因密切相关，从GenBank数据库获得，在MEGA-X软件中进行评估。特别是GenBank中与本研究新描述序列相似度超过90%的序列被纳入分析。采用近邻连接分析和极大似然法构建了系统发育树。通过1000次迭代的自举分析计算内部节点的置信度值。特别是对于星状病毒特征序列，进化谱系被额外估计，并在PopART软件中构建的中位连接单倍型网络中描绘[One hundred.］．

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。

PAstV:

猪Astrovirus

PoNoV:

猪诺瓦克病毒

PoSaV:

猪Sapovirus

rt - pcr:

逆转录聚合酶链反应

子:开放:

阅读框

RdRp:

依赖RNA的RNA聚合酶

作者对所有养猪场的业主和员工在取样过程中给予的宝贵帮助表示感谢。

塞萨洛尼基亚里斯多德大学研究委员会资助。

作者及隶属关系

1. 塞萨洛尼基亚里斯多德大学兽医学院，希腊塞萨洛尼基54124

   Efthymia Stamelou, Konstantinos V. Papageorgiou, Evanthia Petridou, Zoe S. polizopo - ulou和Spyridon K. Kritas

2. 西马其顿大学农业科学学院动物科学系，希腊弗洛里纳53100

   扬尼斯·a·巨人

3. 金龙兽医研究所，50250，贝特达甘，以色列

   精神戴维森

4. 希腊塞萨洛尼基亚里斯多德大学健康科学学院医学院微生物实验室，塞萨洛尼基54124

   安娜的爸爸

贡献

ES:取样，数据收集，分子和统计分析，手稿写作。IAG:统计分析，稿件写作。KVP:审稿、解读。EP:审稿，概念化。ID:稿件审稿、编辑、资料收集。ZSP:收集资料，审稿。AP:稿件审稿、解读。研究设计，监督，资金获取。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到扬尼斯·a·巨人．

伦理批准并同意参与

本研究仅收集粪便样本，因此不需要进一步批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有利益竞争。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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